Name: evaluation of zika virus-specific t-cell responses in immunoprivileged organs of infected ifnar1-/- mice
Uploaded: 2018-10-17T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice at JoVE.com

يشكر المؤلفون غاري وونغ لتنقيح اللغة الإنجليزية. وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وبرنامج التنمية في الصين (منحة 2017YFC1200202)، المشاريع الخاصة الرئيسية "بحوث الأمراض الصين المعدية" (منحة 2016ZX10004222-003). جورج ف. قاو محقق رئيسية رائدة في العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين مبتكرة البحث الفريق الوطني (منحة 81621091).

<ol>
	<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Hazin, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computed+Tomographic+Findings+in+Microcephaly+Associated+with+Zika+Virus.">Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+diversified+Zika+viruses+imported+to+China,+2016.">Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016.</a> Protein &amp; Cell. 7 (6), 461-464 (2016).</li><li>Cauchemez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+Zika+virus+and+microcephaly+in+French+Polynesia,+2013-15:+a+retrospective+study.">Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study.</a> The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).</li><li>Turtle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+cell+responses+to+Japanese+encephalitis+virus+in+health+and+disease.">Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).</li><li>Dudley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+macaque+model+of+Asian-lineage+Zika+virus+infection.">A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection.</a> Nature Communications. 7, 12204 (2016).</li><li>Osuna, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+viral+dynamics+and+shedding+in+rhesus+and+cynomolgus+macaques.">Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cell+immunity+against+the+emerging+and+re-emerging+viruses.">Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses.</a> Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cell+Immune+Response+in+Immunocompetent+Mice+during+Zika+Virus+Infection.">CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection.</a> Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).</li><li>Elong Ngono, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+Role+of+the+CD8++T+Cell+Response+During+Primary+Zika+Virus+Infection+in+Mice.">Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).</li><li>Marques, E. T. A., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tradition+and+innovation+in+development+of+a+Zika+vaccine.">Tradition and innovation in development of a Zika vaccine.</a> The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Chimpanzee+Adenovirus+Vaccine+AdC7-M/E+Protects+against+Zika+Virus+Infection+and+Testis+Damage.">Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage.</a> Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).</li><li>Jama, B. P., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+alloantigen-specific+T+cells+from+peripheral+blood.">Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).</li><li>Legoux, F. P., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide:MHC+tetramer-based+enrichment+of+epitope-specific+T+cells.">Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).</li><li>Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Method+for+Isolating+and+Expanding+Invariant+Natural+Killer+T+Cells+from+Mouse+Spleen.">An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).</li><li>Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain.">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).</li><li>Altman, J. o. h. n. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Analysis+of+Antigen-Specific+T+Lymphocytes.">Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+murine+CTL+by+a+hepatitis+B+virus-specific+peptide+and+evaluation+of+the+adjuvant+effect+of+heat+shock+protein+glycoprotein+96+and+its+terminal+fragments.">Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments.</a> J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).</li><li>Valkenburg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preemptive+priming+readily+overcomes+structure-based+mechanisms+of+virus+escape.">Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).</li><li>Shang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor-initiated+testicular+innate+immune+responses+in+mouse+Leydig+cells.">Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells.</a> Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+identification+of+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus-specific+CTL+epitopes.">Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes.</a> The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).</li><li>Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+in+semen:+effect+on+human+reproduction.">Zika virus infection in semen: effect on human reproduction.</a> The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Causes+Testis+Damage+and+Leads+to+Male+Infertility+in+Mice.">Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice.</a> Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).</li><li>Li, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates.">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.

مكسبه تي خلية حانمه تلعب دوراً هاما في الخلوية الحصانة ضد العوامل الممرضة23. وهكذا، الكشف عن خلايا تي زيكف على حدة في أجهزة إيمونوبريفيليجيد منهجية حاسمة لفهم الاستجابات تي خلية مكافحة العدوى زيكف الطبيعية. وفي الوقت نفسه، الكشف عن استجابة خلايا T أداة ممتازة للتحقيق في مدى فعالية اللقاحات الفيروسية. وهنا نعرض بروتوكول شامل لتصور هذه التجارب، التي تشمل عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والدماغ، والخصيتين من الفئران المصابة زيكف، إعداد تيترامير294-302 حانمه ه إيمونودومينانت، الاعتراف CD8 الخاصة زيكف+ تي الخلايا في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف.
وأظهرت دراسة سابقة أنه يمكن الكشف عن زيكف العيش أو الحمض النووي الريبي في السائل المنوي المرضى الذكور، مما يشير إلى أن زيكف يمكن تجاوز حاجز الدم-الخصية وينسخ نفسه في الجهاز التناسلي24. سابقا، كما أظهرت أن زيكف يمكن أن يسبب تلف الخصيتين ويؤدي إلى العقم عند الذكور في الفئران25. يمكن أن تؤدي الإصابة زيكف إلى فريميا في القرود ريسوس، ويمكن الكشف عن الجيش الملكي النيبالي الفيروسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وكذلك في أجهزة الحشوي. وكشف إيمونوهيستوتشيميستري أن المستضدات الخاصة زيكف وعرضت في الجهاز العصبي المركزي و الأجهزة الطرفية متعددة26. أيضا، في نماذج مورين، يمكن حمل العدوى زيكف CD8 المضادة للفيروسات قوية+ استجابة خلايا T في الطحال والجهاز العصبي المركزي26.
مقارنة بالأعمال السابقة، تحدد هذه الدراسة أساليب منهجية للكشف عن CD8 الخاصة زيكف+ تي خلية الردود في المخ والخصيتين، ومواقع إيمونوبريفيليجيد. من المهم تقييم الأداء الوظيفي للخلايا التائية الخاصة بالفيروسات في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف. استخدام تيتراميرس للكشف عن CD8 الخاصة زيكف+ تي خلية الردود في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من شأنه أن يعزز فهمنا للالتهابات زيكف وعلى الاستجابات المناعية المضيف. استخدام تيترامير294-302 ه، يمكن عزل خلايا تي الخاصة بفيروس في المخ والخصية بالتدفق الخلوي، للتحقيق الخلوية آليات الحماية وإيمونوباثوجينيسيس أثناء مرض زيكف. وفي الوقت نفسه، أنه من المفيد للباحثين مواصلة التحقيق مهام CD8+ تي الخلايا للتحكم في زيكف، أو لتحسين إيمونوباثوجينيسيس في هذه الأجهزة أثناء الإصابة زيكف.
لتحليل CD8 مورين حدة مستضد+ تي خلية الردود في أجهزة إيمونوبريفيليجيد، أعد 2D حبتيترامير294-302 -E والكشف عن CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي. Tetramers أداة قوية للكشف عن خلايا محددة مستضد تي. هنا، تم إنشاء ثلاثة أنواع من ستريبتافيدين fluorochrome مترافق (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421). على الرغم من أن هناك لا توجد فروق معتد بها إحصائيا في آسيا والمحيط الهادئ-BV421-، و tetramers المسمى PE للكشف عن خلايا تي محددة مستضد، المسمى PE الرهن العقاري--أنا tetramers تسفر عن نتائج أفضل. ومن ثم، تم استخدام تيترامير المسمى PE طوال هذه الدراسة. من المثير للاهتمام، استناداً إلى تيترامير294-302 -E 2D ح PE المسمىب، اكتشفنا نسب عالية من خلايا تي حدة مستضد في المخ والخصيتين، مما يشير إلى قدرة الخلايا T الخاصة بالفيروس من الدم للهجرة أجهزة إيمونوبريفيليجيد.
ومع ذلك، توجد بعض القيود على البروتوكول. تيترامير294-302 -E 2D حبلأنه غير مفيد للبشرية تي خلية الكشف، كشف تيترامير مرهون بتقييد MHC. يزال يلزم فحص الببتيدات المقيدة-هلا إيمونودومينانت. إلى جانب ذلك، عدوى الرجعية-المداري فعال لعدوى زيكف ولكن قد لا تكون عملية ملائمة لبعض المحققين. وهكذا، وطرق أخرى للعدوى، بما في ذلك البريتوني، أو تحت الجلد، أو عن طريق الحقن الوريدي، يوصي أيضا.
في البروتوكول هو موضح هنا، هو خطوة حاسمة عزلة وحيدات من الدماغ والخصية. من المهم الحصول على الخلايا الليمفاوية عالية الجودة؛ وبالتالي، من المهم إيلاء الاهتمام إلى، على سبيل المثال، سرعة الطرد المركزي، قوة الأنسجة الطحن، وتشريح أنسجة المخ والخصية. وإلى جانب ذلك، لإعداد تيترامير, مثبطات البروتياز (بمسف، بيبستاتين، ليوبيبتين) مفيدة عند حماية بروتين من تتعرض للتدهور. ولذلك، فمن المنطقي لإضافة مثبط البروتياز إلى المخزن المؤقت ريفولدينج وتبادل المخزن المؤقت أثناء عملية إعداد تيترامير.
وفي الختام، فإننا نقدم أساليب الكشف عن استجابات تي خلية محددة مستضد في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج الماوس لعدوى زيكف. يمكن تطبيق هذا المنهاج على نطاق واسع للتحقيق في آليات محصنة والناشئة من جديد الفيروسات التي يمكن تجاوز الحواجز بين الدم وأجهزة إيمونوبريفيليجيد. وعلاوة على ذلك، هذه الدراسة قد تمهد الطريق للتنمية المستقبلية للقاحات المرشحة وإيمونوثيرابيس.

زيكف هو مصفر المنقولة بالبعوض التي كانت معزولة أولاً في عام 1947 في أوغندا من المكاك الريسوسي حموية. في الآونة الأخيرة، أصبح زيكف حالة طوارئ صحة العامة، بسبب نشرها السريع في الأمريكتين وعلاقته غير متوقع لصغر الرأس ومتلازمة غيلان-باريه متلازمة1،،من23. من البيانات الوبائية، يشتبه في زيكف أن يكون سبب متلازمة غيلان-باريه في حوالي 1 في 4,000 إصابة البالغين4. وعلاوة على ذلك، وجود ارتباط بين زيكف والخصيتين العدوى/الضرر في طراز الماوس قد ثبت، مما يوحي بأن العدوى زيكف، تحت ظروف معينة، يمكن تجاوز حاجز الدم-الخصية ويؤدي في النهاية إلى العقم عند الذكور5 . هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية فهم تماما تنظيم دورات تعريفية للاستجابات المناعية الواقية أو باثولوجي أثناء مرض زيكف.
الكثير مما يمكن تعلمه عن الاستجابات المناعية الخلوية زيكف. خلايا CD4+ و CD8+ تي خلية الردود قفيصه والمغلف، والبروتين نونستروكتورال 1 (NS1) قد لوحظت في إصابة زيكف القردة والبشر6،،من78. في الفئران، أشارت عدة دراسات إلى أن CD8+ تي الخلايا دوراً حمائياً في مراقبة النسخ المتماثل زيكف9،،من1011. الأهم من ذلك، أثبتت خورادو et al. أن عدوى زيكف يؤدي إلى انهيار حاجز الدم في الدماغ وارتشاح تسلل CD8+ خلايا المستجيب تي داخل الخصيتين Ifnar1--/-- الفئران. وعلاوة على ذلك، أنها أظهرت أن CD8+ تي الخلايا تحرض الشلل المرتبطة زيكف ويبدو أن تلعب دوراً في إيمونوباثولوجي الدماغ الولدان. في دراسة سابقة، أعد تيترامير294-302 ه زيكف، وأظهرت أن CD8 زيكف الخاصة+ تي خلايا موجودة في العقول والحبال الشوكي لفئران مصابة زيكف Ifnar1-/- ، التي قد يكون لها آثار هامة على التصميم وتطوير اللقاحات زيكف10.
في استجابة للحاجة الملحة للتطعيم الوقاية من الإصابة زيكف، عدة لقاحات في المراحل الإكلينيكية للتنمية، بما في ذلك اللقاحات واللقاحات المؤتلف متجهة البروتين المنقي فرعية للقاحات الحمض النووي الريبي. لقاح بلازميد الحمض النووي في مرحلة التجارب السريرية 112. تقييم سلامة وفعالية اللقاحات زيكف، لذلك، المهم. ميزة واحدة من اللقاحات هي قدرتها على الحصول على ردود تي خلية محددة، التي قد تكون هامة للحماية زيكف. يمكن الكشف عن إيممونوريكتيفيتي تي خلية الناجم عن لقاح زيكف إتش-vector-تعتمد باستخدام المشتقة من زيكف تي خلية المتصلة حانمه tetramers، في الفئران تحصينا، وعرضت glycoproteins م وه لحمل قوية محددة مستضد CD8+ تي خلية إيمونوريكتيفيتي13.
أثناء الإصابة بعدوى فيروس، الاعتراف المستضدات الببتيد المقدمة من الجزيئات (MHC) المعقدة هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية لمستقبلات خلايا تي (تكر) إليه هامة لحماية المضيف14خلية توسطت T. وبناء على هذه النظرية، تيترامير التكنولوجيا هي أداة فريدة توضيح الأدوار التي تؤديها خلايا تي مستضد محددة في تنظيم الاستجابات المناعية15. ويصف هذا البروتوكول إنشاء Ifnar1-/- طراز الماوس للالتهابات زيكف، والكشف عن خلايا تي رد الفعل في الطحال والدماغ، والخصيتين للفئران باستخدام تكنولوجيا تيترامير. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تيترامير294-302 ه زيكف لاكتشاف وتقييم إيمونوريكتيفيتي تي خلية الناجم عن لقاح زيكف (AdC7-M/E) في الفئران المحصنين. هذه الدراسة توفر التوجيه للتحقيق في الردود تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد ويوفر مرجعاً للتطبيقات المحتملة في مخ الجنين أو المشيمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1007px;" width="1006">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Z6</td>
			<td style="width:131px;">our lab</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:475px;">Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD3</td>
			<td style="width:131px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:185px;">sc-1127; RRID: AB_631128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)</td>
			<td style="width:131px;">ZSGB-BIO</td>
			<td style="width:185px;">ZF-0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated</td>
			<td style="width:131px;">CWBIO</td>
			<td style="width:185px;">CW0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">17A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">APC anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PerCP anti-mouse CD8a</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:185px;">P8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:131px;">Ameresco</td>
			<td style="width:185px;">0754-5G</td>
			<td>Toxic and corrosive reagent. 
			Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">S4762-FZ</td>
			<td>Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and&#160; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:185px;">P4265-5MG</td>
			<td>5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:185px;">L8511</td>
			<td>5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at - 20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Scilight-peptide</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Must be resuspended in DMSO and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:131px;">Hyclone</td>
			<td style="width:185px;">SH30809.01</td>
			<td>Must be stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">MP</td>
			<td style="width:185px;">219605590</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">APC-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554067</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554060</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PE-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554061</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BV421-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">563259</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:185px;">26614</td>
			<td>Must be stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainers</td>
			<td style="width:131px;">BF</td>
			<td style="width:185px;">BF10-5040</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amicon Ultra 100kDa</td>
			<td style="width:131px;">Millipore</td>
			<td style="width:185px;">UFC510024</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Cantol</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td style="width:131px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:185px;">28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AKTA PURE</td>
			<td style="width:131px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">red blood cell lysis buffer</td>
			<td style="width:131px;">Solarbio</td>
			<td style="width:185px;">R1010</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zika virus-specific t-cell responses in immunoprivileged organs of infected ifnar1-/- mice

يمكن حمل الفيروس Zika (زيكف) التهاب في إيمونوبريفيليجيد الأجهزة (مثلالدماغ والخصية)، مما يؤدي إلى متلازمة غيلان-باريه وإلحاق أضرار بالخصيتين. خلال عدوى مع زيكف، أظهرت الخلايا المناعية التسلل إلى داخل الأنسجة. ومع ذلك، الآليات الخلوية التي تقوم بتعريف الحماية و/أو إيمونوباثوجينيسيس من هذه الخلايا المناعية أثناء مرض زيكف لا تزال مجهولة إلى حد بعيد. هنا، يمكننا وصف أساليب تقييم الوظائف تي خلية خاصة بالفيروس في هذه الأجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف. وتشمل هذه الأساليب) العدوى زيكف ولقاحات التطعيم في الفئران-/- Ifnar1؛ ب) الأنسجة، الفلورة وفحوصات إيمونوهيستوتشيميستري للكشف عن الإصابة بالفيروسات والتهاب في المخ والخصيتين، والطحال؛ ج) إعداد تيترامير المستمدة من زيكف تي خلية [ابيتوبس]؛ د) الكشف عن خلايا تي زيكف على حدة في وحيدات المعزولة من المخ والخصيتين، والطحال. استخدام هذه النهج، فمن الممكن للكشف عن الخلايا T مستضد الخاصة التي تسللوا إلى أجهزة إيمونوبريفيليجيد وتقييم وظائف هذه الخلايا T خلال العدوى: حماية الحصانة المحتملة عن طريق إزالة الفيروسات و إيمونوباثوجينيسيس/أو إلى تفاقم الالتهاب. هذه النتائج قد يساعد أيضا على توضيح مساهمة خلايا تي الناجمة عن التطعيم ضد زيكف.

وأثر هذه الأساليب، قمنا بتطوير نموذج مورين لالتهابات زيكف. Ifnar1--/-- الفئران في 6-8 أسابيع من العمر أصيبوا بالوحدات المكونة لتركيز 1 × 104 (فو) زيكف بالحقن ريتروربيتال. الأعراض المرضية والعلامات (الشكل 1أ)، فضلا عن تغييرات الوزن (الشكل 1ب)، لوحظت في Ifnar1--/-- الفئران بعد عدوى زيكف. وأظهرت أدمغة مورين ذمة واضحة والاحتقان (الشكل 1ج). ومن ناحية أخرى، وتقلص الخصيتين تدريجيا (الشكل 1د). وعلاوة على ذلك، تم العثور على التغيرات الباثولوجية وتدمير الأنسجة في المخ والخصيتين (الشكل 2أ). أجرينا مقايسة الفلورة للكشف عن زيكف في المخ والخصيتين (الشكل 2ب). تم الكشف عن ارتفاع الأحمال الفيروسية في المخ والخصية قبل إيمونوستاينينج (الشكل 2ب). أظهر Immunohistochemistry تسلل قوي CD3+ تي الخلايا في الدماغ الفئران بعد الإصابة مع زيكف (الشكل 2-ج).
نحن على استعداد لكشف وتقييم الاستجابات الخاصة زيكف تي خلية، ماوس MHC--أنا ح-2Dبتيترامير294-302 -E. الببتيد ه294-302 يمكن أن تساعد ريناتوريب ح-2D بشكل صحيح وتسفر عن كمية عالية من MHC القابلة للذوبان-الأول (الشكل 3أ). في مقايسة التحول، يمكن ملاحظة كفاءة عالية في بيوتينيليشن (الشكل 3ب). في وقت لاحق، ثلاثة streptavidin الفلورية (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421)-معلم الرهن العقاري--أنا أنتجت تيتراميرس للكشف عن خلايا محددة زيكف تي (الشكل 3ج). كان تيترامير المسمى PE كفاءة أعلى للكشف عن CD8 محددة+ تي الخلية مقارنة آسيا والمحيط الهادئ والمسمى BV421 تيتراميرس، على الرغم من أن الاختلاف لم يكن معتدا به إحصائيا.
استخدام تيترامير294-302 ه، اكتشفنا لمفاوية T زيكف على حدة في طحال الفئران المصابة بالتدفق الخلوي في تلقيح ما بعد 7 د زيكف (3.49 ± 0.45 في المائة). أيضا، مشابهة للطريقة الموضحة في القسم 3 من هذا البروتوكول، مع 4 أسابيع بعد التحصين لقاح AdC7-M/E، لمفاوية T زيكف محددة، تم الكشف عن الطحال (6.89 ± 1.36%) (الشكل 4).
وعلاوة على ذلك، أننا نكتشف لمفاوية تسللت إلى أجهزة إيمونوبريفيليجيد، مثل المخ والخصيتين، بعد الإصابة زيكف. تم تعيين البوابات لتحديد ل CD3+CD8+ تي الخلايا في مجموع الخلايا الليمفاوية المخ والخصيتين. يمكن أن يتم الكشف عن نسبة عالية من الخلايا T تيترامير محددة294-302 ه في الدماغ (42.2 في المائة في CD3+CD8+ تي الخلايا) وفي الخصية (26.4 في المائة في CD3+CD8+ تي الخلايا) الخلايا الليمفاوية (الشكل 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig1.jpg"> الشكل 1 : وصف للعدوى زيكف في الفئران-/- Ifnar1- Ifnar1--/-- الفئران في 6-8 أسابيع من العمر أصيبوا بالوحدات المكونة للتركيز4 10 (فو) زيكف بالحقن ريتروربيتال، واستخدمت الفئران حقن مع برنامج تلفزيوني كعناصر تحكم غير مصاب. وتم رصد مورفولوجيا (A) وتغييرات الوزن (ب) للمصابين Ifnar1--/-- الفئران. وتبين الأسهم الحمراء Ifnar1--/-- الفئران عرض مع ميلوباراليسيس وموتور خزل سفلي بعد الإصابة. كانت تحصد العقول (ج) في 7 د بعد التطعيم والخصيتين (د) 0، 7، 14، والتلقيح بعد 30 يوما. تظهر الصور التمثيلية للمخ والخصيتين من الفئران مع مسطرة للإشارة إلى الأحجام. تمثل أشرطة الخطأ يعني ± sem. n = 10 الفئران كل مجموعة لكل تجربة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig2.jpg"> الشكل 2 : الكشف عن زيكف والخلايا الليمفاوية في المخ والخصية في الفئران المصابة زيكف Ifnar1--/-- - (أ) هذا الفريق يظهر التغيرات التشريحية المرضية في الدماغ والخصيتين من الفئران المصابة زيكف مقارنة مع عناصر سلبية في د 7 بعد التطعيم. شريط المقياس = 25 ميكرومتر (اللوحة اليسرى) و 50 ميكرون (اللوحة اليمنى). وأجرى المقايسة (ب) الفلورة مع جسم Z6 مكافحة--زيكف (أخضر). وجمعت جميع عينات الأنسجة من الفئران المصابة زيكف في د 7 بعد التطعيم. كانت الملون الأنوية مع DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) يظهر Immunohistochemistry تسلل قوي CD3+ تي الخلايا في الدماغ والخصية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر (اللوحة اليسرى) و 50 ميكرون (اللوحة اليمنى). الأرجواني يشير إلى الهيماتوكسيلين، براون يمثل جسم CD3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig3.jpg"> الشكل 3 : إعداد للرهن العقاري الخاصة زيكف--أنا تيتراميرس- (أ) ربط ه294-302 في 2D حب هو توضيح من في المختبر ريفولدينج. اللون الأزرق يشير إلى البروتين294-302 -E في 2D حب. اللون البرتقالي يمثل عنصر سلبي دون الببتيد. (ب) هذا الفريق يظهر الإنزيم التحول294-302 -E في 2D حب. (ج) موك يمثل عنصر تحكم برنامج تلفزيوني. ثلاثة ستريبتافيدين الفلورية (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421)-معلم الرهن العقاري--أنا استخدمت تيتراميرس للكشف عن خلايا محددة زيكف تي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig4.jpg"> الشكل 4 : تدفق سيتوميتريك تحليل CD8 الخاصة بالفيروسات + خلايا تي في طحال الفئران المصابة زيكف وتحصين اللقاح. Ifnar1--/-- الفئران في 6-8 أسابيع عمر مصابون أما بالوحدات المكونة للتركيز4 10 (فو) من زيكف أو تلقي جرعة واحدة من 4 × 1010 الجسيمات الفيروسية AdC7-M/E أو برنامج تلفزيوني كعنصر سلبي. بعد 7 أيام بعد العدوى أو التحصين بعد 4 أسابيع، كانت تحصد سبلينوسيتيس الماوس وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. تظهر البيانات كما أجرى ± يعني التحليل الإحصائي التنمية المستدامة. استخدام ANOVA أحادي الاتجاه (لا يعتد: P > 0.05؛ *ف < 0.05؛ * *ف < 0.01؛ * * *ف < 0.001؛ * * *ف < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig5.jpg"> الشكل 5 : النابضة النتائج الاستراتيجية والممثل من CD8 الخاصة بفيروس+ تي الخلايا في المخ والخصيتين من الفئران المصابة زيكف. تظهر قطع تمثيلية لمفاوية تسلل في (أ) الدماغ و (ب) الخصية. يتم تعيين سلسلة بوابات لتحديد اللمفاوية مبعثر+ و CD3+ الأحداث. من هؤلاء، CD8+ الأحداث هي بوابة لتحليل خلايا تي حانمه على حدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice at JoVE.com

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

ويرد وصف بروتوكول لتقييم استجابات محددة مستضد تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج مورين لعدوى فيروس (زيكف) زكى. هذا الأسلوب هو محوري للتحقيق في آليات حماية الخلايا وإيمونوباثوجينيسيس من اللقاحات زيكف وهو أيضا قيمة لتقييم فعالية.

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

أثناء عدوى فيروس زيكا، يمكن للخلايا التائية اختراق الأعضاء المناعية للقضاء على الفيروس ولكنها قد تساهم أيضًا في الإصابة بالمناعة، مثل متلازمة غيلان باريه أو إصابة الخصية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل الكشف القائم على رباعيات الحساسية للخلايا التائية الخاصة بمضادات المضادات في الأعضاء المحرومة من المناعة، سواء أثناء عدوى فيروس زيكا أو بعد التطعيم باللقاحات. في هذا النموذج، بدأت عدوى فيروس زيكا في فئران خروج المغلوب مستقبلات ألفا/بيتا، مما يسمح بتتبع الخلايا التائية الخاصة بفيروس زيكا في الدماغ والخصيتين والطحال.باستخدام نهج التلطيخ رباعية المامر، من الممكن التحقيق في خصائص فقط من الجهاز المناعي الذي يتسلل الخلايا التائية لفيروس زيكا لاستكشاف مساهمات الخلايا التائية في الخلايا المناعية والخلايا المناعية. بالنسبة للعدوى بفيروس زيكا، قم بتسليم 10 مرات لوحدات التركيز الأربع من فيروس زيكا في 100 ميكرولتر من PBS عن طريق التطعيم المداري الرجعي إلى فئران خروج المغلوب من مستقبلات الإنترفيرون ألفا/بيتا التي تبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع. ثم، مراقبة الوزن والعلامات السريرية للحيوانات المصابة يوميا لمدة 15 يوما.سبعة أيام بعد التلقيح، وتأمين الحيوان المصاب في موقف سوبين على رغوة جراحية، واستخدام مشرط معقمة لجعل شق الجلد على طول خط الوسط من البطن. استخدم المقص لفتح عضلات البطن، واستخراج الكبد بلطف. ثم، وإزالة الطحال، وشطف الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لإزالة الدم.بعد الغسيل الأخير، ضع الطحال على 1.5 ملليلتر من الجليد البارد في الـ RPMI على الجليد حتى يتم جمع جميع الطحالات. لتوليد تعليق خلية واحدة، ووضع الطحال في معقم، 40 ميكرومتر شبكة مصفاة الخلايا على رأس أنبوب 50 ملليلتر، وإضافة ملليلتر من الجليد الباردة RPMI المتوسطة تستكمل مع مصل البقر الجنين 10٪، أو FBS، إلى مصفاة. ثم، استخدام المكبس من حقنة خمسة ملليلتر لmacerate الأنسجة من خلال مرشح، وذلك باستخدام المتوسطة الطازجة لطرد الخلايا المفرج عنها من خلال شبكة.نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمس ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة. بعد خمس إلى ست دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف التحلل مع 10 ملليلتر من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS للطرد المركزي الثاني، وإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من المتوسط الكامل للعد. سبعة أيام بعد التطعيم، وشل حركة القتل الرحيم، المصابة، والفأر الذكور في موقف عرضة على لوحة القطع، وتأمين فروة الرأس مع ملقط مستقيم واحد في اثنين من الأسنان.استخدم مقص القزحية لإجراء شق في منتصف الطريق على فروة الرأس ، مما يعرض الجمجمة ، واستخدم ملاقط حادة لتضييق جانبي المدارين مع ملاقط حادة ، وتحديد الدماغ. وضع طرف واحد من مقص القزحية الحادة في ماغنوم السفح، وقطعاً بشكل جانبي إلى الجمجمة على كل جانب. قطع بعناية من نفس تجويف خط الوسط، نحو الأنف، والحفاظ على نصائح مقص سطحية قدر الإمكان لتجنب إصابة الدماغ.ارفع الدماغ باستخدام ملقط، واستخدم مقص القزحية الحاد لتشريح الألياف العصبية القحفية بعناية. ثم، استخدام ملقط لنقل الدماغ إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS. لعزل الخصية ، ارفع جلد البطن بالملقط ، واستخدم مقص القزحية لإجراء شق طولي من خلال الجدار البطني والبطن وفضح الجزء السفلي من البطن.ادفع الخصيتين حتى الشق، واستخدم ملاقط لسحب طبقة الدهون برفق، لفضح الخصيتين الزُنية على كلا الجانبين. استخدام مقص القزحية لتشريح بعناية طبقة الدهون وepdidymis، ونقل الخصيتين إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS. لتوليد تعليق من خلية واحدة من أي من الأنسجة المحصودة، ضع العضو على مصفاة خلية معقمة مع شبكة 100 ميكرون فوق أنبوب 50 ملليلتر، وإضافة ملليلترين من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS إلى المصفاة.باستخدام المكبس من حقنة خمسة ملليلتر ، هرس الأنسجة ، وغسل الفلتر مع المتوسطة الطازجة حتى تم الجهاز الأرض تماما من خلال شبكة. نقل تعليق وحيد الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من 30٪ كثافة المتوسطة الانحدار. طبقة بعناية حل الخلية على مليلترين من 70٪ كثافة المتوسط التدرج في أنبوب جديد 15 ملليلتر، وفصل الخلايا حسب كثافة الطرد المركزي الانحدار.ثم, نقل الخلايا من interphase بين التدرجات كثافة اثنين إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر التي تحتوي على 10 ملليلتر من 10 10 milliliters من 10 10 المليلتر من 10 10 ملليمترات من 10 10 المدى البارد من المدى المنخفض 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 لتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق، قم بتخفيف الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الست لكل 100 ميكرولتر في تركيز المخزن المؤقت FACS، واحتضان عينات الخلايا مع 10 ميكرولترات من مضادة مضادة للماوس CD16/CD32 حظر الأجسام المضادة لكل عينة. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 20 ميكرولترات من الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار من 96 بئرا، لوحة مستديرة القاع وفقا لبروتوكول التلط الحراري التدفقي، وإضافة 20 ميكرولترات من مزيج رباعيات البروتين E إلى كل بئر لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.في نهاية الحضانة، إضافة الأجسام المضادة سطح الخلية من الفائدة إلى الخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولترات من مخزن FACS لكل غسل، ونظف الخلايا بعناية في كل بئر مع 200 ميكرولترات من عازلة FACS الطازجة. ثم، تخزين العينات في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء، حتى تحليلها على مقياس تدفق.وُحظت أعراض وعلامات مرضية مثل النخاع الكلوي و paraparesis الحركية في مستقبلات الإنترفيرون ألفا/ بيتا 1 فئران بالضربة القاضية سبعة أيام بعد التطعيم مع فيروس زيكا. تم رصد التغيرات في الوزن في مستقبلات الإنترفيرون ألفا / بيتا المصابة 1 الحيوانات بالضربة القاضية لمدة 15 يوما، مع فقدان الوزن لوحظ لأول مرة بعد أربعة أيام من العدوى واستعادة الوزن ابتداء من اليوم السابع بعد العدوى. تكشف الصور التمثيلية لأدمغة المورين المصابة عن وذمة واضحة وفرط الدم لمدة سبعة أيام بعد التطعيم بفيروس زيكا.تظهر الصور التمثيلية للخصيتان المصابة بـ murine Zika تقلصًا تدريجيًا من اليوم السابع إلى 30 يومًا بعد العدوى. كما يوضح التحليل النسيجي للدماغ المصاب بزيكا وأقسام أنسجة الخصية تأثير التغيرات المرضية المدمرة مقارنة بالضوابط غير المصابة. وكما هو متوقع من التحليلات الكلية والهوسولوجية، يتم أيضاً الكشف عن الأحمال الفيروسية العالية في الدماغ وخصي الفئران المصابة بفيروس زيكا عن طريق الكبت المناعي.ويرافق ذلك تسلل قوي لخلايا T-T إيجابية من CD3 إلى عدوى الدماغ بعد زيكا. يتم الكشف عن الخلايا الليمفاوية T T المصابة بفيروس زيكا واللقاحات التي تم تطعيمها باللقاحات بواسطة تلطيخ رباعي البروتين الإلكتروني. كما يمكن اكتشاف خلايا T إيجابية CD8-CD-1 في الدماغ، وهي تُختبر سبعة أيام بعد التلقيح بفيروس زيكا.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في دراسة توصيف الخلايا التائبية الخاصة بعوامل الأمراض في الأعضاء ذات المناعته المناعية أثناء العدوى الطبيعية في النماذج الحيوانية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضا على الأجهزة الأخرى التي تنتشر في المناعة، مثل المشيمة أو العين، وكذلك على كل من العدوى الفيروسية والسرطان. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام رباعيات MHC-I للكشف المناعي الكيميائي أو المناعي من الخلايا التائية للأمراض للوصول إلى توزيع خلايا التائية المخ أو الخصيتين المتسللة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

وصف الاستجابات ايستب الغلوبولين المناعي تعتمد على الغدة الصعترية، والغدة الصعترية مستقلة في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

محسن انترفيرون-غاما السبت المقايسة لاستجابات الخلية تي التدبير في نموذج خنزير غينيا بعد التطعيم

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...