जीका वायरस संक्रमण के दौरान, टी कोशिकाएं वायरस उन्मूलन के लिए इम्यूनोप्रिजाइनेस के अंगों में घुसपैठ कर सकती हैं, लेकिन गिलेन-बार्रे सिंड्रोम या टेस्ट चोट जैसे इम्यूनोपैथोजेनेसिस में भी योगदान दे सकती हैं । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह जीका वायरस संक्रमण के दौरान और वैक्सीन प्रतिरक्षण के बाद इम्यूनोप्रिजाइज्ड अंगों में एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का टेट्रामर आधारित पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है । इस मॉडल में, जीका वायरस संक्रमण इंटरफेरॉन अल्फा/बीटा रिसेप्टर नॉकआउट चूहों में शुरू किया जाता है, जिससे मस्तिष्क, टेस्ट और तिल्ली में जीका वायरस-विशिष्ट टी कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है ।
एक टेट्रामर धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग करना, इम्यूनोप्रोटेक्शन और इम्यूनोपैथोजेनिक कोशिकाओं के लिए टी-सेल योगदान का पता लगाने के लिए जीका वायरस-विशिष्ट टी कोशिकाओं में घुसपैठ करने वाले इम्यूनोप्रभिविष्कार अंग की सिर्फ विशेषताओं की जांच करना संभव है। जीका वायरस संक्रमण के लिए, छह से आठ सप्ताह पुराने इंटरफेरॉन अल्फा/बीटा रिसेप्टर नॉकआउट चूहों में रेट्रो-ऑर्बिटल टीका के माध्यम से पीबीएस के १०० माइक्रोलीटर में जीका वायरस की चार फोकस बनाने वाली इकाइयों को एक बार 10 डिलीवर करें । फिर, संक्रमित जानवरों के वजन और नैदानिक संकेतों की 15 दिनों तक दैनिक निगरानी करें।
टीका लगने के सात दिन बाद, संक्रमित जानवर को सर्जिकल फोम पर रीढ़ की स्थिति में सुरक्षित करें, और पेट के मिडलाइन के साथ त्वचा का चीरा लगाने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें। पेट की मांसपेशियों को खोलने के लिए कैंची का प्रयोग करें, और धीरे से जिगर निकालें। फिर, तिल्ली को हटा दें, और रक्त को निकालने के लिए पीबीएस में तीन बार ऊतक कुल्ला करें।
अंतिम धोने के बाद, बर्फ पर बर्फ के १.५ मिलीलीटर ठंडे RPMI माध्यम पर तिल्ली जगह जब तक तिल्ली के सभी एकत्र किया गया है । एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए, एक बाँझ, 40-माइक्रोमीटर जाल सेल छलनी में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर स्प्लेन रखें, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, या एफबीएस के साथ पूरक बर्फ-ठंडे आरपीएमआई माध्यम के दो मिलीलीटर को छलनी में जोड़ें। फिर, जाल के माध्यम से जारी कोशिकाओं को फ्लश करने के लिए ताजा माध्यम का उपयोग करके, फिल्टर के माध्यम से ऊतक को मैकरेट करने के लिए पांच मिलीलीटर सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करें।
एकल कोशिका निलंबन को अपकेंद्रित्र के लिए 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें, और लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। कमरे के तापमान पर पांच से छह मिनट के बाद, एक दूसरे अपकेंद्रित्र के लिए बर्फ ठंडा RPMI प्लस FBS के 10 मिलीलीटर के साथ lysis बंद करो, और गिनती के लिए पूरा माध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली फिर से खर्च । टीका लगाने के सात दिन बाद, एक काटने के बोर्ड पर प्रवण स्थिति में एक इच्छामृत्यु, संक्रमित, पुरुष माउस को स्थिर करें, और सीधे एक-दो दांतों के संदंश के साथ खोपड़ी को सुरक्षित करें।
खोपड़ी पर मिडलाइन चीरा बनाने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें, खोपड़ी को उजागर करें, और मस्तिष्क को ठीक करते हुए, तेज चिमटी के साथ कक्षाओं के दोनों किनारों को दबाने के लिए तेज चिमटी का उपयोग करें। फोरमेन मैग्नम में तेज आईरिस कैंची की एक टिप रखें, प्रत्येक तरफ खोपड़ी में पार्श्व रूप से काटें। ध्यान से मध्य रेखा ऊपर एक ही गुहा से कटौती, नाक की ओर, मस्तिष्क को घायल करने से बचने के लिए संभव के रूप में सतही के रूप में कैंची युक्तियों रखते हुए ।
संदंश के साथ मस्तिष्क लिफ्ट, और तेज आईरिस कैंची का उपयोग करने के लिए ध्यान से कपाल तंत्रिका फाइबर विच्छेदन । फिर, संदंश का उपयोग करने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मस्तिष्क हस्तांतरण बर्फ के पांच मिलीलीटर ठंडा RPMI प्लस FBS युक्त । टेस्ट को अलग करने के लिए, पेट की त्वचा को संदंश के साथ उठाएं, और इंटीलूग और पेट की दीवार के माध्यम से एक देशांतर चीरा बनाने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें और पेट के सबसे निचले हिस्से को बेनकाब करें।
छेदक तक वृषण पुश करें, और दोनों पक्षों पर गोलाकार टेस्टिस को बेनकाब करने के लिए धीरे-धीरे वसा परत खींचने के लिए चिमटी का उपयोग करें। वसा की परत और एपीडिडिम को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करने के लिए आईरिस कैंची का उपयोग करें, और टेस्ट को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पांच मिलीलीटर बर्फ-ठंडे आरपीएमआई प्लस एफबीएस शामिल हैं। काटा ऊतकों में से किसी से एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर एक १००-माइक्रोन जाल के साथ एक बाँझ सेल छलनी पर अंग जगह है, और बर्फ के दो मिलीलीटर ठंडा RPMI प्लस FBS छलनी में जोड़ें ।
पांच मिलीलीटर सिरिंज से प्लंजर का उपयोग करके, ऊतक को मैश करें, और फ़िल्टर को ताजा माध्यम से धोएं जब तक कि अंग जाल के माध्यम से पूरी तरह से जमीन पर न हो जाए। अपकेंद्रित्र के लिए एकल कोशिका निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 30% घनत्व ढाल माध्यम के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। ध्यान से एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में 70% घनत्व ढाल माध्यम के दो मिलीलीटर पर सेल समाधान परत, और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को अलग।
फिर, दो घनत्व ढाल के बीच इंटरफेज से कोशिकाओं को एक और अपकेंद्रित्र के लिए ठंडे RPMI प्लस FBS के 10 मिलीलीटर युक्त एक नया 15 मिलीलीटर करने के लिए स्थानांतरित करें, और गिनती के लिए बर्फ-ठंड RPMI/FBS के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें । प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए, कोशिकाओं को FACS बफर एकाग्रता में प्रति १०० माइक्रोलीटर प्रति छह कोशिकाओं के लिए पांच गुना 10 तक पतला करें, और प्रति नमूने एंटीबॉडी को अवरुद्ध करने वाले एंटी-माउस सीडी 16/सीडी32 के 10 माइक्रोलीटर के साथ कोशिका के नमूनों को इनक्यूबेट करें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के बाद, एक ९६ के कुओं की उचित संख्या में कोशिकाओं के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें-अच्छी तरह से, गोल नीचे प्लेट प्रयोगात्मक प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल के अनुसार, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से ई प्रोटीन टेट्रामेट मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें ।
इनक्यूबेशन के अंत में, प्रकाश से संरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए कोशिकाओं की सतह एंटीबॉडी को कोशिकाओं में रुचि के एंटीबॉडी जोड़ें। इसके बाद, कोशिकाओं को प्रति वॉश FACS बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं, और प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को ताजा एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ सावधानीपूर्वक फिर से खर्च करें। फिर, नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, प्रकाश से संरक्षित, जब तक कि प्रवाह साइटोमीटर पर उनका विश्लेषण न हो जाए।
पैथोलॉजिकल लक्षण और मायलोपैरालिसिस और मोटर पैरापरेसिस जैसे संकेत इंटरफेरॉन अल्फा/बीटा रिसेप्टर 1 नॉकआउट चूहों में जीका वायरस के साथ टीका लगाने के सात दिन बाद देखे जाते हैं । संक्रमित इंटरफेरॉन अल्फा/बीटा रिसेप्टर में वजन में बदलाव 1 नॉकआउट जानवरों पर 15 दिनों तक नजर रखी गई, वजन घटाने के साथ पहले संक्रमण और वजन वसूली के चार दिन बाद सात दिन बाद संक्रमण शुरू हुआ । संक्रमित मुरीन दिमाग की प्रतिनिधि छवियां जीका वायरस के साथ टीका लगाने के सात दिन बाद स्पष्ट एडीमा और हाइपरमिया का पता चलता है ।
मुरीन ज़िका-संक्रमित टेस्ट की प्रतिनिधि छवियां संक्रमण के बाद सात से 30 दिनों तक क्रमिक रूप से सिकुड़ने का प्रदर्शन करती हैं । ज़िका-संक्रमित मस्तिष्क और वृषण ऊतक वर्गों का हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण भी असंक्रमित नियंत्रणों की तुलना में विनाशकारी रोग परिवर्तनों के प्रभाव को दर्शाता है। मैक्रो और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषणों से उम्मीद के अनुसार, इम्यूनोदाता द्वारा जीका वायरस से संक्रमित चूहों के मस्तिष्क और वृषण में उच्च वायरल भार का भी पता लगाया जाता है ।
कि मस्तिष्क के बाद Zika संक्रमण में एक मजबूत CD3 सकारात्मक टी सेल घुसपैठ के साथ है । जीका वायरस-विशिष्ट सीडी 3-पॉजिटिव, सीडी8-पॉजिटिव टी लिम्फोसाइट्स दोनों में जीका वायरस से संक्रमित और वैक्सीन-प्रतिरक्षित चूहों में ई-प्रोटीन टेट्रामर स्टेनिंग द्वारा पता लगाया जाता है । ई-प्रोटीन टेट्रामर-विशिष्ट सीडी8-पॉजिटिव टी कोशिकाओं का भी मस्तिष्क में पता लगाया जा सकता है और जीका वायरस के साथ टीका लगाने के सात दिन बाद टेस्ट किया जा सकता है ।
इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने पशु मॉडलों में प्राकृतिक संक्रमणों के दौरान इम्यूनोप्रेवलेंट अंगों में रोगजनक-विशिष्ट टी-सेल लक्षण वर्णन के अध्ययन में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त किया। इस विधि को अन्य प्रतिरक्षा-प्रचलित अंगों, जैसे प्लेसेंटा या आंख, साथ ही वायरल संक्रमण और कैंसर दोनों पर भी लागू किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के बाद, एमएचसी-1 टेट्रामर्स का उपयोग मस्तिष्क-या टेस्ट-घुसपैठ टी कोशिकाओं के वितरण तक पहुंचने के लिए रोगजनक-विशिष्ट टी कोशिकाओं के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन के लिए किया जा सकता है।