Name: evaluation of zika virus-specific t-cell responses in immunoprivileged organs of infected ifnar1-/- mice
Uploaded: 2018-10-17T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice at JoVE.com

Gli autori ringraziano Gary Wong per la revisione inglese. Questo lavoro è stato supportato dalla ricerca chiave nazionali e programma di sviluppo della Cina (grant 2017YFC1200202), i progetti speciali di Major per ricerca malattia infettiva della Cina (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao è un ricercatore principale leader nazionale Natural Science Foundation di Cina innovativo gruppo di ricerca (grant 81621091).

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e Comitato dell'Istituto nazionale di uso per Viral Disease Control and Prevention, CDC di Cina. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le istituzionali Animal Care e approvato dal comitato di uso animale protocolli.
1. virus infezione
<ol><li>Tenere adulto (6-8 settimana-vecchio) Ifnar1- / - (50% uomini e 50% donne) topi/in speciali esenti da patogeni (SPF) condizioni standard e consentire loro di regolare accesso a cibo e acqua.</li>
	<li>Infettare i topi di Ifnar1- / - con il ZIKV tramite un'inoculazione di retro-orbitale di 100 µ l di ZIKV in un tampone fosfato salino (PBS) tampone 1 x 104 fuoco-unità formanti (FF) del virus. Analogamente, è possibile fornire i topi di controllo con un volume uguale di PBS. Attenzione: Infettare i topi in condizioni ABSL2 ed eseguire queste procedure con topi infettati da virus nella cappa di biosicurezza.</li>
	<li>Monitorare il peso e segni clinici (tremori, marzo sfalsato, bilaterali dell'arto flaccido) dei topi al giorno per 15 giorni.</li>
</ol>2. immunizzazione con il vaccino ZIKV
<ol><li>Utilizzare Ifnar1- / - (50% uomini e 50% donne) topi/tra 6 e 8 settimane di età. Tenere i topi in condizioni standard di SPF di 18 – 29 ° C e un ciclo luce/buio di 12 h con accesso a cibo e acqua.</li>
	<li>Immunizzare i topi di Ifnar1- / - con il vaccino ZIKV: iniettare 100 µ l di AdC7-M/E [4 x 1010 (particelle di virus)] in PBS buffer tramite un'iniezione intramuscolare (i.m. percorso) utilizzando una siringa da 1 mL con ago 23-G.</li>
	<li>Allo stesso modo, è possibile iniettare topi di controllo con un volume uguale di PBS.</li>
</ol>3. isolamento dei monociti dalla milza
Nota: L'isolamento dei monociti dalla milza è descritto come accennato in precedenza16.
<ol><li>Anestetizzare post-l'inoculazione 7D topi immunizzati e affetti da ZIKV, utilizzando un 5% isoflurane concentrazione 100% ossigeno (con una portata di 1 L/min). Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Quindi, immediatamente immergere tutto il mouse in etanolo di 75%. Attenzione: da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in modo asettico in una cappa di biosicurezza.</li>
	<li>Usando gli aghi, bloccare gli arti dei topi (eutanasizzati, precedentemente infettati/immunizzati) sulla piastra schiuma con l'addome rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale al torace con un bisturi sterile, tagliare i muscoli addominali con le forbici, esporre la cavità addominale e rimuovere delicatamente il fegato. Nota: L'organo lungo, rosso scuro a sinistra dello stomaco è la milza.</li>
	<li>Rimuovere la milza, risciacquarla 3x in PBS per rimuovere qualsiasi sangue e posizionarlo in 1,5 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute ghiacciata (RPMI). Mantenere la milza sul ghiaccio.</li>
	<li>Per generare una sospensione unicellulare dalla milza, mettere il organ(s) su un colino di cella sterile 40 µm-mesh sulla cima di un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di gelida RPMI medium contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 mL, meccanicamente poltiglia il organ(s) e aggiungere il terreno fino a quando l'organo è stato completamente terreno attraverso la maglia.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con 5 mL di un tampone di lisi di globuli rossi (RBC) (NH4Cl, Na2EDTA e KHCO3; cfr. la Tabella materiali) e incubare la reazione di Lisi a temperatura ambiente per 5 – 6 min.</li>
	<li>Interrompere la lisi di RBC con 10 mL di medium RPMI/FBS ghiacciata e centrifugare la provetta a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con 10 mL di terreno RPMI completo (RPMI con 10% vol/vol FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina). Trasferire 10 µ l di sospensione cellulare per un piccolo tubo, mescolare con 10 µ l di 0,4% wt/vol trypan blu e contare il numero di celle utilizzando un emocitometro.</li>
</ol>4. isolamento dei monociti dal cervello e testicoli
<ol><li>Anestetizzare post-l'inoculazione 7D topi maschi affetti da ZIKV, utilizzando 5% isofluranein 100% ossigeno (con una portata di 1 L/min). Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Quindi, immediatamente immergere tutto il mouse in etanolo di 75%. Attenzione: Da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite asetticamente in una cappa di biosicurezza. L'isolamento dei monociti dal cervello e testicoli è descritto come accennato in precedenza17.</li>
	<li>Immobilizzare un topo maschio (eutanasizzato, precedentemente infetto) in posizione prona su un tagliere.</li>
	<li>Proteggere il cuoio capelluto con un forcipe 1x2 denti dritti e usare le forbici Iris per fare un'incisione del midline sul cuoio capelluto per esporre il cranio.</li>
	<li>Fissare i due lati delle orbite con pinzette taglienti e difficoltà del cervello. Inserire una punta delle forbici taglienti di Iris il magnum di orifizio e tagliare lateralmente nel cranio. Ripetere questo passaggio per l'altro lato.</li>
	<li>Uso forte Iris forbici per tagliare accuratamente dalla cavità stessa, fino alla linea mediana, verso il naso. Cercare di mantenere la fine delle forbici come superficiale possibile evitare di ferire il cervello.</li>
	<li>Sollevare il cervello con il forcipe e utilizzare forbici affilate Iris per sezionare con cura le fibre del nervo cranico. Rimuovere il cervello con il forcipe e metterlo in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di medium RPMI/10% FBS ghiacciata.</li>
	<li>Afferrare la pelle dell'addome con una pinza e utilizzare forbici affilate Iris per praticare un'incisione longitudinale attraverso il tegumento e la parete addominale ed esporre la parte più bassa dell'addome. Spingere i testicoli fino all'incisione. Delicatamente tirare lo strato di grasso con le pinzette ed esporre un testicolo globulare su entrambi i lati.</li>
	<li>Uso forte Iris forbici per sezionare con cura lo strato di grasso e l'epididimo. Posizionare i testicoli in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di terreno di RPMI/10% FBS ghiacciata con il forcipe.</li>
	<li>Per generare una sospensione unicellulare dal cervello o testicoli, mettere l'organo su un filtro sterile cella con una mesh di 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di terreno di RPMI/10% FBS ghiacciata. Utilizzando lo stantuffo della siringa 5ml, schiacciate l'organo e aggiungere il terreno fino a quando l'organo è stato completamente terreno attraverso la maglia.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con 5 mL di 30% densità gradiente medio e, quindi, aggiungerli molto lentamente a 2 mL di 70% medio gradiente di densità in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Spegnere il freno e centrifugare le provette a 4 ° C a 800 x g per 30 min. Ottieni i linfociti dallo strato intermedio.</li>
	<li>L'interfase di trasferimento in una nuova provetta 15 mL, aggiungere 10 mL di fluido freddo RPMI/10% FBS e centrifugare la provetta a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con 10 mL di medium RPMI/FBS ghiacciata e li Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con 10 mL di terreno RPMI completo e contare il numero di cellule come descritto al punto 3.9.</li>
</ol>5. tetramero preparazione
<ol><li>Plasmidi che esprimono domini extracellulari di H-2Db con un tag di sito biotinilati il C-terminale del dominio α3 e il β2m utilizzando il vettore di pET28a con un NdeI e XohI sito di restrizione18.</li>
	<li>Express e preparare i corpi di inclusione di H-2Db e β2m come descritto in precedenza20.</li>
	<li>
Rinaturazione e purificare il peptide/MHC complesso H-2Db-E294-302.
	<ol>
<li>Preparare 200 mL di una soluzione di refolding [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA-Na, 5 GSG e 0,5 mM GSSG]. Aggiungere gli inibitori della proteasi: 2 mL di fenilmetilsufonilfluoruro (PMSF, magazzino 100 mM), 100 µ l di pepstatina (stock 2 mg/mL) e 100 µ l di leupeptina (stock 2 mg/mL). Raffreddare il buffer a 4 ° C per 30 min.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione refoldingbH-2D, β2m e il peptide.<ol>
<li>Iniettare 500 µ l di β2m disciolti in una soluzione di guanidina (30 mg/mL di brodo) utilizzando una siringa. Per questo, è necessario utilizzare un ago di 23 G con una siringa da 5 mL e iniettare il β2m nella soluzione refolding goccia a goccia. Mantenere la soluzione costantemente e lentamente mescolando a 150 giri/min a 4 ° C.</li>
			<li>Dopo β2m è stato dissolto nella soluzione di refolding, risolvere 2 mg di peptide di294-302 E in 200 µ l di DMSO e iniettare velocemente nella soluzione di refolding utilizzando una pipetta. Mescolare lentamente la soluzione a 150 giri/min a 4 ° C per 15 min.</li>
			<li>Iniettare 1,5 mL di H-2Db disciolti in una soluzione di guanidina. Mantenere la stir bar rotante a 150 giri/min per il ripiegamento del H-2Db a 4 ° C per 8-10 h. Nota: La soluzione è stato disposto in una scatola chiusa in una stanza fredda.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Concentrare la proteina ripiegata in una camera pressurizzata con una membrana di kDa 10. Scambiare il buffer [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] alla camera e concentrarlo in un volume finale di 30 – 50 mL.</li>
		<li>Trasferire la soluzione di refolding in una provetta da centrifuga e girarla a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire con cautela il supernatante a un filtro centrifugo di kDa 10 e concentrarlo ulteriormente ad un volume finale di 500 µ l a 2.500 x g per 30 min.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e girarla a 12.000 x g per 15 min. purificare la proteina con S200 10/300 GL ﬁltrazione cromatografia del gel.</li>
		<li>Raccogliere il picco di complessi MHC e concentrarlo in un volume finale di 350 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per generare un volume di reazione di 500-µ l per biotinylation, aggiungere i reggenti nel seguente ordine: 100 µ l di soluzione A [0.5 m bicina (pH 8.3)], 100 µ l di soluzione B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 biotina µΜ), 100 µ l di supplementare d-biotina (biotina 500 µΜ) , 20 µ l di enzima BirA (60 µ g), 0,5 µ l di pepstatin (2 mg/mL) e 0,5 µ l di leupeptin (2 mg/mL). Incubare la provetta di reazione durante la notte a 4 ° C. Attenzione: Non aggiungere qualsiasi EDTA per la reazione di alchilanti.</li>
	<li>Purificare il MHC utilizzando un S200 colonna di 10/300 GL gel filtrazione per rimuovere qualsiasi biotina supplementare.</li>
	<li>
Determinare l'efficienza di alchilanti con un dosaggio di streptavidina-shift18.
	<ol>
<li>Preparare tre campioni, A, B e C, il ghiaccio per 30 min. Quindi, analizzare i risultati di un 10% SDS-PAGE. Campione A è costituito da 8 µ l di molecole di MHC biotinilato e 2 µ l di buffer di scambio, campione B di 8 µ l di molecole di MHC biotinilato e 2 µ l di streptavidina (20 mg/mL) e C di esempio di 2 µ l di streptavidina (20 mg/mL) e 8 µ l di tampone di scambio. Attenzione: Non bollire il campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formare dei multimeri delle molecole MHC biotinilato.
	<ol>
<li>Produrre tetramero mescolando il biotinilati E294-302 peptide-H2Db complesso con streptavidina ficoeritrina-etichettati con un rapporto di mole di 1:5 per assicurare un legame completo di tutte le molecole di MHC biotinilato.</li>
		<li>Calcolare la quantità di coniugato streptavidina-necessario per tetramerization.<ol>
<li>Determinare le talpe dei complessi peptide/MHC contabilità per la concentrazione nella proteina e il peso molare (esempio: 1,8 mg di proteine totali = 40 nmol).</li>
			<li>Calcolare le talpe del streptavidina-coniugato necessario dividendo le talpe del MHC/peptide per 5 (esempio: 40/5 = 8 nmol di streptavidina-coniugato).</li>
			<li>Calcolare la quantità di streptavidina necessario (in µ g) a seconda lo streptavidina-coniugato (esempio: streptavidina-PE [300.000 g/M] → 8 nmol necessari = 2.400 g).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dividere streptavidina-ficoeritrina in 10 campioni. Aggiungere ciascun campione in una provetta contenente il biotinilati E294-302 peptide-H2Db complesso, ad intervalli di 20 min. Dopo il caricamento dell'ultimo campione, incubare la provetta di reazione a 4 ° C durante la notte nel buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare i reagenti multimerized in una provetta da centrifuga 100 kDa e concentrarlo mediante centrifugazione a 2.000 x g a 4 ° C per un volume di < 100 µ l.</li>
	<li>Diluire il campione nel tubo spin da 4 mL con PBS (pH 8.0) e concentrarlo nuovamente a < 100 µ l.</li>
	<li>Ripetere lo scambio di buffer passo in PBS (pH 8.0) 4x.</li>
	<li>Riempire il volume totale nuovamente a 500 µ l utilizzo di PBS (pH 8.0). Concentrare il campione ad una concentrazione stimata di 2 – 2,5 mg/mL a 2.000 x g a 4 ° C. Conservare il campione al buio a 4 ° C.</li>
</ol>6. flusso Cytometry
<ol><li>Incubare le sospensioni delle cellule (da passo 3.9 e/o passo 4,15) a 4 ° C con 0.1 µ l di Reagente Bloccante di CD16/CD32 Fc-recettore anti-murino a 20 µ l (fattore di diluizione 1: 200) per 10 min, per impedire qualsiasi legame aspecifici.</li>
	<li>Centrifugare la provetta tetramero a 20.000 x g per almeno 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di sospensione cellulare a un platecontaining 96 pozzetti 1 x 106 cellule ciascun pozzetto.</li>
	<li>Preparare un volume sufficiente del mix di tetramero E294-302 a macchiare tutti i tubi sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questo mix al conto per errori di pipettaggio. Diluire i tetrameri di294-302 E (2 mg/mL, 1 µ l/test) nel buffer di FACS (PBS, 0,5% FBS) affinché 20 µ l della miscela E294-302 tetramero è aggiunto a ogni test.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l della miscela tetramero E294-302 per la piastra a 96 pozzetti. Entro la fine di questo passaggio, è opportuno che il volume finale in ciascun pozzetto 40 µL.Incubate la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere gli anticorpi primari (coniugato FITC o APC-coniugato anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-coniugato anti-CD8 (0,2 mg/mL)) a 1 µ l/test alla sospensione di cellule e, quindi, viene quindi incubato a 4 ° C per 30 min al buio.</li>
	<li>Lavare le cellule 2 x con 2 mL di tampone di FACS e centrifuga con attenzione li a 600 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 200 µ l di tampone di FACS.</li>
	<li>Conservare i campioni temporaneamente a 4 ° C al buio fino a quando l'analisi cytometric di flusso.</li>
	<li>
Utilizzare la seguente strategia di gating per l'analisi cytometric di flusso.
	<ol>
<li>Creare un cancello su camiciole diagonalmente cluster tracciando una zona di dispersione (SSC) forward scatter (FSC) contro laterale.</li>
		<li>Quindi, cancello il CD3 cellule di+ da side scatter (SSC) contro CD3; Successivamente, cancello il CD3+ CD8+ celle; Infine, contorni CD8+ + tetramero cellule19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. istopatologia, immunofluorescenza e test immunoistochimico
<ol><li>
Dosaggio di istopatologia
	<ol>
<li>Raccogliere i tessuti cerebrali e testicolo del ZIKV-infettati Ifnar1- / - topi 7D post-inoculazione e fissarli in 4% neutra tamponata formaldeide. Attenzione: paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale.</li>
		<li>Incorporare il tessuto in paraffina.</li>
		<li>Sezione del tessuto a 5 mm utilizzando un vibratomo.</li>
		<li>Macchiare il tessuto con ematossilina ed eosina (H & E).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test immunoistochimico
	<ol>
<li>Deparaffinizzare, reidratare e antigene-recuperare il tessuto sezioni, sulla base di procedure descritte precedentemente21.</li>
		<li>Trattare le sezioni di tessuto con 3% H2O2 in PBS (pH 7,6) per 10 min e bloccarli con 1% di albumina di siero bovino (BSA) per 10 min.</li>
		<li>Incubare le sezioni di tessuto con anticorpo di topo anti-topo CD3 (diluizione: 1/1.000) per 8 h a temperatura ambiente e, quindi, li Incubare a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Sciacquare i tessuti con PBS e, quindi, incubare li con 3 gocce di anticorpo secondario biotinilato (diluizione: 1/1.000) per 2 h a temperatura ambiente, seguita da 3 gocce di avidina-biotina-perossidasi (diluizione: 1/200) a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Associare, con 3 gocce di 30, 30-diaminobenzidina tetrahydrochloride (diluizione: 1/1.000), come descritto in precedenza22.</li>
		<li>Colorante di contrasto le sezioni di tessuto con ematossilina di Mayer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di immunofluorescenza
	<ol>
<li>Asciugare le sezioni congelate testicolo (6 mm) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fissarle con acetone ghiacciata per 10 min.</li>
		<li>Lavare le sezioni con PBS per 3x e bloccarli con un tampone di bloccaggio (BSA 1%, 0,3% Triton, 1x PBS) a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Incubare le sezioni di tessuto con l'anticorpo primario (Z6) (20 µ g/mL) a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Sciacquare i tessuti con PBS e applicare l'anticorpo secondario (fattore di diluizione: 1/200) per 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavare le sezioni di tessuto con PBS e li colorante di contrasto per nuclei con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (fattore di diluizione: 1/1.000), seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+alloantigen-specific+T+cells+from+peripheral+blood.">Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).</li><li>Legoux, F. P., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide:MHC+tetramer-based+enrichment+of+epitope-specific+T+cells.">Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 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F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+identification+of+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus-specific+CTL+epitopes.">Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes.</a> The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).</li><li>Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+in+semen:+effect+on+human+reproduction.">Zika virus infection in semen: effect on human reproduction.</a> The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Causes+Testis+Damage+and+Leads+to+Male+Infertility+in+Mice.">Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice.</a> Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).</li><li>Li, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates.">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Immunogeno epitopo a cellula T svolge un ruolo significativo nell'immunità cellulare contro gli agenti patogeni23. Così, la rilevazione delle cellule di T ZIKV-specifici in organi di nuova è una metodologia critica per capire le risposte delle cellule T contro l'infezione naturale di ZIKV. Nel frattempo, rilevamento di risposta delle cellule T è un ottimo strumento per studiare l'efficacia del vaccino virale. Qui, indichiamo un protocollo completo di visualizzare gli esperimenti, che includono l'isolamento dei linfociti da milza, cervello e testicoli dei topi infettati ZIKV, la preparazione del tetramero immunodominanti epitopo E294-302 e la riconoscimento di CD8 specifici ZIKV+ T cellule negli organi di nuova dei topi infettati da ZIKV.
Uno studio precedente ha mostrato che un ZIKV dal vivo o il RNA può essere rilevata nel liquido seminale dei pazienti di sesso maschile, che indica che il ZIKV può bypassare la barriera ematotesticolare e replicarsi nel sistema riproduttivo24. In precedenza, abbiamo anche dimostrato che la ZIKV può causare danni di testicoli e condurre alla sterilità maschile in topi25. ZIKV infezione può portare a viremia nelle scimmie rhesus, e il RNA virale può essere rilevato nel sistema nervoso centrale (SNC), come pure negli organi viscerali. Immunohistochemistry ha rivelato che gli antigeni ZIKV-specific sono stati presentati nel SNC e gli organi periferici più26. Inoltre, in modelli murini, ZIKV infezione può indurre un robusto CD8 antivirale+ risposta a cellula T nella milza e nel CNS26.
Rispetto ai lavori precedenti, questo studio stabilisce metodi sistematici per rilevare CD8 specifici ZIKV+ cellula T risposte nel cervello e testicoli, che sono siti di nuova. È importante valutare la funzionalità delle cellule T virus-specifiche negli organi dei topi affetti da ZIKV nuova. L'utilizzo di tetrameri di rilevare ZIKV specifici CD8+ T-cell responses in organi di nuova sarebbe di migliorare notevolmente la nostra comprensione delle infezioni ZIKV e loro risposta immune dell'ospite. Utilizzando tetramero294-302 E, cellule T virus-specifiche nel cervello e nel testicolo possono essere isolate da citometria a flusso, per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi durante un'infezione ZIKV. Nel frattempo, è utile per i ricercatori a studiare ulteriormente le funzioni del CD8+ T cellule per controllare il ZIKV, o per migliorare l'immunopatogenesi in questi organi durante l'infezione ZIKV.
Per analizzare il CD8 murino di antigene-specifiche+ cellula T risposte negli organi nuova, abbiamo preparato tetramero di294-302 - E H-2Dbe rilevato il CD8+ T cellule tramite flusso cytometry. Tetrameri sono un potente strumento per rilevare cellule T antigene-specifiche. Qui, tre tipi di streptavidina fluorocromo-coniugate (APC, PE e BV421) sono stati generati. Anche se non ci sono differenze statisticamente significative in APC, BV421 e tetrameri PE-etichettati per la rilevazione di cellule T antigene-specifiche, pMHC PE-labeled-I tetrameri ha prodotto i risultati migliori. Quindi, il tetramero PE-identificato è stato utilizzato nel corso di questo studio. È interessante notare che, in base il tetramero di294-302 PE-labeled H-2D - Eb, abbiamo rilevato alti rapporti di cellule T antigene-specifiche nel cervello e testicoli, che indicano la capacità di migrazione delle cellule di T virus-specifici dal sangue per organi di nuova.
Tuttavia, esistono alcune limitazioni del protocollo. Il tetramero di294-302 H-2D - Ebnon è utile per il rilevamento della T-cellula umana, perché tetramero rilevamento dipende dalla restrizione MHC. Lo screening dei peptidi HLA-restricted immunodominanti è ancora necessaria. Inoltre, l'infezione retro-orbitale è efficace per un'infezione ZIKV ma potrebbe non essere un'operazione conveniente per alcuni ricercatori. Così, altre vie di infezione, tra cui peritoneale, sottocutanea o endovenosa, sono anche raccomandati.
Nel protocollo descritto qui, un passo fondamentale è l'isolamento dei monociti dal cervello e testicolo. È importante acquisire qualità linfociti; Pertanto, è importante prestare attenzione, ad esempio, la velocità di centrifuga, la forza del tessuto rettifica e la dissezione del tessuto del cervello e del testicolo. Inoltre, per la preparazione di tetramero, inibitori della proteasi (PMSF, pepstatina, leupeptina) sono utili quando si protegge una proteina da essere degradate. Pertanto, ha senso aggiungere un inibitore della proteasi per il buffer di refolding e scambiare il buffer durante il processo della preparazione tetramero.
In conclusione, vi presentiamo i metodi di rilevazione risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova del modello del topo di Ifnar1- / - per un'infezione ZIKV. Questa piattaforma può essere ampiamente applicata per studiare i meccanismi immuni di emergenti e riemergenti virus che può ignorare le barriere tra il sangue e gli organi di nuova. Inoltre, questo studio potrebbe spianare la strada per il futuro sviluppo di vaccini e immunoterapie.

Il ZIKV è un flavivirus trasmesse dalle zanzare che in primo luogo è stato isolato nel 1947 in Uganda da un macaco rhesus febbrile. Recentemente, il ZIKV è diventato un'emergenza di sanità pubblica, a causa della sua rapida diffusione nelle Americhe e il suo legame inaspettato con microcefalia e sindrome di Guillain-Barré1,2,3. Da dati epidemiologici, la ZIKV è stata sospettata di essere la causa della sindrome di Guillain-Barré in circa 1 caso ogni 4.000 infetti adulti4. Inoltre, è stata dimostrata una correlazione tra la ZIKV e testicoli infezione/danni nel modello del topo, suggerendo che l'infezione di ZIKV, in determinate circostanze, può bypassare la barriera ematotesticolare e portare alla sterilità maschile5 . Questi risultati evidenziano l'importanza di comprendere completamente l'induzione delle risposte immunitarie protettive o patologiche durante un'infezione ZIKV.
Molto resta ancora essere imparato a conoscere le risposte immunitarie cellulari per il ZIKV. CD4+ e CD8+ T-cell responses to il capside, busta e non strutturali della proteina 1 (NS1) sono stati osservati in ZIKV-infettati scimmie e gli esseri umani6,7,8. Nei topi, parecchi studi hanno indicato che CD8+ T cellule svolgono un ruolo protettivo nel controllare il ZIKV replica9,10,11. D'importanza, Jurado et al hanno dimostrato che un'infezione di ZIKV provoca la ripartizione della barriera sangue - cervello e infiltrazione perivascolare di CD8+ T effettrici all'interno dei testicoli di Ifnar1 topi- / - . Inoltre, hanno mostrato che CD8+ T cellule istigare la paralisi ZIKV-collegato e sembrano svolgere un ruolo in immunopathology cervello neonatale. In uno studio precedente, abbiamo preparato il tetramero di294-302 ZIKV-E e ha mostrato che CD8 specifici ZIKV+ T cellule esistono nei cervelli e midolli spinali dei topi- / - ZIKV-infettati Ifnar1, che possono avere implicazioni importanti per la progettazione e lo sviluppo di vaccini ZIKV10.
In risposta all'urgente necessità per la vaccinazione prevenire l'infezione ZIKV, diversi vaccini sono nelle fasi precliniche di sviluppo, tra cui RNA vaccini, vaccini basati su vettori ricombinanti e vaccini a subunità della proteina purificata. Il vaccino di DNA del plasmide è in fase di test clinici 112. La valutazione della sicurezza ed efficacia dei vaccini ZIKV è, quindi, importante. Uno dei vantaggi dei vaccini è la loro capacità di suscitare risposte a cellula T specifiche, che possono essere importanti per la protezione contro il ZIKV. Utilizzando tetrameri correlate a epitopo T-cellulare ZIKV-derivata, il immunoreactivity di cellula T indotto da un vaccino contro l'adenovirus-vector-based ZIKV potrebbe essere individuato in topi immunizzati e glicoproteine sia M che E sono stati indicati per indurre robusto antigene-specifiche CD8+ T-cellula immunoreactivity13.
Durante un'infezione del virus, il riconoscimento degli antigeni del peptide presentato da molecole (MHC) complesse di istocompatibilità per T-cell receptor (TCR) è un importante meccanismo di T-cellula-mediata per proteggere l' host14. Basato su questa teoria, tecnologia tetramero è uno strumento unico per delucidare i ruoli che cellule T antigene-specifiche giocano nel regolare le risposte immunitarie15. Questo protocollo descrive l'istituzione del modello Ifnar1- / - mouse per le infezioni ZIKV e la rilevazione delle cellule T reattive in milza, cervello e testicoli dei topi utilizzando tecnologia tetramero. Inoltre, abbiamo utilizzato il tetramero di294-302 ZIKV-E per rilevare e valutare il immunoreactivity cellula T indotto da un vaccino ZIKV (AdC7-M/E) in topi immunizzati. Questo studio fornisce una guida per lo studio di risposte a cellula T in organi di nuova e fornisce un riferimento per le potenziali applicazioni nella placenta o cervello fetale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1007px;" width="1006">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Z6</td>
			<td style="width:131px;">our lab</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:475px;">Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD3</td>
			<td style="width:131px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:185px;">sc-1127; RRID: AB_631128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)</td>
			<td style="width:131px;">ZSGB-BIO</td>
			<td style="width:185px;">ZF-0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated</td>
			<td style="width:131px;">CWBIO</td>
			<td style="width:185px;">CW0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">17A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">APC anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PerCP anti-mouse CD8a</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:185px;">P8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:131px;">Ameresco</td>
			<td style="width:185px;">0754-5G</td>
			<td>Toxic and corrosive reagent. 
			Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">S4762-FZ</td>
			<td>Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and&#160; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:185px;">P4265-5MG</td>
			<td>5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:185px;">L8511</td>
			<td>5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at - 20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Scilight-peptide</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Must be resuspended in DMSO and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:131px;">Hyclone</td>
			<td style="width:185px;">SH30809.01</td>
			<td>Must be stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">MP</td>
			<td style="width:185px;">219605590</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">APC-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554067</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554060</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PE-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554061</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BV421-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">563259</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:185px;">26614</td>
			<td>Must be stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainers</td>
			<td style="width:131px;">BF</td>
			<td style="width:185px;">BF10-5040</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amicon Ultra 100kDa</td>
			<td style="width:131px;">Millipore</td>
			<td style="width:185px;">UFC510024</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Cantol</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td style="width:131px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:185px;">28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AKTA PURE</td>
			<td style="width:131px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">red blood cell lysis buffer</td>
			<td style="width:131px;">Solarbio</td>
			<td style="width:185px;">R1010</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zika virus-specific t-cell responses in immunoprivileged organs of infected ifnar1-/- mice

Il virus di Zika (ZIKV) può indurre l'infiammazione in nuova organi (ad es., il cervello ed il testicolo), che conduce alla sindrome di Guillain-Barré e danneggiare i testicoli. Durante l'infezione con il ZIKV, le cellule immuni sono state indicate per infiltrarsi nei tessuti. Tuttavia, i meccanismi cellulari che definiscono la protezione e/o immunopatogenesi di queste cellule immunitarie durante un'infezione di ZIKV sono ancora in gran parte sconosciuti. Qui, descriviamo i metodi per valutare la funzionalità di T-cellule virus-specifici in questi organi di nuova dei topi infettati da ZIKV. Questi metodi includono un) un ZIKV infezione e l'inoculazione del vaccino nei topi di Ifnar1- / - ; b) l'istopatologia, l'immunofluorescenza e le analisi immunohistochemistry per rilevare l'infezione del virus e l'infiammazione nel cervello, testicoli e milza; c) la preparazione di un tetramero di epitopi a cellula T ZIKV-derivati; d) la rilevazione delle cellule di T ZIKV-specifici in monociti isolati dal cervello, testicoli e milza. Utilizzando questi approcci, è possibile rilevare le cellule T antigene-specifiche che si sono infiltrati in organi nuova e per valutare le funzioni di queste cellule di T durante l'infezione: potenziale protezione immunitaria tramite virus liquidazione e immunopatogenesi/o esacerbare l'infiammazione. Questi risultati possono anche contribuire a chiarire il contributo delle cellule di T indotta tramite l'immunizzazione contro ZIKV.

A seguito di questi metodi, abbiamo sviluppato un modello murino per le infezioni ZIKV. Ifnar1- / - topi a 6 – 8 settimane di età sono stati infettati con unità di formazione di messa a fuoco di 1 x 104 (FFU) della ZIKV di retroorbital iniezione. Sintomi patologici e segni (Figura 1A), nonché variazioni di peso (Figura 1B), sono state osservate nei topi Ifnar1- / - dopo un'infezione con il ZIKV. Il cervello murino ha mostrato edema evidente e iperemia (Figura 1C). Nel frattempo, i testicoli si è ridotto gradualmente (Figura 1D). Inoltre, mutazioni patologiche e la distruzione del tessuto sono stati trovati nel cervello e testicoli (Figura 2A). Abbiamo effettuato un'analisi di immunofluorescenza per rilevare la ZIKV nel cervello e testicoli (Figura 2B). Alta carica virale sono stati rilevati nel cervello e nel testicolo immunostaining (Figura 2B). Immunohistochemistry ha mostrato un'infiltrazione robusta di CD3+ T cellule nel cervello di topi dopo l'infezione con il ZIKV (Figura 2C).
Per rilevare e valutare le risposte specifiche ZIKV T-cell, abbiamo preparato un mouse MHC-I tetramero di H-2Db-E294-302 . Il peptide E294-302 può aiutare la rinaturazione dib H-2D correttamente e produrre una quantità elevata di solubili MHC-I (Figura 3A). In analisi di spostamento, un'alta efficienza in biotinylation potrebbe essere osservata (Figura 3B). Successivamente, tre streptavidina fluorescenza (APC, PE e BV421) - etichetta pMHC - I tetrameri sono state prodotte per rilevare le cellule T ZIKV-specifici (Figura 3C). Il tetramero PE-labeled aveva una più alta efficacia per rilevare il CD8 specifici+ delle cellule di T rispetto al tetrameri APC - e BV421-labeled, se la differenza non era statisticamente significativa.
Usando il tetramero di294-302 E, abbiamo rilevato i linfociti T ZIKV-specifici nella milza dei topi infetti da citometria a flusso alle post-inoculazione 7D di ZIKV (3,49 ± 0,45%). Inoltre, simile al metodo descritto nella sezione 3 del presente protocollo, con post-immunizzazione 4 settimane di vaccino AdC7-M/E, i linfociti T ZIKV-specifici sono stati rilevati nella milza (6,89 ± 1,36%) (Figura 4).
Inoltre, abbiamo rilevato i linfociti infiltrati nel nuova organi, come il cervello e testicoli, dopo l'infezione di ZIKV. I cancelli sono stati fissati per selezionare per CD3+CD8+ T cellule in linfociti totali del cervello e testicoli. Un alto rapporto delle cellule di T E294-302 tetramero specifico potrebbe essere rilevato nel cervello (42,2% nel CD3+CD8+ T cellule) e la testicolare (26,4% in CD3+CD8+ T cellule) linfociti (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig1.jpg"> Figura 1 : Caratterizzazione dell'infezione ZIKV nei topi di Ifnar1- / - . Ifnar1- / - topi a 6 – 8 settimane di età sono stati infettati con 10 unità di formazione di messa a fuoco4 (FFU) della ZIKV di iniezione retroorbital e topi iniettati con PBS sono stati usati come comandi non infetti. La morfologia (A) e (B) variazioni di peso di Ifnar1- / - topi infettati sono stati controllati. Le frecce rosse indicano Ifnar1 topi- / - ha presentati con myeloparalysis e motore paraparesis dopo l'infezione. (C) cervelli al post-inoculazione 7D e testicoli (D) a 0, 7, 14 e post-inoculazione 30 giorni sono state raccolte. Immagini rappresentative del cervello e testicoli dai topi sono visualizzati con un righello per indicare le dimensioni. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM. n = 10 topi per gruppo per esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig2.jpg"> Figura 2 : Rilevazione di linfociti nel cervello e nel testicolo di topi- / - ZIKV-infettati Ifnar1 e ZIKV. (A), questo pannello mostra i cambiamenti istopatologici nel cervello e testicoli da topi infettati ZIKV rispetto ai controlli negativi alle post-inoculazione 7D. Barra della scala = 25 µm (pannello di sinistra) e 50 µm (pannello di destra). (B) un'immunofluorescenza analisi è stata eseguita con l'anticorpo di anti-ZIKV Z6 (verde). Tutti i campioni di tessuto sono stati raccolti da topi infettati ZIKV al post-inoculazione 7D. I nuclei sono stati macchiati con DAPI (blu). Barra della scala = 50 µm. (C) esame immuno-istochimico indica un'infiltrazione robusta di CD3+ T cellule nel cervello e nel testicolo. Barra della scala = 25 µm (pannello di sinistra) e 50 µm (pannello di destra). Il viola indica ematossilina, marrone rappresenta l'anticorpo CD3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig3.jpg"> Figura 3 : Preparazione di specifiche ZIKV pMHC-I tetrameri. (A), l'associazione di E294-302 a H-2Db è chiarito da un in vitro di ripiegamento. Il blu indica la proteina di294-302 H-2D - Eb. Orange rappresenta il controllo negativo senza peptide. (B), questo pannello mostra l'analisi dello spostamento del H-2Db-E294-302 . (C), la simulazione rappresenta un controllo di PBS. Tre streptavidina fluorescenza (APC, PE e BV421) - etichetta pMHC - I tetrameri sono stati utilizzati per rilevare le cellule T ZIKV-specifici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig4.jpg"> Figura 4 : Analisi citofluorimetrica di virus-specifici CD8 + Cellule di T nella milza dei topi affetti da ZIKV e vaccino-immunizzato. Ifnar1 topi- / - 6-8 settimane di età o sono stati infettati con 10 unità di formazione di messa a fuoco4 (FFU) di ZIKV o ricevevano una dose singola di 4 x 1010 particelle virali di AdC7-M/E o PBS come controllo negativo. Dopo 7 giorni post-infezione o 4 settimane post-vaccinazione, splenocytes del topo sono state raccolte e analizzate tramite flusso cytometry. I dati sono mostrati come media ± SD. Statistical analysis è stata effettuata usando il One-way ANOVA (non significativo: P > 0.05; *P < 0.05; * *P < 0.01; * * *P < 0,001; * * *P < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig5.jpg"> Figura 5 : Gating risultati strategia e rappresentante del virus-specifici CD8+ T cellule nel cervello e testicoli dei topi infettati da ZIKV. Rappresentante trame sono indicati per i linfociti infiltrati in (A) il cervello e (B) il testicolo. Una successione di gates è impostata su selezione linfoide-scatter+ e CD3+ eventi. Di questi, CD8+ eventi sono gated per l'analisi delle cellule di T di epitopo specifico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

Un protocollo per valutare le risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova di Ifnar1- / - modello murino per l'infezione del virus (ZIKV) di Zika è descritto. Questo metodo è fondamentale per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi di vaccini ZIKV ed è inoltre utile per la loro valutazione di efficacia.

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Durante l'infezione da virus Zika, le cellule T possono infiltrarsi negli organi immunoprivileged per l'eliminazione del virus, ma possono anche contribuire all'immunopatogenesi, come la sindrome di Guillain-Barre o la lesione dei testi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che facilita il rilevamento basato su tetrameri di cellule T specifiche dell'antigene negli organi immunoprivileged, sia durante l'infezione da virus Zika che dopo l'immunizzazione del vaccino. In questo modello, l'infezione da virus Zika è iniziata nei topi knockout del recettore alfa / beta dell'interferone, consentendo il tracciamento delle cellule T specifiche del virus Zika nel cervello, nei testi e nella milza.Utilizzando un approccio di colorazione tetramero, è possibile indagare solo le caratteristiche dell'organo immunoprivileged che si infiltra nelle cellule T specifiche del virus Zika per esplorare i contributi delle cellule T alle cellule immunoprotezione e immunopatogeniche. Per l'infezione da virus Zika, consegnare uno per 10 alle quattro unità di formazione del focus del virus Zika in 100 microlitri di PBS tramite inoculazione retro-orbitale in topi knockout del recettore alfa/beta di sei-otto settimane. Quindi, monitorare il peso e i segni clinici degli animali infetti ogni giorno per 15 giorni.Sette giorni dopo l'inoculazione, fissare l'animale infetto in posizione supina su una schiuma chirurgica e utilizzare un bisturi sterile per fare un'incisione cutanea lungo la linea mediana dell'addome. Usa le forbici per aprire i muscoli addominali ed estrarre delicatamente il fegato. Quindi, rimuovere la milza e sciacquare il tessuto tre volte in PBS per rimuovere il sangue.Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare la milza su 1,5 millilitri di mezzo RPMI ghiacciato sul ghiaccio fino a quando tutte le milza non sono state raccolte. Per generare una sospensione a una cella, posizionare le milza in un filtro sterile a celle a rete da 40 micrometri sopra un tubo da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di mezzo RPMI ghiacciato integrato con siero bovino fetale al 10%, o FBS, al colino. Quindi, utilizzare lo stantuffo di una siringa da cinque millilitri per macerare il tessuto attraverso il filtro, utilizzando un mezzo fresco per sciacquare le cellule rilasciate attraverso la rete.Trasferire la sospensione a una cella in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione e rimescolare il pellet in cinque millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi. Dopo cinque o sei minuti a temperatura ambiente, interrompere lalisi con 10 millilitri di RPMI ghiacciato più FBS per una seconda centrifugazione e rimescolare il pellet in 10 millilitri di mezzo completo per il conteggio. Sette giorni dopo l'inoculazione, immobilizzare un topo maschio eutanasiato, infetto nella posizione incline su un tagliere e fissare il cuoio capelluto con forcep dritte uno per due denti.Usa le forbici dell'iride per fare un'incisione della linea mediana sul cuoio capelluto, esponendo il cranio e usa una pinzetta affilata per bloccare i due lati delle orbite con pinzette affilate, fissando il cervello. Posizionare una punta di forbici affilate all'iride nel forame magnum, tagliate lateralmente nel cranio su ciascun lato. Tagliato con cura dalla stessa cavità lungo la linea mediana, verso il naso, mantenendo le punte della forbice il più superficiali possibile per evitare di ferire il cervello.Sollevare il cervello con le forcep e utilizzare forbici affilate per l'iride per sezionare attentamente le fibre nervose cranici. Quindi, usa le forcep per trasferire il cervello in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI ghiacciato più FBS. Per isolare i teste, sollevare la pelle addominale con le forcep e utilizzare le forbici dell'iride per fare un'incisione longitudinale attraverso il tegumento e la parete addominale ed esporre la parte più bassa dell'addome.Spingere i testicoli fino all'incisione e utilizzare una pinzetta per tirare delicatamente lo strato di grasso, per esporre un testicolo globulare su entrambi i lati. Utilizzare le forbici dell'iride per sezionare attentamente lo strato di grasso e l'epididimo e trasferire i tester su un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI ghiacciato più FBS. Per generare una sospensione a una cella da uno dei tessuti raccolti, posizionare l'organo su un colino cellulare sterile con una rete da 100 micron sopra un tubo da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di RPMI ghiacciato più FBS al colino.Utilizzando lo stantuffo da una siringa da cinque millilitri, schiacciare il tessuto e lavare il filtro con mezzo fresco fino a quando l'organo non è stato completamente macinato attraverso la rete. Trasferire la sospensione a cella singola in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione e rimorsi il pellet in cinque millilitri di mezzo gradiente di densità del 30%. Sovrapporre con cura la soluzione cellulare su due millilitri di mezzo gradiente di densità del 70% in un nuovo tubo da 15 millilitri e separare le celle per centrifugazione del gradiente di densità.Quindi, trasferire le cellule dall'interfase tra i due gradienti di densità a un nuovo tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di RPMI freddo più FBS per un'altra centrifugazione e rimescolare il pellet in 10 millilitri di RPMI /FBS ghiacciato per il conteggio. Per analizzare le cellule per citometria a flusso, diluire le cellule a cinque per 10 fino alle sei cellule per 100 microlitri nella concentrazione tampone FACS e incubare i campioni di cellule con 10 microlitri di anticorpo bloccante CD16/CD32 anti-topo per campione. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 20 microlitri di cellule al numero appropriato di pozzi di una piastra a fondo tondo da 96 porsi secondo il protocollo sperimentale di colorazione citometrica del flusso e aggiungere 20 microlitri del mix tetramet proteina E a ciascun pozzo per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente al buio.Alla fine dell'incubazione, aggiungere gli anticorpi della superficie cellulare di interesse per le cellule per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. Successivamente, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone FACS per lavaggio e rimorsi accuratamente le cellule in ogni pozzo con 200 microlitri di tampone FACS fresco. Quindi, conservare i campioni a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce, fino alla loro analisi su un citometro a flusso.Sintomi patologici e segni come la mieloparalisi e la paraparesi motoria sono osservati nel recettore alfa /beta dell'interferone 1 topo knockout sette giorni dopo l'inoculazione con il virus Zika. Le variazioni di peso nel recettore alfa/beta dell'interferone infetto 1 animale knockout sono state monitorate per 15 giorni, con perdita di peso osservata per la prima volta quattro giorni dopo l'infezione e il recupero del peso a partire dal settimo giorno dopo l'infezione. Immagini rappresentative di cervelli murini infetti rivelano evidente edema e iperemia sette giorni dopo l'inoculazione con il virus Zika.Le immagini rappresentative dei tester murini infettati da Zika dimostrano una graduale contrazione dal settimo giorno ai 30 giorni dopo l'infezione. L'analisi istopologica delle sezioni cerebrali e testicoli infettate da Zika illustra anche l'effetto dei cambiamenti patologici distruttivi rispetto ai controlli non infetti. Come previsto dalle analisi macro e istopatologiche, elevati carichi virali vengono rilevati anche nel cervello e tester di topi infetti da virus Zika immunosottenendo.Ciò è accompagnato da una robusta infiltrazione di cellule T positiva al CD3 nell'infezione cerebrale post-Zika. I linfociti T cd3 positivi al virus Zika, positivi al CD8, vengono rilevati sia nei topi infetti da virus Zika che immunizzati dal vaccino dalla colorazione dei tetrameri delle proteine E. Le cellule T CD8-positive specifiche del tetramero E-protein possono anche essere rilevate nel cervello e testa sette giorni dopo l'inoculazione con il virus Zika.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nello studio della caratterizzazione delle cellule T specifiche degli agenti patogeni negli organi immunoprevalenti durante le infezioni naturali nei modelli animali. Questo metodo può anche essere applicato ad altri organi immuno-prevalenti, come placenta o occhio, così come sia all'infezione virale che al cancro. Seguendo questa procedura, i tetrameri MHC-I possono essere utilizzati per il rilevamento immunoistochimico o immunofluorescente di cellule T specifiche dell'agente patogeno per accedere alla distribuzione di cellule T infiltranti cerebrali o tester.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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