Name: analyzing the size, shape, and directionality of networks of coupled astrocytes
Uploaded: 2018-10-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes at JoVE.com

Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık Araştırma tarafından Grant/ödül numarası finanse edilmektedir: 14392.

Tüm yordamlar tarafından Kanada Sağlık araştırma enstitüleri kuralları abode ve Montreal Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. sıçan Beyin dilimleri hazırlanması
<ol><li>1 litre sükroz tabanlı bir çözümü (Tablo 1) ve standart yapay beyin-omurilik sıvısı (aCSF) (Tablo 2) 1 litre hazırlamak.</li>
	<li>% 95'i O2 ve %5 CO2 (carbogen) için 30 dk karışımı ile sükroz taba...

<ol>
	<li>Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+rhythmogenic+domains+defined+by+astrocytic+networks+in+the+trigeminal+main+sensory+nucleus.">Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus.</a> Glia. 66 (2), 311-326 (2018).</li><li>Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+calcium:+homeostasis+and+signaling+function.">Glial calcium: homeostasis and signaling function.</a> Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).</li><li>Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+glial+cells+contribute+to+motor+control?.">How do glial cells contribute to motor control?.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).</li><li>Verkhratsky, A., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+glial+cells.">Ion channels in glial cells.</a> Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).</li><li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes:+Functional,+Developmental,+and+Pathological+Implications+in+the+Brain.">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers Neuroscience. 9, 499 (2015).</li><li>Montero, T. D., Orellana, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemichannels:+new+pathways+for+gliotransmitter+release.">Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release.</a> Neuroscience. 286, 45-59 (2015).</li><li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliotransmitters+travel+in+time+and+space.">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li><li>Augustin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anisotropic+panglial+networks+in+the+lateral+superior+olive.">Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive.</a> Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).</li><li>Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+astrocytic+networks+in+the+mouse+barrel+cortex.">Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).</li><li>Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+astroglial+networks+in+olfactory+glomeruli.">Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).</li><li>Morquette, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+astrocyte-dependent+mechanism+for+neuronal+rhythmogenesis.">An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).</li><li>Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+intrinsic+bursting+in+trigeminal+sensory+neurons+parallels+the+acquisition+of+mastication+in+weanling+rats.">Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).</li><li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+properties+of+astrocyte+gap+junction+coupling+in+the+rat+hippocampus.">Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).</li><li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain.">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).</li><li>Claus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barreloid+Borders+and+Neuronal+Activity+Shape+Panglial+Gap+Junction-Coupled+Networks+in+the+Mouse+Thalamus.">Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).</li><li>Cameron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Incubation+of+Acute+Neuronal+Tissue+for+Electrophysiology+and+Calcium-imaging.">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li><li>Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+profile+and+properties+of+sulforhodamine+101--Labeled+glial+cells+in+acute+brain+slices+of+rat+hippocampus.">Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments.">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).</li><li>Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+and+pannexin+hemichannels+in+brain+glial+cells:+properties,+pharmacology,+and+roles.">Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 88 (2013).</li><li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Ca(2)(+)+acts+as+a+mediator+of+communication+from+neurons+to+glia.">Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia.</a> Science Signaling. 5 (208), ra8 (2012).</li><li>Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+hemichannels+in+astrocytes:+a+novel+mechanism+of+glutamate+release.">Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.</a> Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+coupling+confers+isopotentiality+on+astrocyte+syncytium.">Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium.</a> Glia. 64 (2), 214-226 (2016).</li><li>Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+hippocampal+astrocytes+in+rat+brain+slices.">Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices.</a> Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).</li><li>Ransom, B. R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling,+without+dye+coupling,+between+mammalian+astrocytes+and+oligodendrocytes+in+cell+culture.">Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture.</a> Glia. 3 (4), 258-266 (1990).</li><li>Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+and+frequent+failure+of+lucifer+yellow+to+pass+between+two+electrically+coupled+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).</li><li>Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Tracer+Coupling+between+Pairs+of+Identified+Neurones+of+the+Mollusc+Lymnaea+Stagnalis.">Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis.</a> Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).</li><li>Griemsmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Panglial+Gap+Junction+Networks+in+the+Thalamus,+Neocortex,+and+Hippocampus+Reveals+a+Unique+Population+of+Glial+Cells.">Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329 (5991), 571-575 (2010).</li><li>Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+release+prostaglandin+E2+to+modify+respiratory+network+activity.">Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity.</a> eLife. 6, (2017).</li></ol>

Astrocytes23,24arasında kaplin fonksiyonel değerlendirmek için elektrofizyolojik yöntemlerle bir dizi vardır. Ancak, bu yöntemlerin astrositik ağlar anatomik yerleşimi hakkında bilgi sağlar. Çalışmalar bir dizi zaten "boya - veya izleyici-olarak kancası", burada, yalnızca bir kısmını içinde birleştiğinde düşündüren elektrofizyolojik yöntemleri25,26,27...

Birçok çalışma alt hücresel veya sinaptik düzeyinde nöron-astrocyte diyalog nöronal işlevleri ve sinaptik iletimi nasıl olabilir anlatmıştık. De astrocytes nöronal aktivite çevreleyen duyarlıdır kurulur; Aslında, onlar için glutamat, GABA, asetilkolin ve ATP (daha önce yayımlanmış değerlendirmeleri2,3,4bakınız) de dahil olmak üzere birçok nörotransmitter reseptörlerinin var. Buna karşılık, astrositik ensheath sinaptik öğeleri ve etkisi nöronal aktivite var ve extrasynaptic sitelerdeki ekstraselüler iyonik homeostazı düzenleyen ve çeşitli faktörler veya vericileri glutamat, D-serin ve ATP gibi serbest işler 5 , 6 , 7.
Astrocytes Ayrıca ağ düzeyinde nöronal fonksiyon modüle fikir, astrositik kaplin dağınık şekilde düzenlenmiştir ve karşılık gelen nöronal segmentasyon alanlarda açık anatomik tarafından karakterize kanıtlarla ortaya çıkmıştır Bölünebilme (gibi alanlarda duyusal temsilcilikleri ile), astrocytes diğer astrocytes aynı işlevi yerine sadece o kadar da yakın hizmet veren çift gösteren. İçinde varil korteks veya olfactoty glomeruli, astrocytes arasındaki iletişimi varil ya da glomeruli içinde çok daha güçlü ise yanal üstün olive, mesela en astrositik ağları uygun tonotopic eksen8' e, odaklı ve zayıf bitişik olanlar9,arası10. Her iki durumda da, astrositik ağlar glomerule veya varil9,10merkezine doğru odaklı vardır.
Biz son zamanlarda astrositik faaliyet nöronal ateş konsantrasyonu hücre dışı Ca2 + azaltarak gelen gösterdi ([Ca2 +]e), S100β, bir Ca2 +sürümü ile muhtemelen-protein11bağlama. Çekirdek (NVsnpr, masticatory hareketleri üretiminde önemli bir rol oynamaktadır düşünülen), sonuçları aslında trigeminal rhythmogenic nöronların trigeminal ana duyusal sırt kısmında bir popülasyondaki sunuldu bu etki bu Bu nöronlar ritmik ateş etmeye [Ca2 +]e11,12azalır tarafından teşvik bir kalıcı Na+ geçerli bağlıdır. Bu nöronlar ritmik ateş etmeye "fizyolojik" girişleri uyarılması veya yapay [Ca2 +]eazalma elicited. Biz daha fazla astrositik kaplin nöronal ritmik ateş1için gerekli olduğunu gösterdi. Bu olasılığını astrositik ağlar nöronal aktivite nerede senkronize ve koordine sinirlari belirli işlevsel etki alanları oluşturmak kaldırdı. Bu hipotezi değerlendirmek için ilk ciddi bir şekilde NVsnpr içinde bu ağların kuruluş belgelemek için bir yöntem geliştirmeye ihtiyacımız vardı.
Astrositik ağlarda önceki çalışmalar çoğunlukla kaplin cep telefonu numarasını ve yoğunluğu ve bölgeyi açısından ölçüde anlatmıştık. Astrositik ağlar şekli ve boya-kaplin yönünü değerlendirmek için girişimleri çoğunlukla iki eksen (x ve y) varil cortex9, hipokampus13,14, boyunca ağların boyutu karşılaştırarak gerçekleştirilmiştir 15, talamus16, yanal üstün zeytin8, koku glomeruli10ve korteks14barreloid alanlarında. Yöntem tanımlamak burada bir ağ etiketli hücrelerinin tarafsız sayıları ve çevrenin onlar kapağı bir tahmin sağlar. Ayrıca bir ağ içinde bağlantı tercih edilen yönünü belirtin ve tercih edilen yönlendirme merkezi çekirdeği veya farklı bir yöne doğru olup olmadığını değerlendirmek için araçlar geliştirdi. Önceden kullanılan yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu iletişim kuralı organizasyon ve dorsal trigeminal ana duyusal çekirdeği gibi bilinen bir açık anatomik var mı yapılarda astrositik ağlar yönünü açıklamak için bir yol sağlar. Bölünebilme. Yukarıdaki çalışmalarda, ağ yönlendirmesini şekil zaten belgelenen yapının kendisi bir ilişki olarak açıklanan (Örn., varil korteks, talamus barreloid katmanlar hipokampus ve korteks, glomeruli içinde olfaktör ampul, vb). Buna ek olarak, farklı koşullar altında ortaya yönelimleri kaplin karşılaştırmalar için vektörel analiz sağlar. Bu parametreler ağ çekirdek içindeki konumuna göre değişiklik olup olmadığını çözümlemek için Ayrıca her ağ referans olarak çekirdek sınırları değiştirmek için bir yöntem geliştirdi. Bu araçların kolayca diğer alanlar eşleşmiş hücre soruşturma ağlar için adapte edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6H12O6 Dextrose anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C70-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-gluconic acid potassium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G45001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 anhydrous</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPTris Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTPTris Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenoxolone disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avidin-biotin complex : ABC kit</td>
			<td>Vestor laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidine-alexa 594</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>X5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium 1 : Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluen-based synthetic resin mounting medium : Permount</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Drying Bench</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-474-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide ColorFrost</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Fisherchemicals</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FluoView FV 1000 Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water-immersion lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X water-immersion lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLUMPLFL20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X water-immersion lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLFLUOR4X/340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP 225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera CCD</td>
			<td>Sony</td>
			<td>CX-ST50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black and white monitor</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SSM-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>1322A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp amplifier</td>
			<td>Axon instrument</td>
			<td>Mulitclamp 700A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology acquisition software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>pClamp 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology analysis software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Clampfit 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging analysis software</td>
			<td>ImageJFIJI</td>
			<td>Open source software. FIJI version including plug in package.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector image editor</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Illustrator CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet application</td>
			<td>Microsoft Office</td>
			<td>Excel 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the size, shape, and directionality of networks of coupled astrocytes

Astrocytes nöronal fonksiyon sadece sinaptik ve tek hücre düzeylerinde, aynı zamanda ağ düzeyinde modüle giderek netlik kazanmıştır. Astrocytes güçlü boşluğu kavşak birbirine bağlı ve kaplin yoluyla bu kavşaklar dinamik ve son derece düzenlenir. Astrositik işlevleri uzmanlaşmış ve bunların ilişkili olduğu nöronal devre fonksiyonları için uyarlanmış bir ortaya çıkan kavramdır. Bu nedenle, astrositik ağların çeşitli parametreleri ölçmek için yöntemler daha iyi iletişim yöneten ve kaplin kuralları tanımlamak için ve daha işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.
Burada, görüntü analiz yazılımı kullanarak (Örn., ImageJFIJI), astrositik ağlar boya-kaplin tarafından ortaya confocal görüntülerini analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler 1) bir otomatik ve tarafsız algılanması için etiketli hücreleri, ağlar, 3) 4) ilgi alanı içinde ağının yeniden konumlandırma ve ağ içindeki yaymak boya Tercihli yönünü hesaplama hesaplama 2) olanak sağlar .
Bu analiz belirli bir alanda astrositik ağları karakterize, ağları farklı alanlar için farklı işlevler ilişkili karşılaştırmak veya bağlantı üzerinde farklı etkiler farklı koşullar altında elde edilen ağlar karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu gözlemler için önemli işlevsel konuları açabilir. Örneğin, biz nereye biz daha önce astrositik kaplin nöronlar tonik onların ateş desenlerini ritmik patlama1' e geçiş yapma yeteneği için gerekli olduğunu göstermiştir trigeminal çekirdeği, astrositik ağlar analiz. Boyutunu, lohusalık ve bu çekirdek astrositik ağlarda Tercihli yönünü ölçerek, onlar çemberlemek işlevsel etki alanları hakkında hipotezler inşa edebilirsiniz. Çeşitli çalışmalarda varil korteks, yanal üstün zeytin, koku glomeruli ve duyusal çekirdeği talamus ve bir kaç isim için görsel korteksin'de dahil olmak üzere çeşitli beyin bölgeleri benzer bir analizinden yararlanabilir öneririz.

Beyin hücreleri arasında bağlantı statik ama oldukça dinamik olarak birçok faktör tarafından düzenlenmiş değildir. Açıklanan yöntemleri astrositik ağları farklı koşullar altında ortaya çözümlemek ve NVsnpr kuruluşlarındaki anlamak için geliştirilmiştir. Bu sonuçlar zaten yayımlanmış1olmuştur. Biz üç farklı koşullarda NVsnpr dorsal parçası tek astrocytes biocytin dolum yapılan: Ca2 +(koşullarında denetim yokluğund...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes at JoVE.com

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Bu yöntem beyin yapılarında astrositik ağların organizasyonu ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, etiket hücrelerini saymak ve tanımlanmış bir yapı içinde anatomik organizasyonlarını belgelemek için tarafsız bir yöntem önermesidir. ImageJFIJI'yi açın, istediğiniz dosyayı seçin ve biyo biçimin alma seçenekleri penceresinde Tamam'ı tıklatın.Yalnızca son Z yığını için gereken optik dilimleri içeren bir Z yığınını yeniden tanımlamak için önce STK ve Z projesini seçin ve ardından araç çubuğundaki yığın düğmesini tıklatın. Projeksiyon türü ayarında maksimum yoğunluğu seçin. Dosyayı kaydedin ve yığın dosyasını adlandırın.Görüntüleme dosyası birden fazla kanal içeriyorsa, yalnızca astrositik ağın görüntüsünü içeren kanalı göstermek için görüntü rengini ve kanalları bölmeyi kullanın. Görüntü, özellikler, piksel, piksel boyutu için bir seçerek görüntünün piksel ayarlarını kontrol edin. Daha sonra açma işlemini ve arka plan biyocytin etiketleme kaldırmak için arka plan çıkararak arka plan aracını kullanın.Genellikle 50 piksel olarak ayarlanmış yuvarlanan top yarıçapını ayarlamak için önizleme işlevini kullanın. Arka plan adımını çıkarma işleminden sonra daha fazla gürültü azaltma gerekiyorsa, işlem, gürültü seçin ve aykırılıkları kaldırın. Hangi aykırı ayarlarda parlak'ı seçin ve yarıçapı ve eşiği ayarlamak için önizleme işlevini kullanın.Burada gösterildiği gibi verileri bulanıklaştırabileceğinden, dış layıcı yıkıntıcıyı kullanırken dikkatli olun. Görüntüyü kullanarak eşiği ayarlayın, ayarlayın, eşiği ayarlayın. Varsayılan ve B ve W modunu seçin.Apply'a tıklayın. İşlem, ikili ve ikili yapma işlemini seçerek görüntüyü ikili işlem aracıyla ikili bir görüntüye dönüştürün. Dosyayı bir tiff dosyası olarak kaydedin ve ikili dosya olarak adlandırın.Hücreleri saymak için önce analiz et ve ölçümü ayarla'yı tıklatarak ölçüm türünü ayarlayın. Sonra santrifüj seçeneğini seçin. İkili dosyanın ekranda açık olduğundan emin olun.Yine, çözümleme menüsünü açın ve bu kez parçacıkları analiz seçin. Ardından, göster ve anahatları seçin. Bu, algılama sonucunu gösteren yeni bir dosya oluşturur.Algılamayı hassaslaştırmak için parametreleri optimize edin. Yalnızca hücreleri algılamak için, 30 ile 6000 arasında bir boyut değeri ve mükemmel bir daireyi ve rasgele bir şekli sıfırla sıfırarasında bir ebat değeri kullanın. Tamam'ı tıklatarak algılamayı çalıştırın. İki tablo, algılanan hücre sayısını sağlayan özet başlıklı bir tablo ve her hücrenin X ve Y koordinatlarını sağlayan sonuçlar başlıklı bir tablo görüntülenir.Değerleri kopyalayın ve elektronik tablo uygulamasına yapıştırın. Bu tabloyu ad algılama tablosunun altına kaydedin. Algılanan hücrelerin çizimine sahip bir dosya da görünür.Bu dosyayı ad algılama dosyasının altında tiff dosyası olarak kaydedin. İki veya daha fazla etiketli hücreden oluşan bir grup, analiz parçacıkları aracıyla tek bir hücre olarak algılanırsa, analiz parçacıkları aracını uygulamadan önce işlem, ikili ve havza seçerek ikili görüntüdeki havza aracını kullanın. Ağların yüzey alanını ölçmek için ImageJ'deki algılama dosyasını kullanın.Araç çubuğundaki çokgen seçim aracını seçmek için fareyi sol tıklatın. İlgi çekici bir bölgeyi veya ağın dış çevresinde bulunan tüm hücreleri bağlayan YG'yi izlemek için yeniden sol tıklatın. Çokgeni kapatmak için sağ tıklatın.Ayarlı ölçüm penceresini açın ve alan seçeneğini seçin. Ardından YG yöneticisini açın ve ekle'yi tıklatarak yG yöneticisine izlenen çokgeni ekleyin. YG yöneticisinde ölçüyü tıklatarak ölçümü çalıştırın.Alan ölçümü bir tabloda görünür ve piksel cinsinden ifade edilir. Bu değeri, değerin metrekare olarak elde edilmesinde kullanılan mikroskop için bir dönüştürme faktörü ile dönüştürmeyi unutmayın. Stack dosyasını ImageJFIJI'de açın ve yamalı hücreyi daha güçlü etiketleme yoğunluğuyla tanımlayın.Ardından, elektronik tablo uygulamasında algılama tablosu adlı dosyayı açın ve yamalı hücre ve ilgili koordinatlarıyla ilişkili sayıyı bulun. Yamalı hücreyi doğru bir şekilde belirleyemiyorsanız, biyositin birikiminin yoğun olduğu alanı çevreleyen çokgen aracını kullanın ve bu konuma yamalı hücreninki olarak bakın. YG yöneticisini, yamalı hücre konumundan bir yG çizmek ve ygyöneticisine eklemek için daha önce olduğu gibi kullanın.Ardından, ölçümü ayarlayın ve merkezci seçeneği seçin. RIO yöneticisiolarak, izlenen alanın centroid koordinatlarını elde etmek için ölçmek tıklayın. Bu koordinatları bu özel ağ için başvuru noktası olarak kullanın.Yamalı astrosite atıfta bulunarak her hücrenin koordinatlarını hesaplamak için bu formülü kullanın. Yamalı astrosite atıfta bulunarak her hücrenin koordinatlarını ifade etmek, yamalı astrositlerden vektörü hesaplamak için önemli bir adımdır. Tercihli yönelimin ana vektörünün koordinatlarını hesaplamak için bu formülü kullanın.Ağın tercihli yöneliminin ana vektörü, ağda oluşan her hücre için önceden hesaplanan tüm vektörlerin toplamıdır. Değerleri normalleştirmek ve ağlar arasında karşılaştırmaları etkinleştirmek için, yamalı hücreyi dışlamak için ana vektörün uzunluğunu ağdaki hücre sayısına bölün. Her ağın ilgi çekirdeğindeki konumunu belirlemek için, önce dört x görüntüyü bir vektör görüntü düzenleyicisi ile açın.Dört x görüntünün boyutunu artırmak için boyut penceresindeki boyutları beşle çarpın. Burada, görüntü 800 ile 800 piksel olarak örneklendi ve böylece örnekleme çözünürlüğü 4000'e 4000 piksel olarak değiştirildi. Dosyayı tiff biçiminde dışa aktarın ve dört x yeniden boyutlandırın.Yeniden boyutlandırılmış dört x görüntünün sol üst köşesini Adobe Illustrator belgesinin sol alt köşesiyle hizalayın. Yazılım sol alt köşe referans noktasından koordinatları sağlar. Ağın 20 x görüntüsünü açın.İkili dosyayı veya algılama dosyasını kullanın, çünkü hizalamaları daha kolaydır. Daha sonra, 20 x görüntünün ikili dosyasındaki opaklık aracıyla oynayArak yeniden boyutlandırılmış dört x görüntüyle hizalayın. Hizalama yapıldığında, pipet aracını seçin ve basılı tutun, böylece ölçü aracı görünür ve sol araç çubuğunda seçin.20 x'lik görüntünün sol üst köşesine tıklayarak 20 x referans noktasının koordinatlarını yeniden boyutlandırılmış dört x görüntüye ulaşmak için ölçü aracını kullanın. Bu 20 x referential koordinatlar çekirdeğin şematik bir çizim üzerinde her ağın konumunu ifade etmek için yararlıdır. Verileri özetlemek için çekirdeğin dikdörtgen olarak normalleştirilmesi kullanılır.Bunu yapmak için, yeniden boyutlandırılmış dört x görüntüdeki çekirdeği çevreleyen çokgen aracını kullanın. Ardından YG yöneticisini açın ve çizilen yg'yi ekleyin. Çekirdeğin kenarlıkları görülemiyorsa, bu durumda önce yeniden boyutlandırmayı unutmayın.Ayarölçümünde, çizilen çekirdek içindeki en küçük dikdörtgeni hesaplamak için sınırlayıcı dikdörtgen seçeneğini seçin. Son olarak, ölçü'ye tıklayın ve ardından sınırlayan dikdörtgen tarafından temsil edilen normalleştirilmiş bir çekirdekteki etiketli hücre koordinatlarını ifade etmek için yazılı protokoldeki adımları izleyin. SR101 etiketli trigeminal ana duyusal çekirdeğin dorsal kısmındaki tek bir astrosit, tüm hücre kaydı için hedeflenmiş ve %0.2 biyositle doldurulmuştur.Beşinci sistemin elektriksel stimülasyon trigeminal ana duyusal çekirdeğin dorsal kısmında biyositin etiketleme arttı, birleştirilmiş hücre sayısında bir artış temsil eden. Astrositik ağlar trigeminal ana duyusal çekirdeğin dorsal kısmı ve ana yönelimi içinde sınırlı kalır. Bu teknik, tanımlanmış bir yapı içinde astrositik ağları konumlandırmak için geliştirilmiştir, ancak herhangi bir yapıda etiketli hücre popülasyonunun konumunu ifade etmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Nörobilim

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Kortikal yerel alan potansiyelleri, Elektrokardiyogram, Electromyogram ve ritim serbestçe hareket bir sıçan gelen nefes eşzamanlı kayıt

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Reliable Acquisition of Electroencephalography Data during Simultaneous Electroencephalography and Functional MRI

Eşzamanlı Elektroensefalografi ve Fonksiyonel MRI Sırasında Elektroensefalografi Verilerinin Güvenilir Bir Şekilde Eldeılması

Simultaneous electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI), EEG-fMRI, combines the complementary properties of scalp EEG ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Kültürlü Astrositlerde Mitokondriyal Sistemin Canlı Görüntülenmesi

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...