Name: analyzing the size, shape, and directionality of networks of coupled astrocytes
Uploaded: 2018-10-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר, גרנט/פרס המספר: 14392.

כל ההליכים abode לפי הכללים הקנדי מכוני הבריאות מחקר ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת מונטריאול ועל שימוש הוועדה.
1. הכנת פרוסות המוח של עכברוש
<ol><li>להכין 1 ליטר של פתרון מבוסס-סוכרוז (טבלה 1) 1 ליטר של נוזל מוחי-שדרתית מלאכותי רגיל (כלנית חדד) (טבלה 2).<...

<ol>
	<li>Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+rhythmogenic+domains+defined+by+astrocytic+networks+in+the+trigeminal+main+sensory+nucleus.">Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus.</a> Glia. 66 (2), 311-326 (2018).</li><li>Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+calcium:+homeostasis+and+signaling+function.">Glial calcium: homeostasis and signaling function.</a> Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).</li><li>Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+glial+cells+contribute+to+motor+control?.">How do glial cells contribute to motor control?.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).</li><li>Verkhratsky, A., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+glial+cells.">Ion channels in glial cells.</a> Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).</li><li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes:+Functional,+Developmental,+and+Pathological+Implications+in+the+Brain.">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).</li><li>Montero, T. D., Orellana, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemichannels:+new+pathways+for+gliotransmitter+release.">Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release.</a> Neuroscience. 286, 45-59 (2015).</li><li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitters+travel+in+time+and+space.">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li><li>Augustin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anisotropic+panglial+networks+in+the+lateral+superior+olive.">Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive.</a> Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).</li><li>Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+astrocytic+networks+in+the+mouse+barrel+cortex.">Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).</li><li>Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+astroglial+networks+in+olfactory+glomeruli.">Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).</li><li>Morquette, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+astrocyte-dependent+mechanism+for+neuronal+rhythmogenesis.">An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).</li><li>Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+intrinsic+bursting+in+trigeminal+sensory+neurons+parallels+the+acquisition+of+mastication+in+weanling+rats.">Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).</li><li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+properties+of+astrocyte+gap+junction+coupling+in+the+rat+hippocampus.">Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).</li><li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain.">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).</li><li>Claus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barreloid+Borders+and+Neuronal+Activity+Shape+Panglial+Gap+Junction-Coupled+Networks+in+the+Mouse+Thalamus.">Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).</li><li>Cameron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Incubation+of+Acute+Neuronal+Tissue+for+Electrophysiology+and+Calcium-imaging.">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li><li>Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+profile+and+properties+of+sulforhodamine+101--Labeled+glial+cells+in+acute+brain+slices+of+rat+hippocampus.">Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments.">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).</li><li>Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+and+pannexin+hemichannels+in+brain+glial+cells:+properties,+pharmacology,+and+roles.">Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).</li><li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Ca(2)(+)+acts+as+a+mediator+of+communication+from+neurons+to+glia.">Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia.</a> Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).</li><li>Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+hemichannels+in+astrocytes:+a+novel+mechanism+of+glutamate+release.">Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.</a> Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+coupling+confers+isopotentiality+on+astrocyte+syncytium.">Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium.</a> Glia. 64 (2), 214-226 (2016).</li><li>Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+hippocampal+astrocytes+in+rat+brain+slices.">Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices.</a> Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).</li><li>Ransom, B. R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling,+without+dye+coupling,+between+mammalian+astrocytes+and+oligodendrocytes+in+cell+culture.">Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture.</a> Glia. 3 (4), 258-266 (1990).</li><li>Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+frequent+failure+of+lucifer+yellow+to+pass+between+two+electrically+coupled+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).</li><li>Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Tracer+Coupling+between+Pairs+of+Identified+Neurones+of+the+Mollusc+Lymnaea+Stagnalis.">Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis.</a> Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).</li><li>Griemsmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Panglial+Gap+Junction+Networks+in+the+Thalamus,+Neocortex,+and+Hippocampus+Reveals+a+Unique+Population+of+Glial+Cells.">Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329 (5991), 571-575 (2010).</li><li>Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+release+prostaglandin+E2+to+modify+respiratory+network+activity.">Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

קיימות מספר שיטות אלקטרופיזיולוגיות להערכת תפקודי צימוד בין האסטרוציטים23,24. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים מידע אודות הסידור האנטומי של רשתות astrocytic. מספר מחקרים הראו כבר כי "צבע - או מעקב-מצמד", כפי שנעשה כאן, מתרחשת רק בשבריר של מצמידים תאים שזוהו על-ידי שיטות...

מחקרים רבים תיארו איך הדיאלוג נוירון-אסטרוציט ברמה התאית תת או סינפטית יכול להיות השלכות פונקציות עצביים, העברה סינפטית. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים רגישים סביב פעילות. עצבית; למעשה, יש להם רצפטורים של נוירוטרנסמיטורים רבים כולל גלוטמט, גאבא, אצטילכולין ו- ATP (ראה הדעת שפורסמו בעבר-2,-3,-4). בתמורה, astrocytic תהליכים אלמנטים סינפטית ensheath וגם פעילות. עצבית השפעה, באתרים extrasynaptic על ידי ויסות הומאוסטזיס יוניים חוץ-תאית ושחרור מספר גורמים או משדרי כגון גלוטמט, D-סרין ו- ATP 5 , 6 , 7.
הרעיון כי האסטרוציטים יכול גם לווסת תפקוד ברמת הרשת התפתחה, עם ראיות כי צימוד astrocytic במרחב מוסדר, מקביל פילוח העצבית באזורים מאופיין אנטומי ברור מידור (כמו אזורים עם ייצוגים חושית), המציין כי האסטרוציטים נשלים כדי אחרים האסטרוציטים המשרתים את אותה הפונקציה ולא רק על אלה נמצאים בקרבת מקום. בזית מעולה לרוחב, למשל, רשתות astrocytic ביותר הם שכיוונו orthogonally על ציר ' tonotopic '8, ואילו glomeruli קליפת או olfactoty חבית, תקשורת בין האסטרוציטים הוא הרבה יותר חזק בתוך חביות או glomeruli חלש יותר בין סמוכים אלה9,10. בשני המקרים, הרשתות astrocytic הם שכיוונו לכיוון מרכז ה glomerule או חבית9,10.
לאחרונה הראינו כי פעילות astrocytic ממיקרו עצביים ירי על ידי הפחתת הריכוז של Ca חוץ-תאית2 + ([Ca2 +]e), ככל הנראה דרך שחרורו של S100β, Ca2 +-איגוד חלבון11. את האפקט הזה, שבו הודגם על אוכלוסיה של rhythmogenic טריגמינל נוירונים בחלק הגבי של חושי הראשי טריגמינל גרעין (NVsnpr, חשב לשחק תפקיד חשוב דור של תנועות masticatory), נובעת מהעובדה כי ירי קצבית בנוירונים אלו תלוי עקשן Na+ הנוכחי זה מקודם על ידי ירידות של [Ca2 +]e11,12. ירי קצבית בנוירונים אלו יכולים להיות שהפיק ". פיזיולוגית" גירוי של תשומות שלהם או ירידה מלאכותית של [Ca2 +]e. בהמשך הראינו כי צימוד astrocytic היה נדרש עבור ירי קצבית עצביים1. זה העלה את האפשרות כי רשתות astrocytic עלולה להיווצר חוסם תחומים פונקציונליים בו פעילות. עצבית יכול להיות מסונכרנת ומתואמת. כדי להעריך את השערה זו, נזקקנו קודם לפתח שיטה לתעד בקפדנות את הארגון של רשתות אלה בתוך NVsnpr.
מחקרים קודמים ברשתות astrocytic תיארו בעיקר את מידת צימוד מבחינת מספר הטלפון הנייד ואת צפיפות אזור מכוסה. ניסיונות כדי להעריך את הצורה של רשתות astrocytic ואת הכיוון של צבע-מצמד בוצעו בעיקר על-ידי השוואת גודל רשתות לאורך שני צירים (x ו- y) ב חבית קליפת9, ההיפוקמפוס13,14, 15, barreloid שדות של התלמוס16, לרוחב זית מעולה8, חוש הריח glomeruli10, קליפת14. בשיטות המתוארות כאן מאפשרים עבירות לא משוחדת של תאים עם תוויות ברשת הערכה של האזור שהם מכסים. פיתחנו גם כלים כדי להגדיר את הכיוון המועדף של צימוד בתוך רשת וכדי להעריך אם הכיוון המועדף הוא לכיוון המרכז של הגרעין או בכיוון אחר. לעומת שיטות השתמשו בעבר, פרוטוקול זה מספק אמצעים כדי לתאר את הארגון ואת כיוון ההדפסה של רשתות astrocytic במבנים כמו הגבי טריגמינל גרעין החישה העיקריים שאין ידוע אנטומי ברור מידור. במחקרים לעיל, כיוון רשת מתואר יחסים לפי צורת המבנה עצמו אשר מתועדת כבר (למשל., barreloid של התלמוס, חביות בקליפת, שכבות ההיפוקמפוס, קליפת המוח, glomeruli ב הריח הנורה, וכו '). בנוסף, מאפשרת ניתוח וקטורי להשוואות מצמד אוריינטציות חשף בתנאים שונים. כדי לנתח אם פרמטרים אלה משתנה בהתאם למיקום של הרשת בתוך הגרעין, גם פיתחנו שיטה כדי להחליף את כל רשת ביחס לגבולות של הגרעין. כלים אלה ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים לרשתות החקירה של תאים בשילוב.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6H12O6 Dextrose anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G45001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 anhydrous</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPTris Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTPTris Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenoxolone disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avidin-biotin complex : ABC kit</td>
			<td>Vestor laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidine-alexa 594</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>X5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Drying Bench</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-474-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide ColorFrost</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Fisherchemicals</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water-immersion lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X water-immersion lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFL20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X water-immersion lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLFLUOR4X/340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera CCD</td>
			<td>Sony</td>
			<td>CX-ST50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black and white monitor</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SSM-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>1322A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp amplifier</td>
			<td>Axon instrument</td>
			<td>Mulitclamp 700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology acquisition software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>pClamp 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology analysis software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Clampfit 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging analysis software</td>
			<td>ImageJFIJI</td>
			<td>Open source software. FIJI version including plug in package.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector image editor</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Illustrator CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet application</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Excel 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the size, shape, and directionality of networks of coupled astrocytes

זה הפך ליותר ויותר ברורה האסטרוציטים לווסת את תפקוד לא רק ברמות סינפטית, תא בודד, אלא גם ברמת הרשת. האסטרוציטים חריפה מחוברים אחד לשני דרך צמתי הפער והוא צימוד דרך יפלו דינמי ומוסדרת מאוד. קונספט המתעוררים הוא פונקציות astrocytic מיוחדים ומותאמים לפונקציות של מעגל עצביים שאליו הן משויכות. לכן, שיטות למדידת פרמטרים שונים של רשתות astrocytic נחוצים יותר לתאר את הכללים המסדירים את התקשורת שלהם, מצמד, להבין עוד יותר את הפונקציות שלהם.
כאן, שימוש בתוכנת ניתוח התמונה (למשל., ImageJFIJI), אנו מתארים שיטה לניתוח תמונות קונאפוקלית של רשתות astrocytic חשף זיווגו-צבע. שיטות אלה מאפשרים 1) האוטומטי לא משוחד זיהוי, של תאים עם תוויות, 2) חישוב של הגודל של הרשת, 3) חישוב כיוון מועדף של צבע להתפשט בתוך הרשת, ההגדלה והמיקום 4) של הרשת בתוך האזור בעל עניין .
ניתוח זה יכול לשמש כדי לאפיין את רשתות astrocytic של אזור מסויים, להשוות רשתות של אזורים שונים הקשורים לפונקציות שונות או להשוות רשתות שהושגו בתנאים שונים כי יש השפעות שונות על צימוד. תצפיות אלה עלולה להוביל חשוב בשיקולים פונקציונליים. למשל, אנחנו מנתחים את הרשתות astrocytic של גרעין טריגמינל, איפה אנחנו בעבר הראו כי צימוד astrocytic הוא חיוני עבור היכולת של נוירונים לעבור על דפוסי הירי של טוניק המתפרצת קצבית1. על ידי מדידת את גודל, כליאה, וכיוון מועדף של רשתות astrocytic בגרעין הזה, נוכל לבנות השערות לגבי התחומים הפונקציונליים הם circumscribe. מספר מחקרים מראים כי מספר המוח בתחומים אחרים, כולל חבית, זית מעולה לרוחב, חוש הריח glomeruli ולשגר את הגרעינים חושית תלמוס, קליפת הראייה, שם כמה, עשויה להועיל ניתוח דומה.

צימוד בין תאים במוח אינו סטטי אלא מעדיף באופן דינמי מוסדר על ידי גורמים רבים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לנתח רשתות astrocytic חשף בתנאים שונים, כדי להבין את הארגון שלהם ב- NVsnpr. תוצאות אלו היו כבר פורסם1. ביצענו biocytin מילוי האסטרוציטים יחיד בחלק הגבי של NVsnpr של שלושה מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes at JoVE.com

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הארגון של רשתות אסטרוציטים במבני המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציעה שיטה לא משוחדת לספור תאי תווית ולתעד את הארגון האנטומי שלהם בתוך מבנה מוגדר. פתחו את ImageJFIJI, בחרו בקובץ הרצוי ולחצו על הלחצן 'אשר' בחלון אפשרויות הייבוא של תבנית הביו.כדי להגדיר מחדש מחסנית Z שתכיל רק את הפרוסות האופטיות הדרושות לערימת Z הסופית, בחר תחילה פרוייקט STK ו- Z ולאחר מכן לחץ על ידית המחסנית ב סרגל הכלים. בחר בעוצמה מרבית בהגדרת סוג ההקרנה. שמור את הקובץ ותן לו שם לקובץ המחסנית.אם קובץ ההדמיה כולל מספר ערוצים, השתמשו בצבע תמונה ובערוצי פיצול כדי להציג רק את הערוץ עם תמונת הרשת האסטרוצטית. בדוק את הגדרות הפיקסל של התמונה על-ידי בחירת תמונה, מאפיינים, פיקסל, עם ממד פיקסל אחד. לאחר מכן השתמש בכלי חיסור הרקע על-ידי פתיחת תהליך וחיסור הרקע כדי להסיר תיוג ביוצטין ברקע.השתמש בפונקציית התצוגה המקדימה כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל, שבדרך כלל מוגדר ב- 50 פיקסלים. אם נדרשת הפחתת רעש נוספת לאחר שלב ההפחתה ברקע, בחר תהליך, רעש והסר חריגים. בחר בהיר בהגדרה החריגה, ולהשתמש בפונקציית התצוגה המקדימה כדי להגדיר את הרדיוס ואת הסף.היזהר באמצעות הכלי להסיר חריג, שכן הוא עלול לטשטש את הנתונים, כפי שמוצג כאן. התאימו את הסף באמצעות תמונה, התאימו, סף. בחר ברירת מחדל ואת מצב B ו- W.לחץ על החל. המירו את התמונה לתמונה בינארית בעזרת כלי התהליך הבינארי על-ידי בחירת תהליך, בינארי והפוך לקובץ בינארי. שמור את הקובץ כקובץ tiff ותן לו שם של קובץ בינארי.לספירת תאים, קבעו תחילה את סוג המדידה בלחיצה על נתח והגדרת מדידה. לאחר מכן בחר באפשרות centroid. ודא שהקובץ הבינארי פתוח על המסך.שוב, פתח את תפריט הניתוח, והפעם בחר לנתח חלקיקים. לאחר מכן, בחר הצגה וחלוקה לרמות. פעולה זו יוצרת קובץ חדש המציג את תוצאת הזיהוי.מטב את הפרמטרים כדי למקד את הזיהוי. כדי לזהות תאים בלבד, השתמש בערך גודל בין 30 ל- 6000, ועיגוליות בין אפס לאחד, כאשר אחד מגדיר עיגול מושלם ואפס צורה אקראית. הפעל את הזיהוי על-ידי לחיצה על אישור. יופיעו שתי טבלאות, סיכום שכותרתו טבלה המספקת את מספר התאים שזוהו וטבלה שכותרתה תוצאות המספקות את קואורדינטות X ו- Y של כל תא.העתק את הערכים והדבק אותם ביישום גיליון אלקטרוני. שמור טבלה זו תחת טבלת זיהוי השמות. כמו כן יופיע קובץ עם התוויה של תאים שזוהו.שמור קובץ זה כקובץ tiff תחת קובץ זיהוי השמות. אם קבוצה של שני תאים מסומנים בתווית או יותר מזוהה כתא יחיד עם הכלי לנתח חלקיקים, השתמש בכלי קו פרשת המים בתמונה הבינארית על-ידי בחירת תהליך, בינארי, קו פרשת המים לפני החלת הכלי חלקיקי ניתוח. כדי למדוד את שטח הפנים של הרשתות, השתמש בקובץ הזיהוי ב- ImageJ.שמאל לחץ על העכבר כדי לבחור את כלי בחירת מצולע בסרגל הכלים. לחץ שוב שמאלה כדי להתחיל ל איתר אזור מעניין, או ROI, המחבר את כל התאים הממוקמים בפריפריה החיצונית של הרשת. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסגור את המצולע.פתחו את חלון המדידה של קבעו ובחרו באפשרות האזור. לאחר מכן פתחו את מנהל ההשקעות והוסיפו את המצולע שעקבו אחריו במנהל ההשקעות על-ידי לחיצה על 'הוסף'. הפעל את המדידה על-ידי לחיצה על מדידה במנהל ההשקעות.מדידת האזור תופיע בטבלה ותתבטא בפיקסלים. אל תשכח להמיר ערך זה עם גורם המרה עבור המיקרוסקופ המשמש להשגת הערך במיקרומטרים מרובעים. פתח את קובץ המחסנית ב- ImageJFIJI וזהה את התא המדבק בעוצמת התיוג החזקה יותר שלו.לאחר מכן פתח את טבלת הזיהוי של הקובץ בשם ביישום גיליון אלקטרוני ולמצוא את המספר המשויך לתא המותק ואת הקואורדינטות המתאימות לו. אם אין אפשרות לקבוע במדויק את התא המדבק, השתמש בכלי המצולע כדי להקיף את האזור שבו הפיקדון של ביוצטין צפוף יותר, והתייחס למיקום זה כאל זה של התא המדבק. השתמש במנהל ההשקעות כבעבר כדי לצייר ROI במיקום התא המותק ולהוסיף אותו למנהל ההשקעות.לאחר מכן, קבעו את המדידה ובחרו באפשרות centroid. במנהל RIO, לחץ על מידה כדי להשיג את הקואורדינטות של המרכז של האזור שעקבו. השתמש בקואורדינטות אלה כנקודת ההתייחסות עבור רשת ספציפית זו.השתמש בנוסחה זו כדי לחשב את הקואורדינטות של כל תא בהפניה לאסטרוציטים המותק. הבעת הקואורדינטות של כל תא בהפניה לאסטרוציט המותק היא צעד חשוב לחישוב וקטור מהאסטרוציטים המותק. השתמש בנוסחה זו כדי לחשב את הקואורדינטות של הווקטור הראשי של כיוון מועדף.הווקטור העיקרי של כיוון מועדף של הרשת הוא הסכום של כל הווקטורים שחושבו בעבר עבור כל תא המורכב ברשת. חלק את אורך הווקטור הראשי במספר התאים ברשת, פחות אחד כדי לא לכלול את התא המדבק, כדי לנרמל את הערכים ולאפשר השוואות בין רשתות. כדי לקבוע את המיקום של כל רשת בגרעין העניין, פתח תחילה את ארבע תמונות ה- x באמצעות עורך תמונות וקטורי.הכפל את הממדים בחלון הממד בחמישה כדי להגדיל את התמונה four x. כאן, התמונה נדגמה ב 800 על ידי 800 פיקסלים, ולכן רזולוציית הדגימה משתנה ל 4000 על ידי 4000 פיקסלים. יצא את הקובץ בתבנית tiff ותן לו שם שגודלו השתנה לארבעה x.יישר את הפינה השמאלית העליונה של התמונה בגודל 4 x שגודלה השתנה עם הפינה השמאלית התחתונה של מסמך Adobe Illustrator. התוכנה מספקת קואורדינטות מנקודת התייחסות בפינה השמאלית התחתונה. פתח את תמונת 20 x של הרשת.השתמש בקובץ הבינארי או בקובץ הזיהוי מכיוון שקל יותר ליישר אותם. לאחר מכן, שחקו עם הכלי אטימות בקובץ הבינארי של התמונה בגודל 20 x כדי ליישר אותה עם ארבע תמונות x שגודלן השתנה. לאחר שהיישור נעשה, בחרו והחזיקו את הכלי pipette כך שכלי המידה יופיע ובחרו בו בסרגל הכלים השמאלי.השתמש בכלי המידה כדי ללחוץ בפינה השמאלית העליונה של התמונה 20 x כדי לקבל את הקואורדינטות של 20 x נקודת הקשר על גודל ארבע x תמונה. קואורדינטות ייחוסיות אלה של 20 x שימושיות להבעת המיקום של כל רשת בציור סכמטי של הגרעין. לסיכום הנתונים, נעשה שימוש בנורמליזציה של הגרעין כמלבן.לשם כך, השתמש בכלי מצולע כדי להקיף את הגרעין בתמונה בגודל 4 x שגודלה השתנה. לאחר מכן פתחו את מנהל ההשקעות והוסיפו את ההשקעה המצויר. השתמש בתמונה עם אורות שקופים אם לא ניתן לראות את גבולות הגרעין, במקרה זה זכור לשנות את גודלו תחילה.במדידה מוגדרת, בחרו באפשרות המלבן התוחמ לחישוב המלבן הקטן ביותר בתוך גרעין המצויר. לבסוף, לחץ על מידה ולאחר מכן בצע את השלבים בפרוטוקול הכתוב כדי לבטא את קואורדינטות התאים המסווים בגרעין מנורמל המיוצג על-ידי המלבן התוחמ. אסטרוציטים בודדים בחלק הגבי של הגרעין החושי הראשי התלת-מימדי, שכותרתו SR101, היו מיועדים להקלטה של תא שלם ומלאים בביוצטין של 0.2%.גירוי חשמלי של תיוג ביוצטין בדרכי החמישית גדל בחלק הגבי של גרעין החושים הראשי trigeminal, המייצג עלייה במספר התאים המרוכזים. רשתות אסטרוציסטיות נשארות מוגבלות בתוך החלק הגבי של הגרעין החושי הראשי הטריגמינלי והכיוון העיקרי שלהן. טכניקה זו פותחה כדי למקם רשתות אסטרוציטיות בתוך מבנה מוגדר, אך ניתן להשתמש בה כדי לבטא את המיקום של אוכלוסיית התא המסוויג בכל מבנה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

מידול צורה תלת מימדי וניתוח מבני המוח

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Reliable Acquisition of Electroencephalography Data during Simultaneous Electroencephalography and Functional MRI

רכישה אמינה של נתוני אלקטרואנצפלוגרפיה במהלך אלקטרואנצפלוגרפיה סימולטנית ו-MRI פונקציונלי

Simultaneous electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI), EEG-fMRI, combines the complementary properties of scalp EEG ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

הדמיה חיה של מערכת מיטוכונדריאלית באסטרוציטים מתורבתים

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...