Name: evaluation of zika virus-specific t-cell responses in immunoprivileged organs of infected ifnar1-/- mice
Uploaded: 2018-10-17T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice at JoVE.com

Yazarlar Gary Wong İngilizce Gözden geçirme için teşekkür ederiz. Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (grant 2017YFC1200202) tarafından desteklenmiştir Binbaşı özel projeler için bulaşıcı hastalık araştırma Çin (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao önde gelen bir yürütücü Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin yenilikçi araştırma grubu (grant 81621091) olduğunu.

Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Ulusal Enstitüsü tarafından Viral hastalık kontrol ve önleme, Çin CDC için kabul edildi. Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan iletişim kuralları takip yapıldı.
1. virüs enfeksiyonu
<ol><li>Tutmak yetişkin (6-8 haftalık) standart özel durumlarda patojen-Alerjik (SPF), Ifnar1- / - (% 50 erkek ve %50 kadın) fareler ve gıda ve su düzenli erişime izin.</li>
	<li>Ifnar1- / - fareler ZIKV ile ZIKV 100 µL 1 x 104 odak oluşturan birimler (FFUs) virüs içeren bir fosfat tamponlu tuz (PBS) arabelleği bir retro-orbital aşılama ile enfekte. Benzer şekilde, kontrol fare eşit bir PBS hacmi ile sağlar. Dikkat: ABSL2 koşullar altında fare bulaştırmak ve Biyogüvenlik kabini virüs bulaşmış fareler ile bu işlemleri gerçekleştirmek.</li>
	<li>Ağırlık ve klinik belirtileri (titreme, sendeleyerek Mart, ikili sarkık hind bacak) fareler her gün 15 gün boyunca izlemek.</li>
</ol>2. ZIKV aşısı ile bağışıklama
<ol><li>6 ila 8 hafta-in yaş arasında Ifnar1- / - (% 50 erkek ve %50 kadın) fare kullanın. Fareler standart SPF koşulları 18 – 29 ° C ve 12 h ışık/karanlık döngü erişim ile yiyecek ve su bulundurun.</li>
	<li>ZIKV aşı ile Ifnar1- / - fareler bağışıklık: AdC7-M/e 100 µL enjekte [4 x 1010 (virüs parçacıkları)] 23-G iğne ile 1 mL şırınga kullanarak bir kas içi enjeksiyon (sohbet yoluyla) yolu ile PBS içinde tampon.</li>
	<li>Benzer şekilde, kontrol fare eşit bir PBS hacmi ile enjekte et.</li>
</ol>3. monosit dalak üzerinden yalıtım
Not: Dalak üzerinden monosit yalıtım16daha önce belirtildiği gibi anlatılan.
<ol><li>Bir % 5 isoflurane concentrationin % 100 oksijen (ile bir akış hızı 1 L/dak) kullanarak aşılı ve ZIKV enfekte fareler 7 d sonrası aşılama anestezi. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. O zaman, hemen tüm fare % 75 etanol daldırma. Dikkat: Bu adıma ileri doğru tüm deneysel prosedürler aseptik bir Biyogüvenlik kabini yapılmalıdır.</li>
	<li>İğne kullanarak, (ötenazi, daha önce enfekte/aşı) fareler ekstremitelerin yukarı dönük olacak şekilde karın ile köpük plaka üzerinde düzeltmek.</li>
	<li>İçin steril neşter ile toraks karın orta çizgi boyunca deriyi kesme, karın kasları makasla kesip, karın boşluğu ortaya çıkarmak ve karaciğer yavaşça çıkarın. Not: Uzun, koyu kırmızı soldaki mide dalak organdır.</li>
	<li>Dalak kaldırmak, durulayın herhangi bir kan kaldırmak ve 1,5 mL buz gibi Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI) yerleştirmek için PBS 3 x. Dalak buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bir tek hücre süspansiyon dalak üretmek için organ(s) bir steril 40 µm gözenekli hücre süzgeç 50 mL tüp üzerine yerleştirin ve buz gibi RPMI orta içeren % 10 fetal Sığır serum (FBS) 2 mL ekleyin. 5 mL şırınga pistonu kullanarak, mekanik olarak organ(s) püre ve orta geçmeden org tam mesh yere ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Bir kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek (NH4Cl, Na2EDTA ve KHCO3 Tablo reçetesigörmek;) 5 mL içeren hücreleri resuspend ve 5-6 dakika oda sıcaklığında lizis tepki kuluçkaya.</li>
	<li>Buz gibi RPMI/FBS orta 10 mL ile RBC lizis durdurmak ve tüp vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Tam RPMI Orta (RPMI ile % 10 vol/vol FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 10 mL hücrelerle resuspend. 10 µL hücre süspansiyon için küçük bir tüp transfer % 0,4 wt/vol trypan mavi 10 µL ile karıştırın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
</ol>4. beyin ve testis monosit yalıtım
<ol><li>%5 isofluranein % 100 oksijen (ile bir akış hızı 1 L/dak) kullanarak erkek fareler ZIKV enfekte 7 d sonrası aşılama anestezi. Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. O zaman, hemen tüm fare % 75 etanol daldırma. Dikkat: Bu adımından itibaren tüm deneysel prosedürler aseptik bir Biyogüvenlik kabini gerçekleştirilmelidir. Monosit beyin ve testis yalıtım17daha önce belirtildiği gibi anlatılan.</li>
	<li>(Ötenazi, daha önce virüslü) erkek fare yüzükoyun bir kesme tahtası üzerinde hareketsiz.</li>
	<li>Kafa derisi bir düz 1 x 2 diş forseps ile güvenli ve Iris makas bir ensizyon kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi üzerinde yapmak için kullanın.</li>
	<li>Yörüngeleri iki yüzü keskin cımbızla klamp ve beyin tamir. Bir ucu keskin Iris makas deliği magnum yerleştirin ve yanal kafatası kesti. Diğer taraf için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Kullanım dikkatle üzerinden yukarı doğru burun orta hat aynı kavite kesmeye Iris makas keskin. Makas sonuna kadar beyin yaralanmasına önlemek mümkün olduğunca yüzeysel tutmaya çalışın.</li>
	<li>Beyin forseps ile Asansör ve keskin Iris makas kranial sinir lifleri dikkatle incelemek için kullanın. Forseps ile beyin çıkarın ve buz gibi RPMI/10% FBS orta 5 mL içeren bir 15 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
	<li>Karın deri forseps ile kapmak ve deri ve karın duvarı üzerinden boyuna bir kesi yapmak ve karın altın parçası ortaya çıkarmak için keskin Iris makas kullanın. Testis belgili tanımlık kesme kadar itin. Yavaşça yağ katman cımbızla çekin ve her iki tarafta bir küresel testislerden ortaya çıkarmak.</li>
	<li>Yağ tabakası ve epididim dikkatle incelemek için kullanın keskin Iris makas. Testis forseps ile buz gibi RPMI/10% FBS orta 5 mL içeren bir 15 mL tüp yerleştirin.</li>
	<li>Bir tek hücre süspansiyon beyin veya testis üretmek için organ bir steril hücre süzgeç üstünde tepe-in 50 mL tüp 100 µm Fileli yerleştirin ve buz gibi RPMI/10% FBS Orta 2 mL ekleyin. 5 mL şırınga pistonu kullanarak, organ püre ve orta geçmeden org tam mesh yere ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>5 mL % 30 yoğunluk gradient orta de içeren hücreleri resuspend ve daha sonra onları çok yavaş 2 mL % 70 yoğunluk gradient orta 15 mL tüp içinde ekleyin.</li>
	<li>Fren geçiş ve orta katman üzerinden lenfositler vasıl 800 x g 30 dk. elde edilir 4 ° C'de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Interphase taze bir 15 mL tüp transfer için 10 mL soğuk RPMI/10% FBS orta ekleyin ve tüp vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Buz gibi RPMI/FBS orta 10 mL içeren hücreleri resuspend ve onları vasıl 600 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Tam RPMI orta 10 mL içeren hücreleri resuspend ve olduğu gibi adım 3.9 hücreleri saymak.</li>
</ol>5. tetramer hazırlık
<ol><li>H-2Bb biotinylated site etiketi ile ekstrasellüler etki α3 etki alanı ve β2m C terminus üzerinde bir NdeI ve XohI kısıtlama sitesi18ile pET28a vektör kullanarak ifade plazmid oluşturmak.</li>
	<li>Hızlı ve20daha önce açıklandığı gibi H-2Bb ve β2m dahil organları hazırlar.</li>
	<li>
Renature ve MHC/peptid kompleksi H-2Bb-E294-302arındırmak.
	<ol>
<li>200 mL refolding çözeltisi [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-Na, 5 mM GSG ve 0,5 mM GSSG] hazırlamak. Proteaz inhibitörleri ekle: phenylmethylsulphonyl florür (PMSF, stok 100 mM), pepstatin (hisse senedi 2 mg/mL) 100 µL ve leupeptin (hisse senedi 2 mg/mL) 100 µL 2 mL. Arabellek için 30 dk 4 ° C'de ne yapıyorsun?</li>
		<li>H-2Bb, β2m ve peptid refolding ekleyin.<ol>
<li>Bir Ģırınga kullanarak guanidin çözeltilerine (30 mg/mL stok) çözünmüş β2m 500 µL enjekte. Bunun için 23 G iğne ile 5 mL şırınga kullanın ve β2m refolding çözüm damla damla içine enjekte. 4 ° C'de 150 devirde yavaş yavaş ve sürekli karıştırarak çözüm tutmak</li>
			<li>β2m refolding çözüm içinde çözünmüş sonra 2 mg E294-302 peptid DMSO 200 µL içinde çözmek ve hızlı bir şekilde bir pipet kullanarak refolding çözüm içine enjekte etmek. Yavaş yavaş çözüm 150 devirde 15 dakika 4 ° C'de ilave edin.</li>
			<li>H-2Bb guanidin çözeltilerine çözülmüş 1.5 mL enjekte. 8-10 h için 4 ° C'de H-2Bb refolding için 150 rpm'de dönen heyecan bar tutun. Not: Çözüm soğuk bir odada kapalı bir kutu içinde yerleştirildi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>10 kDa membran ile basınçlı bir odası refolded protein konsantre. Arabellek [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] odasına değişimi ve 30-50 mL son bir hacim için konsantre.</li>
		<li>Refolding çözüm bir santrifüj tüpü aktarmak ve 2500 x g 4 ° C'de 15 dakika de spin</li>
		<li>Dikkatle süpernatant 10 kDa santrifüj filtre aktarmak ve daha fazla 2.500 x g 30 dk için de 500 µL son hacmi için konsantre.</li>
		<li>Süpernatant aktarmak için taze bir tüp ve protein S200 ile 12.000 x g 15 dk. arındırmak için de sıralayacağız 10/300 GL ﬁltration Kromatografi jel.</li>
		<li>MHC kompleksi tepe toplamak ve 350 µL son bir hacim için konsantre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biotinylation için 500 µL tepki birim oluşturmak için aşağıdaki sıraya göre vekiller ekleyin: çözüm A 100 µL [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL çözüm B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), ilave d-biotin (500 µΜ biotin) 100 µL , 20 µL BirA enzim (60 µg), pepstatin (2 mg/mL) 0.5 µL ve leupeptin (2 mg/mL) 0.5 µL. Gecede 4 ° C'de tepki tüp kuluçkaya Dikkat: herhangi bir EDTA biotinylating tepki eklemeyin.</li>
	<li>Bir S200 kullanarak MHC arındırmak 10/300 GL jel filtrasyon sütun herhangi bir ilave biotin kaldırmak için.</li>
	<li>
Streptavidin kaymalı tahlil18biotinylating verimlilikle belirlemek.
	<ol>
<li>Üç örnek, A, B ve C, buz 30 dk için hazırlayın. Ardından, bir 10 oranında sonuçları çözümleyebilirsiniz SDS-sayfa. Örnek A 8 µL biotinylated MHC molekülleri ve Satım arabellek, örnek B-8 µL biotinylated MHC molekülleri ve streptavidin (20 mg/mL) ve örnek streptavidin (20 mg/mL) 2 µL C ve 8 µL Satım arabellek 2 µL 2 µL oluşur. Dikkat: örnek kaynatın değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multimers biotinylated MHC molekülleri oluştururlar.
	<ol>
<li>Phycoerythrin etiketli streptavidin bir köstebek oranında tüm biotinylated MHC molekülleri tam bir bağlama emin olmak için 1:5 ile biotinylated E294-302 peptid-H2Db karmaşık karıştırılarak tetramer üretmek.</li>
		<li>Streptavidin eşlenik tetramerization için gereken miktarını hesaplar.<ol>
<li>Protein konsantrasyonu ve molar ağırlık için muhasebe MHC/peptid kompleksi moles belirlemek (örnek: Toplam protein 1.8 mg 40 nmol =).</li>
			<li>MHC/peptid moles 5 tarafından bölünmesi ile gerekli streptavidin eşlenik moles hesaplamak (örnek: 40/5 8 nmol streptavidin eşlenik =).</li>
			<li>Streptavidin (µg) gerekli miktarını hesaplamak streptavidin eşlenik bağlı olarak (örnek: streptavidin-PE [300.000 g/M] → 8 gerekli nmol = 2.400 g).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Streptavidin-phycoerythrin 10 örnekleri bölün. Her örnek biotinylated E294-302 peptid-H2Db karmaşık, 20 dk aralığını içeren bir tüp ekleyin. Son örnek yükledikten sonra bir gecede karanlıkta 4 ° C'de tepki tüp kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Multimerized reaktifler bir 100 kDa spin tüpüne uygulamak ve 2.000 x g 4 ° c bir hacmi ile de Santrifüjü tarafından konsantre < 100 µL.</li>
	<li>Spin tüp 4 ml PBS (pH 8.0) kullanarak örnek sulandırmak ve tekrar konsantre < 100 µL.</li>
	<li>Arabellek Satım adım PBS (pH 8.0) tekrar 4 x.</li>
	<li>500 toplam birime tekrar doldurmak µL PBS (pH 8.0) kullanarak. Örnek 2-2,5 mg/mL tahmini bir konsantrasyon için 2.000 x g 4 ° C'de, konsantre Örnek 4 ° C'de karanlıkta saklamak</li>
</ol>6. akış sitometresi
<ol><li>Anti-antikorundan CD16/CD32 Fc-reseptör engelleme reaktif 20 µL (seyreltme faktörü 1: 200) 10 dakika başına 0.1 µL ile 4 ° C'de (Kimden adım 3,9 ve/veya adım 4,15) hücre süspansiyonlar belirsiz herhangi bir bağlama önlemek için kuluçkaya.</li>
	<li>20.000 x g için en az 15 dk 4 ° C'de de tetramer tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Hücre süspansiyon 20 µL her şey bir 96-şey platecontaining 1 x 106 hücrelere ekleme.</li>
	<li>Yeterli bir birim tüm deneysel tüpler leke E294-302 tetramer karışımı hazırlayın. Bu karışımı hesabına toplam hacminin % 15 aşırı pipetting hatalar için hazırlayın. FACS arabelleği (2 mg/mL, 1 µL/testi) E294-302 tetramers seyreltik (PBS, % 0.5 FBS) böylece 20 µL E294-302 tetramer karışımı her teste eklenir.</li>
	<li>E294-302 tetramer Mix 20 µL 96-şey plakasına ekleyin. Bu adımı yılı sonuna kadar her şey son hacim 40 µL.Incubate plaka karanlıkta 30 dk için oda sıcaklığında olmalıdır.</li>
	<li>Birincil antikorlar (FITC Birleşik veya APC Birleşik anti-CD3 (0.2 mg/mL), PerCP-Birleşik anti-CD8 (0.2 mg/mL)) 1 µL/testi hücre süspansiyon ekleyin ve sonra 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreler 2 yıkama x 2 mL FACS arabellek ve 600 x g 5 dakika süreyle şunlara dikkatlice süpernatant Aspire edin ve 200 µL FACS arabelleği hücrelerle resuspend santrifüj ile.</li>
	<li>Geçici olarak 4 ° C'de örnekleri karanlıkta akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.</li>
	<li>
Aşağıdaki gating strateji akış sitometrik çözümleme için kullanın.
	<ol>
<li>Bir kapı üzerinde çapraz olarak kümelenmiş gömlek bir ileri dağılım (FSC) karşı tarafı dağılım (SSC) alan komplo tarafından oluşturun.</li>
		<li>O zaman, CD3 üzerinde kapı+ hücreleri yan dağılım (SSC) karşı tarafından CD3; ardından, CD3 üzerinde kapı+ CD8+ hücreleri; son olarak, CD8 anahat+ tetramer+ hücreleri19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. histopatoloji, ayirt ve immünhistokimya tahlil
<ol><li>
Histopatoloji tahlil
	<ol>
<li>ZIKV-enfekte Ifnar1- / - fareler 7 d sonrası aşılama beyin ve testis dokuların toplamak ve onları %4 tarafsız tamponlanmış formaldehit düzeltmek. Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.</li>
		<li>Doku içinde parafin gömün.</li>
		<li>5 mm bir vibratome kullanarak doku bölüm.</li>
		<li>Hematoksilen eozin (H & E) ile doku leke.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmmünhistokimya tahlil
	<ol>
<li>Deparaffinize, suyla temasa ve antijen-doku almak ilgili yordamlar dayalı bölümlerde anlatıldığı daha önce21.</li>
		<li>Doku bölümleri 10 min için % 3 H2O2 PBS (pH 7,6) ile tedavi ve % 1 sığır serum albumin (BSA) 10 dakika ile engellemek.</li>
		<li>Fare Anti-fare CD3 antikor doku bölümlerle kuluçkaya (seyreltme: 1/1000) Oda sıcaklığında 8 h ve sonra onları gecede 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PBS kurcalayarak durulama ve sonra onları biotinylated ikincil antikor ile 3 damla kuluçkaya (seyreltme: 1/1000) Oda sıcaklığında 2 h için takip avidin-biotin-peroksidaz tarafından 3 damla (seyreltme: 1/200), oda sıcaklığında 30 dakika.</li>
		<li>Bağlama, 30, 3 damla ile 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (seyreltme: 1/1000),22daha önce açıklandığı gibi.</li>
		<li>Mayer'ın hematoksilen doku bölümlerle counterstain.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ayirt tahlil
	<ol>
<li>Donmuş testis bölümleri (6 mm) için oda sıcaklığında 10 dakika kuruması.</li>
		<li>10 dakika buz gibi soğuk aseton ile düzeltmek.</li>
		<li>PBS bölümlerle 3 x için yıkama ve bunları engelleme bir arabellek ile engellemek (%1 BSA, % 0.3 Triton, 1 x PBS) 30 dk 37 ° C'de.</li>
		<li>Birincil antikor (Z6) doku bölümlerle kuluçkaya (20 µg/mL) 4 ° C'de bir gecede.</li>
		<li>PBS kurcalayarak durulama ve ikincil antikor uygulamak (seyreltme faktörü: 1/200) 37 ° C'de 1 h için</li>
		<li>PBS doku bölümlerle yıkama ve onları 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak çekirdekler için counterstain (seyreltme faktörü: 1/1000), üreticinin yönergeleri izleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Hazin, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computed+Tomographic+Findings+in+Microcephaly+Associated+with+Zika+Virus.">Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+diversified+Zika+viruses+imported+to+China,+2016.">Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016.</a> Protein &amp; Cell. 7 (6), 461-464 (2016).</li><li>Cauchemez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+Zika+virus+and+microcephaly+in+French+Polynesia,+2013-15:+a+retrospective+study.">Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study.</a> The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).</li><li>Turtle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+cell+responses+to+Japanese+encephalitis+virus+in+health+and+disease.">Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).</li><li>Dudley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rhesus+macaque+model+of+Asian-lineage+Zika+virus+infection.">A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection.</a> Nature Communications. 7, 12204 (2016).</li><li>Osuna, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+viral+dynamics+and+shedding+in+rhesus+and+cynomolgus+macaques.">Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-cell+immunity+against+the+emerging+and+re-emerging+viruses.">Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses.</a> Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).</li><li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cell+Immune+Response+in+Immunocompetent+Mice+during+Zika+Virus+Infection.">CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection.</a> Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).</li><li>Elong Ngono, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+Role+of+the+CD8++T+Cell+Response+During+Primary+Zika+Virus+Infection+in+Mice.">Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).</li><li>Marques, E. T. A., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tradition+and+innovation+in+development+of+a+Zika+vaccine.">Tradition and innovation in development of a Zika vaccine.</a> The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).</li><li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Chimpanzee+Adenovirus+Vaccine+AdC7-M/E+Protects+against+Zika+Virus+Infection+and+Testis+Damage.">Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage.</a> Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).</li><li>Jama, B. P., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+alloantigen-specific+T+cells+from+peripheral+blood.">Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).</li><li>Legoux, F. P., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide:MHC+tetramer-based+enrichment+of+epitope-specific+T+cells.">Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).</li><li>Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+Method+for+Isolating+and+Expanding+Invariant+Natural+Killer+T+Cells+from+Mouse+Spleen.">An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).</li><li>Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain.">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).</li><li>Altman, J. o. h. n. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Analysis+of+Antigen-Specific+T+Lymphocytes.">Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+murine+CTL+by+a+hepatitis+B+virus-specific+peptide+and+evaluation+of+the+adjuvant+effect+of+heat+shock+protein+glycoprotein+96+and+its+terminal+fragments.">Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments.</a> J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).</li><li>Valkenburg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preemptive+priming+readily+overcomes+structure-based+mechanisms+of+virus+escape.">Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).</li><li>Shang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor-initiated+testicular+innate+immune+responses+in+mouse+Leydig+cells.">Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells.</a> Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue:+example+staining+for+microglia+and+neurons.">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+identification+of+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus-specific+CTL+epitopes.">Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes.</a> The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).</li><li>Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+in+semen:+effect+on+human+reproduction.">Zika virus infection in semen: effect on human reproduction.</a> The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Causes+Testis+Damage+and+Leads+to+Male+Infertility+in+Mice.">Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice.</a> Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).</li><li>Li, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+2016+Clinical+Isolate+of+Zika+Virus+in+Non-human+Primates.">Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates.</a> EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

İmmunojenik T hücreli epitope hücresel bağışıklık patojenlere23karşı önemli bir rol oynar. Böylece, ZIKV özgü T hücreleri immunoprivileged organlarda tespiti doğal ZIKV bulaşmasına karşı T hücreli yanıt-e doğru anlamak için kritik bir metodoloji olduğunu. Bu arada, T-hücre yanıt algılama viral aşı etkinliği araştırmak için mükemmel bir araçtır. İşte, dalak, beyin ve testis ZIKV enfekte farelerin, immunodominant epitope E294-302 tetramer hazırlanması lenfositlerin yalıtım içeren deneyler, görselleştirmek için kapsamlı bir protokol göstermektedir ve ZIKV özgü CD8 tanınması+ T hücreleri immunoprivileged fareler ZIKV etkilenmiş organlarda.
Bir önceki çalışma canlı bir ZIKV veya kendi RNA ZIKV kan-testis bariyeri atlamak ve üreme sistemi24saat içinde kendisini çoğaltmak belirten meni erkek hastaların içinde algılanabilen gösterdi. Daha önce biz de ZIKV testis hasarına neden ve fareler25erkek kısırlığı yol gösterdi. ZIKV enfeksiyon viremi rhesus maymunları içinde yol açabilir ve viral RNA viseral organlar yanı sıra, merkezi sinir sistemi (MSS) tespit edilebilir. İmmünhistokimya ZIKV özgü antijenlere MSS ve birden çok periferik organlarda26sunuldu ortaya koydu. Ayrıca, fare modellerinde, sağlam bir antiviral CD8 ZIKV enfeksiyon neden olabilir+ T hücre yanıt olarak dalak ve CNS26.
Önceki çalışmaya göre bu çalışmada ZIKV özgü CD8 algılamak için sistematik yöntemleri kurar+ T hücre yanıt beyin ve testis, immunoprivileged sitelerdir. Virüs özgü T hücreleri ZIKV enfekte farelerin immunoprivileged organlarında işlevselliğini değerlendirmek önemlidir. ZIKV özgü CD8 algılamak için tetramers kullanımını+ T-hücre immunoprivileged organlarda yanıt büyük ZIKV enfeksiyonlar ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtlarını anlayışımızı geliştirmek. E294-302 tetramer kullanarak, virüs özgü T hücrelerinin beyin ve testis akış sitometresi tarafından koruma ve immunopathogenesis hücresel mekanizmaları ZIKV enfeksiyon sırasında araştırmak için izole. Bu arada, araştırmacılar CD8 fonksiyonları daha ayrıntılı araştırmaya yardımcı olur+ T hücreleri ZIKV kontrol etmek veya bu organların immunopathogenesis ZIKV enfeksiyon sırasında geliştirmek için.
Antijen spesifik fare CD8 analiz etmek için+ T hücre yanıt-e doğru immunoprivileged organlarda H-2Bb-E294-302 tetramer hazırlanan ve CD8 tespit+ T hücreleri tarafından akış sitometresi. Tetramers antijen spesifik T hücreleri tespit etmek için güçlü bir araç vardır. Burada, fluorochrome Birleşik streptavidin (APC, PE ve BV421) üç tür üretildi. APC, BV421 ve PE etiketli tetramers antijen spesifik T hücreleri, PE etiketli pMHC saptamak için hiçbir istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olsa da-ben tetramers en iyi sonuçlar vermiştir. Bu nedenle, PE etiketli tetramer bu çalışma kullanıldı. İlginçtir, PE etiketli H-2Bb-E294-302 tetramer üzerinde bağlı olarak, yüksek oranda antijen spesifik T hücrelerinin beyin ve geçiş yeteneği için kandan virüs özgü T hücrelerinin belirtmek testis tespit ettik immunoprivileged organları.
Ancak, bazı sınırlamalar Protokolü vardır. H-2Bb-E294-302 tetramer tetramer algılama MHC sınırlama üstünde bağlı olduğundan insan T-hücre algılama için kullanışlı değildir. İmmunodominant HLA-sınırlı peptidler tarama hala gereklidir. Ayrıca, retro-orbital enfeksiyonu ZIKV enfeksiyonu için etkilidir ama bazı araştırmacılar için uygun bir işlem olmayabilir. Böylece, enfeksiyon, periton, subkutan veya intravenöz, dahil olmak üzere diğer yolları da önerilir.
Burada açıklanan protokolünde monositler beyin ve testis yalıtım kritik bir adımdır. Yüksek kaliteli lenfositler elde etmek önemlidir; Bu nedenle, örneğin, radyal hız, taşlama doku gücünü ve beyin ve testis dokusu diseksiyon dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, için tetramer hazırlık, proteaz inhibitörleri (PMSF, pepstatin, leupeptin) bir protein bozulmuş üzerinden korurken yardımcı olur. Bu nedenle, bir proteaz inhibitörü refolding arabelleğe ekleyin ve arabellek tetramer hazırlama işlemi sırasında değişimi için mantıklı.
Sonuç olarak, biz Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organları için bir ZIKV enfeksiyon antijen spesifik T hücreli yanıt-e doğru saptamak için yöntemler mevcut. Bu platform yaygın olarak ortaya çıkan ve virüs hangi kan ve immunoprivileged organları arasındaki engelleri atlayabilir yeniden ortaya çıkan bağışıklık mekanizmaları araştırmak için uygulanabilir. Ayrıca, bu çalışmada gelecek gelişmeye aday aşılar ve immunotherapies önünü.

ZIKV ilk 1947 yılında Uganda bir febril rhesus makak izole bir sivrisinek kaynaklı flavivirus var. Son zamanlarda, ZIKV bir halk sağlığı acil, Amerika'nın ve onun beklenmedik bağlantı microcephaly ve Guillain-Barré sendromu1,2,3, hızlı yayılması nedeniyle olmuştur. Epidemiyolojik veri, ZIKV yaklaşık 1 4.000 başına Guillain-Barré sendromu nedeni olarak yetişkin4enfekte şüphelenmiştir. Ayrıca, ZIKV ve testislerde enfeksiyon/hasar fare modeli arasında bir ilişki, belirli koşullar altında ZIKV enfeksiyon kan-testis bariyeri atlamak ve sonunda erkek kısırlığı5 kurşun düşündüren gösterilmiştir . Bu bulgular koruyucu veya patolojik bağışıklık yanıtı indüksiyon ZIKV enfeksiyon sırasında büyük bir anlayışla önemini vurgulayın.
Çok ZIKV hücresel bağışıklık yanıtlarını hakkında öğrenilmesi gereken kalır. CD4+ ve CD8+ T hücre kapsid, zarf ve mekansal protein 1 (NS1) yanıt ZIKV enfekte maymunlar ve insanlar6,7,8' de görülmektedir. Farelerde, çeşitli çalışmalar göstermiştir bu CD8+ T hücre ZIKV çoğaltma9,10,11kontrolünde koruyucu bir rol oynamaktadır. Önemlisi, Jurado vd. ZIKV enfeksiyon kan - beyin bariyerini dağılımı ve CD8 perivasküler infiltrasyon sonuçları gösterdi+ Ifnar1- / - fareler testis içinde efektör T hücreleri. Ayrıca, onlar gösterdi ki CD8+ T hücre ZIKV ilişkili paralizi uyanmaya ve neonatal beyin immunopathology bir rol oynamaya görünür. Bir önceki çalışmada, ZIKV-E294-302 tetramer hazırlanan ve gösterdi o ZIKV özgü CD8+ T hücreleri mevcut beyin ve omurilik kordonlar farelerin tasarımı için önemli sonuçları olabilir ZIKV enfekte Ifnar1- / - , ve ZIKV aşılar10gelişimi.
Aşı ZIKV enfeksiyonu önlemek için acil bir ihtiyaç yanıt olarak, çeşitli aşılar geliştirme, RNA aşıları, vektör tabanlı rekombinant aşı ve saf protein alt birimi aşılar gibi preklinik aşamasında bulunmaktadır. Plazmid DNA faz 1 klinik çalışmalarda12' aşıdır. Emanet değerlendirilmesi ve ZIKV aşı etkinliği, bu nedenle önemlidir. Aşılar bir avantajı ZIKV karşı koruma için önemli olabilir belirli T hücreli yanıt temin için onların yeteneğidir. ZIKV türetilmiş T-hücre epitope ile ilgili tetramers kullanarak, adenovirus vektör tabanlı ZIKV aşı tarafından indüklenen T-hücre immunoreactivity aşılı farelerde tespit edilemedi ve M ve E glikoproteinlerin sağlam antijen spesifik CD8 ikna etmek için gösterildi+ T-hücre immunoreactivity13.
Bir virüs enfeksiyonu sırasında ana bilgisayar14korumak için önemli bir T-hücre-aracılı mekanizma MHC kompleksi (MHC) molekülleri için T-hücre reseptör (TCR) tarafından sunulan peptid antijenleri bilinmesidir. Bu teorisi dayalı, tetramer teknoloji antijen spesifik T hücreleri bağışıklık yanıtı15düzenlenmesinde oynamak rolleri aydınlatmak için eşsiz bir araçtır. Bu iletişim kuralı ZIKV enfeksiyonlar için Ifnar1- / - fare modeli kurulması ve reaktif T hücreleri dalak, beyin ve testis farelerin tespiti tetramer teknolojisini kullanarak açıklar. Ayrıca, ZIKV-E294-302 tetramer algılamak ve T-hücre immunoreactivity aşılı farelerde ZIKV aşı (AdC7-M/E) tarafından indüklenen değerlendirmek için kullanılır. Bu çalışmada T-hücre yanıt immunoprivileged organlarda soruşturma ile ilgili yönergeler sağlar ve plasenta veya fetal beyin potansiyel uygulamalar için bir referans sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1007px;" width="1006">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Z6</td>
			<td style="width:131px;">our lab</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:475px;">Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD3</td>
			<td style="width:131px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:185px;">sc-1127; RRID: AB_631128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)</td>
			<td style="width:131px;">ZSGB-BIO</td>
			<td style="width:185px;">ZF-0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated</td>
			<td style="width:131px;">CWBIO</td>
			<td style="width:185px;">CW0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">17A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">APC anti-mouse CD3</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">100236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PerCP anti-mouse CD8a</td>
			<td style="width:131px;">Biolegend</td>
			<td style="width:185px;">100732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:185px;">P8370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:131px;">Ameresco</td>
			<td style="width:185px;">0754-5G</td>
			<td>Toxic and corrosive reagent. 
			Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">S4762-FZ</td>
			<td>Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and&#160; stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:185px;">P4265-5MG</td>
			<td>5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:185px;">L8511</td>
			<td>5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at - 20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:131px;">Scilight-peptide</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Must be resuspended in DMSO and stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:131px;">Hyclone</td>
			<td style="width:185px;">SH30809.01</td>
			<td>Must be stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:131px;">MP</td>
			<td style="width:185px;">219605590</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">APC-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554067</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554060</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PE-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">554061</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BV421-Streptadivin</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td style="width:185px;">563259</td>
			<td>Must be stored and maintained at 
			4&#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PageRuler Unstained Protein Ladder</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:185px;">26614</td>
			<td>Must be stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Strainers</td>
			<td style="width:131px;">BF</td>
			<td style="width:185px;">BF10-5040</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amicon Ultra 100kDa</td>
			<td style="width:131px;">Millipore</td>
			<td style="width:185px;">UFC510024</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Cantol</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td style="width:131px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:185px;">28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AKTA PURE</td>
			<td style="width:131px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">red blood cell lysis buffer</td>
			<td style="width:131px;">Solarbio</td>
			<td style="width:185px;">R1010</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zika virus-specific t-cell responses in immunoprivileged organs of infected ifnar1-/- mice

Zika virüs (ZIKV) iltihap immunoprivileged organlarda (Örneğin, beyin ve testis), Guillain-Barré sendromu için önde gelen ve testis zarar neden olabilir. ZIKV ile bir enfeksiyon sırasında bağışıklık hücreleri doku sızmak için gösterilmiştir. Ancak, koruma ve/veya immunopathogenesis bu bağışıklık hücrelerinin ZIKV enfeksiyon sırasında tanımlamak hücresel mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmeyen vardır. Burada, bu immunoprivileged organların farelerin ZIKV bulaştırmak virüs özgü T-hücre işlevindeki değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemler içerir bir) bir ZIKV enfeksiyon ve aşı aşı Ifnar1 farelerde;- / - b) histopatoloji, ayirt ve bulmak belgili tanımlık virüs enfeksiyonu ve inflamasyon beyin, testis ve dalak için immünhistokimya deneyleri; c) ZIKV elde edilen T-hücre epitopları tetramer hazırlanması; d) ZIKV özgü T hücreleri beyin, testis ve dalak izole monosit tespiti. Bu yaklaşımları kullanarak, immunoprivileged organları sızmış antijen spesifik T hücreleri tespit etmek ve bu T hücrelerinin işlevler enfeksiyon sırasında değerlendirmek için mümkündür: potansiyel bağışıklık koruma yolu ile virüs temizleme ve iltihap azdırmak için/veya immunopathogenesis. Bu bulgular da katkı ZIKV karşı aşı indüklenen T hücrelerinin netleştirmek için yardımcı olabilir.

Bu yöntemler ZIKV enfeksiyonlar için bir fare modeli geliştirdik. Ifnar1- / - fareler 6 – 8 hafta-in yaş, 1 x 104 odak oluşturan birimler ile (FFU) ZIKV retroorbital enjeksiyonu ile bulaşmış. Patolojik belirtiler ve işaretleri (Şekil 1A) yanı sıra kilo değişiklikleri (Şekil 1B), Ifnar1- / - fareler ZIKV ile bir enfeksiyon sonra tespit edildi. Fare beyni belirgin ödem ve hiperemi (Şekil 1C) gösterdi. Bu arada, testis yavaş yavaş küçüldü (Şekil 1D). Ayrıca, patolojik değişiklikler ve doku imha beyin ve testis (Şekil 2A) bulunamadı. ZIKV beyin ve testis (Şekil 2B) algılamak için bir ayirt tahlil yapılır. Viral yük beyin ve testis immunostaining (resim 2B) tarafından tespit edildi. İmmünhistokimya gösterdi CD3 sağlam bir infiltrasyonu+ T hücreleri farelerin beynine ZIKV (Şekil 2C) ile enfeksiyon sonra.
Bir fare MHC hazırladığımız algılamak ve ZIKV özgü T-hücre yanıtları değerlendirmek için-ben H-2Bb-E294-302 tetramer. 294-302 peptid E ve H-2Bb renature düzgün yardımcı olabilir çözünür MHC yüksek miktarda verim-ı (Şekil 3A). Üst karakter tahlil biotinylation yüksek bir verimlilik (Şekil 3B) gözlenen. Daha sonra üç streptavidin Floresan (APC, PE ve BV421) - pMHC öğesini - ben tetramers ZIKV özgü T hücreleri (Şekil 3C) algılamak için üretildi. PE etiketli tetramer belirli CD8 algılamak için daha yüksek bir etkinlik vardı+ T hücre fark istatistiksel olarak anlamlı değildi ama APC ve BV421 etiketli tetramers için karşılaştırıldığında.
E294-302 tetramer kullanarak, ZIKV özgü T lenfositleri enfekte fareler dalak ZIKV (3.49 ± % 0.45) 7 d sonrası aşılama, akış sitometresi tarafından tespit ettik. Ayrıca, benzer şekilde, bölümünde bu iletişim kuralı, 4 hafta sonrası aşılama ile AdC7-M/E aşısı 3 açıklanan yöntemi, ZIKV özgü T lenfositler dalak (%1,36 6,89 ±) tespit edildi (Şekil 4).
Ayrıca, ZIKV enfeksiyon sonra beyin ve testis, gibi immunoprivileged organları içine sızmış lenfositler tespit ettik. Kapıları CD3 için seçmek için ayarlanmış+CD8+ T hücreleri, beyin ve testis toplam lenfosit. Yüksek bir oranı E294-302 tetramer özgü T hücrelerinin beyinde tespit edilemedi (CD3 %42.2+CD8+ T hücreleri) ve testis (CD3 %26,4+CD8+ T hücreleri) lenfositler (Şekil 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig1.jpg"> Resim 1 : Ifnar1- / - farelerde ZIKV enfeksiyon karakterizasyonu. Ifnar1- / - fareler 6 – 8 hafta-in yaş, ZIKV retroorbital iğne ile 104 odak oluşturan birim ile (FFU) enfekte ve PBS ile enjekte fareler hastalık bulaşmamış tek denetimleri kullanılmıştır. (A)Morfoloji ve (B) ağırlık değişiklikleri- / - virüslü Ifnar1 farelerin takip. Kırmızı oklar, Ifnar1- / - fareler myeloparalysis ve motor paraparesis ile enfeksiyon sonra sunulan gösterir. (C) beyin 7 d sonrası aşılama ve (D) testis 0, 7, 14 ve 30 gün sonrası aşılama hasat edildi. Beyin ve testis fareler gelen temsilcisi görüntüleri boyutlarını belirtmek için bir cetvel ile gösterilir. Hata çubukları ortalama ± SEM n temsil başına deney grubu başına 10 fare =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig2.jpg"> Resim 2 :, ZIKV ve beyin ve testis ZIKV enfekte Ifnar1- / - farelerin lenfosit. (A) Bu panel gösterir histopatolojik değişiklikler beyin ve testis ZIKV enfekte fareler negatif hakim olmak vasıl 7 d sonrası aşılama ile karşılaştırıldığında üzerinden. Ölçek çubuğu = 25 µm (sol paneli) ve 50 µm (doğru kapı aynası). (B) bir ayirt tahlil anti-ZIKV Z6 antikor (yeşil) gerçekleştirildi. Bütün doku örneklerinde ZIKV enfekte fareler, 7 d sonrası aşılama üzerinden toplanmıştır. Çekirdeklerin DAPI ile (mavi) lekeli. Ölçek çubuğu 50 µm. (C) immünhistokimya gösterir CD3 sağlam bir infiltrasyonu =+ T hücreleri beyin ve testisin içine. Ölçek çubuğu = 25 µm (sol paneli) ve 50 µm (doğru kapı aynası). Mor hematoksilen gösterir, kahverengi CD3 antikor temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig3.jpg"> Şekil 3 : ZIKV özel pMHC hazırlanması-ben tetramers. (A) E294-302 H-2Bb için bağlayıcı aydınlatılmamıştır vitro refolding tarafından. Mavi H-2Bb-E294-302 protein gösterir. Turuncu peptid olmadan olumsuz denetim temsil eder. (B) Bu panel H-2Bb-E294-302 üst karakter tahlil gösterir. (C) sahte bir PBS denetim temsil eder. Üç streptavidin Floresan (APC, PE ve BV421) - pMHC öğesini - ben tetramers ZIKV özgü T hücreleri tespit etmek için kullanılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig4.jpg"> Şekil 4 : Virüs özgü CD8 sitometrik analizinde akışı + ZIKV-enfekte ve aşı-aşı fareler dalak T hücreleri. 6-8 hafta-in yaş, Ifnar1- / - fareler bir tek doz 4 x 1010 viral parçacıkların AdC7-M/E veya PBS bir negatif kontrol olarak alınan veya 104 odak oluşturan birim ile (FFU) ZIKV da bulaşmış. 7 gün sonrası enfeksiyon veya 4 hafta sonrası aşı sonra fare splenocytes hasat ve akış sitometresi tarafından analiz. Ortalama ± SD istatistiksel analiz tek yönlü ANOVA kullanarak gerçekleştirilen gibi verileri görüntülenir (önemli değil: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ***P < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58110/58110fig5.jpg"> Şekil 5 : Virüs özgü CD8 strateji ve temsilcisi sonuçlarını çoğunluğuna+ T Beyin ve testis farelerin ZIKV enfekte hücreleri. Beyin ve (B) testis temsilcisi araziler infiltre lenfositler(a)için gösterilir. Gates bir arkaya lenfoid-dağılım+ ve CD3 seçmek için küme+ olaylar. Bu, CD8+ olaylar epitope özgü T hücre analizi için geçişli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58110/58110fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice at JoVE.com

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Zika virüs enfeksiyonu sırasında, T hücreleri virüs ortadan kaldırılması için immünoayrıcalıklı organlara sızabilir ama aynı zamanda guillain-Barre sendromu veya testis yaralanması gibi immünopatogenez katkıda bulunabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hem Zika virüsü enfeksiyonu sırasında hem de aşı aşısı sonrası immünojen ekibe özgü t hücrelerinin tetramer bazlı olarak saptanmasıdır. Bu modelde, Zika virüs enfeksiyonu interferon alfa / beta reseptör nakavt fareler de başlatılan, beyinde Zika virüsüne özgü T hücrelerinin izlenmesine izin, testisler, ve dalak.Tetramer boyama yaklaşımı kullanarak, immünkoruma ve immünopatojenik hücrelere T-hücre katkılarını araştırmak için Zika virüsüne özgü T hücrelerine sızan immünoayrıcalıklı organın sadece özelliklerini araştırmak mümkündür. Zika virüs enfeksiyonu için, altı ila sekiz haftalık interferon alfa/beta reseptör nakavt farelere retro-orbital aşılama yoluyla PBS'nin 100 mikrolitresinde zika virüsünün dört odak oluşturan birimine 10 kez teslim edin. Daha sonra, 15 gün boyunca günlük enfekte hayvanların ağırlığı ve klinik belirtileri izleyin.Yedi gün sonra aşı, cerrahi bir köpük üzerinde supine pozisyonda enfekte hayvan güvenli, ve karın orta hattı boyunca bir deri kesi yapmak için steril bir neşter kullanın. Karın kasları açmak için makas kullanın, ve yavaşça karaciğer ayıklamak. Sonra, dalak çıkarın ve kan kaldırmak için PBS üç kez doku durulayın.Son yıkamadan sonra, dalağını 1,5 mililitre buz üzerinde, tüm dalaklar toplanana kadar buz üzerine yerleştirin. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, 50 mililitrelik bir tüpün üzerine steril, 40 mikrometrelik kafes hücresüziçine dalak yerleştirin ve süzgeçe %10 fetal sığır serumu veya FBS ile takviye edilmiş iki mililitre buz gibi RPMI ortamı ekleyin. Daha sonra, beş mililitrelik şırınganın pistonlu kısmını kullanarak, serbest bırakılan hücreleri kafesten temizlemek için taze ortam kullanarak, sazdan gelen dokuyu filtreden geçirin.Santrifüj için tek hücreli süspansiyonu 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve peleti beş mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponunda yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında beş ila altı dakika sonra, ikinci bir santrifüj için 10 mililitre buz gibi RPMI artı FBS ile lysis durdurmak ve sayma için tam orta 10 mililitre pelet resuspend. Yedi gün sonra aşı, bir kesme tahtası üzerinde eğilimli pozisyonda bir ötenazi, enfekte, erkek fare immobilize ve düz bir-by-iki-diş forceps ile kafa derisi güvenli.Kafa derisi üzerinde bir orta hat kesi yapmak için iris makas kullanın, kafatası açığa, ve keskin cımbız ile yörüngelerin iki tarafını kenetlemek için keskin cımbız kullanın, beyin sabitleme. Foramen magnum içine keskin iris makas bir ucu yerleştirerek, her iki tarafta kafatası içine yanal kesilmiş. Dikkatle orta hatta kadar aynı boşluktan kesilmiş, burun doğru, beyin yaralanmasını önlemek için mümkün olduğunca yüzeysel olarak makas uçları tutmak.Forseps ile beyin kaldırın ve dikkatle kranial sinir lifleri incelemek için keskin iris makas kullanın. Daha sonra, beş mililitre buz gibi RPMI artı FBS içeren 15 mililitrelik bir tüp içine beyin aktarmak için forceps kullanın. Testisleri izole etmek için, forseps ile karın deri asansör, ve integument ve karın duvarı ile uzunlamasına bir kesi yapmak ve karın alt kısmını ortaya çıkarmak için iris makas kullanın.Testisleri kesiye kadar itin ve her iki tarafta küresel bir testis ortaya çıkarmak için yağ tabakasını yavaşça çekmek için cımbız kullanın. Yağ tabakasını ve epididimisi dikkatlice incelemek için iris makası kullanın ve testisleri beş mililitre buz gibi RPMI artı FBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hasat edilen dokulardan herhangi birinden tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, 50 mililitrelik bir tüpün üzerine 100 mikronluk bir kafesiçeren steril bir hücre süzgecine organı yerleştirin ve süzgeçe iki mililitre buz gibi RPMI artı FBS ekleyin.Beş mililitrelik bir şırıngadan gelen pistonu kullanarak, dokuyu püre haline getirin ve organ mesh ten tamamen topraklanmış olana kadar filtreyi taze orta ile yıkayın. Tek hücreli süspansiyonu santrifüj için 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve peleti %30 yoğunlukgradient ortamda beş mililitre deaskıya alın. Hücre çözeltisini yeni bir 15 mililitrelik tüpte %70 yoğunlukgradient ortamının iki mililitreüzerine dikkatlice katlayın ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjü ile ayırın.Daha sonra, iki yoğunluk degradesi arasındaki interfazhücreleri başka bir santrifüj için 10 mililitre soğuk RPMI artı FBS içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve toplama için 10 mililitre buz gibi RPMI/FBS peleti yeniden askıya alın. Akış sitometri sitometri ile hücreleri analiz etmek için, FACS tampon konsantrasyonunda 100 mikrolitre başına altı hücreye beş kez 10 hücreleri seyreltin ve hücre örnek başına 10 mikrolitre anti-fare CD16/CD32 bloke antikor ile hücre örnekleri kuluçka. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, deneysel akış sitometri boyama protokolüne göre 96 kuyulu, yuvarlak alt plakanın uygun sayıdaki kuyularına 20 mikrolitre hücre ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık kuluçka için her kuyuya 20 mikrolitre E-protein tetramet karışımı ekleyin.Kuluçka sonunda, ışıktan korunan dört santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için hücrelere ilgi hücre yüzeyi antikorları ekleyin. Daha sonra, yıkama başına 200 mikrolitre FACS tampon ile hücreleri iki kez yıkayın ve her bir kuyudaki hücreleri 200 mikrolitre taze FACS tamponuyla dikkatlice yeniden askıya alın. Daha sonra, numuneleri ışıktan korunan dört santigrat derecede, akış sitometresi üzerinde analiz edilene kadar saklayın.Zika virüsü ile aşılamadan yedi gün sonra interferon alfa/beta reseptör 1 nakavt farelerinde patolojik belirti ve miyeloparalizi ve motor paraparezi gibi bulgular gözlenmektedir. Enfekte interferon alfa/beta reseptör1 nakavt hayvanlarda kilo değişiklikleri 15 gün boyunca izlendi, kilo kaybı ilk enfeksiyon ve kilo kurtarma gün yedi post-enfeksiyon başlayan dört gün sonra gözlenen ile. Enfekte murin beyinlerinin temsili görüntüleri, Zika virüsü ile aşılamadan yedi gün sonra belirgin ödem ve hiperemi olduğunu ortaya koymaktadır.Murine Zika enfekte testislerinin temsili görüntüleri enfeksiyon sonrası yedinci günden 30 güne doğru kademeli bir küçülme olduğunu göstermektedir. Zika enfekte beyin ve testis doku bölümlerinin histopatolojik analizi de enfekte olmayan kontrollere göre yıkıcı patolojik değişikliklerin etkisini göstermektedir. Makro ve histopatolojik analizlerden beklendiği gibi, beyinde yüksek viral yükler de tespit edilir ve zika virüsü bulaşmış farelerin testislerinde immünboyama ile testisler de tespit edilmektedir.Buna Zika sonrası beyne sağlam bir CD3-pozitif T-hücre infiltrasyonu eşlik ediyor. Zika virüsüne özgü CD3-pozitif, CD8-pozitif T lenfositleri hem Zika virüsü neşrile hem de aşı-aşılı farelerde E-protein tetramer boyama ile saptanır. E-protein tetramer spesifik CD8-pozitif T hücreleri de beyinde tespit edilebilir ve zika virüsü ile aşılama dan sonra yedi gün testisler.Bu teknik, geliştirildikten sonra hayvan modellerinde doğal enfeksiyonlar sırasında immünoprevalent organlarda patojene özgü T-hücre karakterizasyonu çalışmalarında araştırmacıların önünü açmıştır. Bu yöntem aynı zamanda plasenta veya göz gibi diğer bağışıklık yaygın organlara uygulanabilir, hem viral enfeksiyon ve kanser. Bu prosedürü takiben, MHC-I tetramerleri beyin veya testis-infiltrasyon T hücrelerinin dağılımıerişmek için patojen-spesifik T hücrelerinin immünohistokimyasal veya immünofloresan tespiti için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...