Durante la infección por el virus del Zika, las células T pueden infiltrarse en órganos inmunoprivilegidos para la eliminación del virus, pero también pueden contribuir a la inmunopaogénesis, como el síndrome de Guillain-Barré o la lesión de testículos. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la detección basada en tetrámeros de células T específicas de antígenos en órganos inmunoprivileged, tanto durante la infección por el virus del Zika como después de la inmunización de la vacuna. En este modelo, la infección por el virus del Zika se inicia en ratones knockout del receptor alfa/beta de interferón, lo que permite el seguimiento de las células T específicas del virus del Zika en el cerebro, los testículos y el bazo.
Utilizando un enfoque de tinción de tetrámeros, es posible investigar las características justas de los órganos inmunoprivilegiados que se infiltran en células T específicas del virus del Zika para explorar las contribuciones de las células T a la inmunoprotección y las células inmunopatogénicas. Para la infección por el virus del Zika, entregue una vez 10 a las cuatro unidades formadoras de enfoque del virus del Zika en 100 microlitros de PBS a través de la inoculación retro-orbital en ratones noqueadores del receptor alfa/beta de seis a ocho semanas de edad. A continuación, controle diariamente el peso y los signos clínicos de los animales infectados durante 15 días.
Siete días después de la inoculación, asegurar el animal infectado en la posición supina en una espuma quirúrgica, y utilizar un bisturí estéril para hacer una incisión de la piel a lo largo de la línea media del abdomen. Usa tijeras para abrir los músculos abdominales y extrae suavemente el hígado. Luego, retire el bazo y enjuague el tejido tres veces en PBS para extraer la sangre.
Después del último lavado, coloque el bazo en 1,5 mililitros de medio RPMI helado sobre hielo hasta que se hayan recogido todos los bazos. Para generar una suspensión de una sola célula, coloque los bazos en un colador de células de malla estéril de 40 micrómetros encima de un tubo de 50 mililitros, y agregue dos mililitros de medio RPMI helado complementado con un suero bovino 10%fetal, o FBS, al colador. Luego, utilice el émbolo de una jeringa de cinco mililitros para macerar el tejido a través del filtro, utilizando un medio fresco para vaciar las células liberadas a través de la malla.
Transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación, y resusppend el pellet en cinco mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos. Después de cinco a seis minutos a temperatura ambiente, detenga la lelisis con 10 mililitros de RPMI helada más FBS para una segunda centrifugación, y resuspend el pellet en 10 mililitros de medio completo para el recuento. Siete días después de la inoculación, inmovilizar un ratón macho eutanasiado, infectado, en la posición propensa en una tabla de cortar, y asegurar el cuero cabelludo con fórceps rectos uno por dos dientes.
Usa tijeras de iris para hacer una incisión de línea media en el cuero cabelludo, exponiendo el cráneo, y usa pinzas afiladas para sujetar los dos lados de las órbitas con pinzas afiladas, arreglando el cerebro. Colocación de una punta de tijeras de iris afiladas en el foramen magnum, cortado lateralmente en el cráneo a cada lado. Corte cuidadosamente desde la misma cavidad hasta la línea media, hacia la nariz, manteniendo las puntas de la tijera lo más superficiales posible para evitar lesionar el cerebro.
Levanta el cerebro con fórceps y usa tijeras de iris afiladas para diseccionar cuidadosamente las fibras del nervio craneal. Luego, usa los fórceps para transferir el cerebro a un tubo de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de RPMI helada más FBS. Para aislar los testículos, levante la piel abdominal con fórceps, y utilice las tijeras de iris para hacer una incisión longitudinal a través del integumento y la pared abdominal y exponer la parte inferior del abdomen.
Empuje los testículos hasta la incisión, y use pinzas para tirar suavemente de la capa de grasa, para exponer un testículo globular en ambos lados. Utilice las tijeras de iris para diseccionar cuidadosamente la capa de grasa y el epidídimo, y transfiera los testículos a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI helada más FBS. Para generar una suspensión de una sola célula a partir de cualquiera de los tejidos cosechados, coloque el órgano en un colador celular estéril con una malla de 100 micras en la parte superior de un tubo de 50 mililitros, y agregue dos mililitros de RPMI helada más FBS al colador.
Usando el émbolo de una jeringa de cinco mililitros, machaque el tejido y lave el filtro con un medio fresco hasta que el órgano haya sido completamente molido a través de la malla. Transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo de 15 mililitros para centrifugación, y resuspendir el pellet en cinco mililitros de 30% de densidad de gradiente medio. Capa cuidadosamente la solución celular sobre dos mililitros de 70% de densidad de medio de gradiente en un nuevo tubo de 15 mililitros, y separar las células por centrifugación de gradiente de densidad.
Luego, transfiera las células de la interfase entre los dos gradientes de densidad a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de RPMI frío más FBS para otra centrifugación, y resusppend el pellet en 10 mililitros de RPMI/FBS helada para el recuento. Para analizar las células por citometría de flujo, diluya las células a cinco veces 10 a las seis células por cada 100 microlitros en la concentración de búfer FACS, e incubar las muestras celulares con 10 microlitros de anticuerpos de bloqueo CD16/CD32 antiratón por muestra. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 20 microlitros de células al número adecuado de pozos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos de acuerdo con el protocolo de tinción de citometría de flujo experimental, y agregue 20 microlitros de la mezcla de tetramet de proteína E a cada pocóptil para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
Al final de la incubación, agregue los anticuerpos de la superficie celular de interés a las células para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz. A continuación, lave las células dos veces con 200 microlitros de tampón FACS por lavado, y resuspender cuidadosamente las células en cada pozo con 200 microlitros de tampón FACS fresco. A continuación, almacene las muestras en cuatro grados centígrados, protegidos de la luz, hasta su análisis en un citómetro de flujo.
Los síntomas patológicos y los signos como la mieloparálisis y la paraparesia motora se observan en el receptor alfa/beta de interferón 1 náuculo de ratones nocaut siete días después de la inoculación con el virus del Zika. Los cambios de peso en el interferón infectado alfa/beta receptor 1 knockout animales fueron monitoreados durante 15 días, con pérdida de peso observado por primera vez cuatro días después de la infección y recuperación de peso a partir del día siete post-infección. Imágenes representativas de cerebros murine infectados revelan edema e hiperemia evidentes siete días después de la inoculación con el virus del Zika.
Las imágenes representativas de los testículos infectados por el zika murino demuestran una reducción gradual del día siete a 30 días después de la infección. El análisis histopatológico de las secciones del cerebro y del tejido testicular infectados por el zika también ilustra el efecto de los cambios patológicos destructivos en comparación con los controles no infectados. Como se espera de los análisis macro e histopatológico, también se detectan altas cargas virales en el cerebro y en los testículos de ratones infectados por el virus del Zika mediante inmunosuchación.
Esto va acompañado de una robusta infiltración de células T CD3 positivas en el cerebro después de la infección por Zika. Los linfocitos T CD3 positivos en CD8 y CD8 específicos del virus del Zika se detectan tanto en ratones infectados por el virus del Zika como inmunizados con vacunas mediante tinción de tetrámeros de proteínas electrónicas. Las células T CD8 positivas específicas de la proteína e también se pueden detectar en el cerebro y analiza siete días después de la inoculación con el virus del Zika.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el estudio de la caracterización de células T específicas de patógenos en órganos inmunoprevalentes durante las infecciones naturales en modelos animales. Este método también se puede aplicar a otros órganos inmuno prevalentes, como la placenta u ojo, así como tanto a la infección viral como al cáncer. Después de este procedimiento, los tetrámeros MHC-I se pueden utilizar para la detección inmunohistoquímica o inmunofluorescente de células T específicas de patógenos para acceder a la distribución de células T cerebrales o testículos que se infiltran.
