Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR) הפועלים גרנט מגב-123419, מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה גילוי גרנט 418194, ואת משרד אונטריו של המחקר, פרס החדשנות מחקר מוקדם BH. DGW תרמו את חלקם של התמונות שהוצגו, אופטימיזציה של הפרוטוקולים, הכתיבה של כתב היד; הוא מומן על ידי מענק משאבת-לקרקע מן האוניברסיטה של ליברפול. CY ממומן על-ידי מלגה לתואר שני וניהר CIHR MD/PhD Studentship. סוכנויות מימון היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

אוסף של דם מתנדבים בריאים אושרה על ידי הלוח אתיקה של אוניברסיטת מערב אונטריו מחקר מדעי בריאות. Venipuncture בוצעה בהתאם לקווים המנחים של הצהרת מדיניות Tri-המועצה על מחקר אנושי.
1. תרבות והכנה של הקו הסלולרי מונוציט THP-1
<ol><li>תרבות ומונוציטים THP-1 כתרבות התלוי ב- T25 מבחנות ב- C ° 37 + 5% CO2...

השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה לאפשר הדמיה כימות של תהליך דינמי efferocytic, שימוש בגישות תא קבוע והן תאים חיים. גישות אלה מציעים כמה יתרונות על פני23,שיטות מבוססות cytometry זרימה הנפוצות24. השימוש מבפנים ומבחוץ מכתים עם דגימות קבוע מספק של כימות מדויק ועמיד יותר של קצ?...

אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, היא תהליך פיזיולוגי מאוד מווסתות מתרחשת אצל רוב אורגניזמים רב תאיים, הוא קריטי עבור שלהם ופיתוח הומאוסטזיס1. בנוסף להיות מעורב תחלופת תאים נורמליים ופיתוח עובריים, אפופטוזיס מאפשר חיסול של תאים נגועים או פגומים של רקמות, יכולה להיות מופעלת בתגובה זיהום, דלקת, סרטן, וגם על ידי התערבויות רפואיות כגון הקרנות או סטרואידים1. מוות תאים לחשוף "לאכול-לי" אותות על פני השטח של התא, אשר מוכרים על ידי רצפטורים על מגוון של phagocytes מקצועי, בלתי מקצועיים, המכונות במקובץ "efferocytes". האירוסין של רצפטורים אלו המניע את ספיגת והשפלה של התא אפופטוטיים להיפגע על ידי efferocyte באמצעות תהליך המכונה efferocytosis2,3. Phosphatidylserine הוא הטוב ביותר מאופיין לאכול-לי אות efferocytosis נהיגה. זה בדרך כלל מוגבל העלעל הפנימי של קרום פלזמה, עם אפופטוזיס הפעלה של scramblase שומנים בדם אשר משבש סימטריה קרום זה, ובכך חושף בפני phosphatidylserine על פני השטח התא4. Phosphatidylserine נמצא על פני השטח חוץ-תאי של כמה תאים שאינם אפופטוטיים להיפגע, כגון מקרופאגים בוגרת ומופעל טסיות. עם זאת, תאים אלה אינם efferocytosed בשל נוכחותם של "אל תאכל אותי" אותות, כגון CD47,6,שלהם משטח5,תא7. Phosphatidylserine חשוף מזוהה על ידי מערך של קולטני efferocytic לידי ביטוי efferocytes. איגוד של רצפטורים אלו כדי phosphatidylserine, ישירות או באמצעות הסיוע של opsonins, הפעלת איתות המסלולים המקדמים את היבלעות של התא אפופטוטיים להיפגע לתוך חלולית ממברנה מכורך כינה את efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome ולספות ברצף עם endosomes ו lysosomes, אשר מספקים את המנגנון המולקולרי הדרושים כדי acidify את efferosome וכדי לבזות את מוות תא המטען13,14. ברגע מושפל, החומרים הנגזרות תא אפופטוטיים להיפגע הם הנסחר אנדוזום מיחזור – תהליך אשר מגביל את תגובות מערכת החיסון כדי מוות נגזר תא אנטיגנים, אשר עשוי לאפשר התאוששות של חומרים מזינים מוות תא13, 15. כישלון efferocytosis תוצאות סיקול לקוי של מוות תאים; תאים אלה שלא סולק בסופו של דבר עוברים נמק משנית. תאים עם נמק לשחרר תוכן cytosolic פרו דלקתיים, פתוגנים, autoantigens לתוך חצרו חוץ-תאית, ובכך גרמה מגוון של מחלות זיהומיות, דלקתית אוטואימונית16,17. יחד, אפופטוזיס ועל efferocytosis להקל על הסרת תאים מתים וכל מת וגם מאפשרים שמירה על הומאוסטזיס רקמות.
לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס efferocytosis דורש שיטות המספקים כימות ברורה של ספיגת תא אפופטוטיים להיפגע. כימות הזה, זה מורכב על ידי העובדה כי בניגוד אחרים ספיגת מנגנונים כגון אנדוציטוזה phagocytosis18,19, efferocytosis לא עלולה היבלעות של תא היעד ללא פגע, והתוצאה היא תפיסה טיפין טיפין התא אפופטוטיים להיפגע על-ידי efferocyte20. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתאר של במבחנה efferocytosis assay המספק תיחום מדויק של למביטה לעומת הלא-הפנימו חלקים של תאים בודדים אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות משולב עם מגוון תאים קבוע, גישות לחיות תאים במיקרוסקופ. מבחני phagocytosis מסורתי להוסיף נוגדנים ספציפיים אל היעד phagocytic בסוף הניסוי כדי לתייג לא הפנימו את המטרות, בעוד השיטה שלנו שונה בכך labelling המטרה אפופטוטיים להיפגע עם ביוטין מקושר covalently21 , 22. בזמן מוות תא נוגדנים ספציפיים שיכולים לשמש זה וזמינותו, הגישה biotinylation מאפשר עבור כל מטרה חלבון מניבי להיות מתויגת, מונע בעיות אפשריות עם נוגדנים משניים אשיג אם immunostaining מתבצע . באופן ספציפי, אנחנו חלוקה לרמות את הכנת אפופטוטיים להיפגע Jurkat תאים שעברו שהוכתמו כפול עם צבע מעקב תא והן ביוטין. מעקב אחר לצבוע את התא מאפשר אפופטוטיים להיפגע חומרים נגזר התא להיות במעקב במהלך efferocytosis, ואילו biotinylation משטח מאפשר האפליה של הפנימו מחלקים שאינם הפנימו efferocytosed מוות תאים. אנו מתארים גם את התרבות והכנה של שורות תאים J774.2 ו- THP-1 עבור שימוש כמו efferocytes מאתר ואנושי, נגזר מונוציט מקרופאגים M2 כדוגמה efferocytosis התא הראשי ותאים Jurkat לשימוש כמטרות efferocytic. שיטות אלה ניתן להחיל בקלות שורות תאים או ראשי תאים, התאים היעד שעברו כל צורה של מוות תאי (אפופטוזיסלמשל , נמק, necroptosis), וכדי מחקה בגודל מיקרון שידמה מוות תאים דרך השומנים ציפויים אחרים או ציפוי עם ליגנדים ספיציפית הקולטן efferocytic עניין.
השיטה המתוארות ב פרוטוקול זה יש כמה יתרונות על פני שיטות cytometry מבוסס זרימה נפוץ23,שדה24. על ידי הדמיה ישירות את האינטראקציה תא פגוציט-מוות, בשילוב עם תיוג ברור של שני חומר תא הכולל והפנמתי הלא מוות, מדדים כמותיים של efferocytosis יכול להתבצע. יתר על כן, מגביל השימוש fluorophores pH-רגישות גורמים מבלבלים כגון הדיכוי של זריחה FITC ו- GFP ב- pH lysosomal שמבלבלת כמה שיטות אלטרנטיביות25. לבסוף, בעוד לא תיאר בפירוט, שיטות אלה יכול להיות מועסק באמצעות efferocytes לבטא שכותרתו fluorescently transgenes, או עם קיבוע שאחרי immunostaining, כדי לאפשר על כימות של פעילות מולקולת איתות וניטור של תהליכים תאיים במהלך efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

לומד ברגולציה של efferocytosis דורש שיטות שבהן ניתן לכמת במדויק את ספיגת בתאים אפופטוטיים להיפגע וכדי לחקור את התהליכים איתות וסלולריות השולטים efferocytosis. כימות זה יכול להיות קשה לביצוע כמו מוות תאים הם לעתים קרובות efferocytosed תקנה, ובכך המחייב שיטות אשר יכול ניסחו באופן מדויק בין החלק efferocytosed של מטרה אפופטוטיים להיפגע לעומת שיורית סלולרי unengulfed שברי. הגישה המתוארים במסמך זה מנצל כפול-תיוג גישות לכמת במדויק את הדינמיקה של קיבולת efferocytosis ו- efferocytic של efferocytes כגון מקרופאגים. ציטוזול התא מוות מסומן עם צבע התא-מעקב כדי לאפשר פיקוח על כל מוות נגזר תא החומרים, בעוד biotinylation פני השטח של התא אפופטוטיים להיפגע מאפשר בידול בין למביטה והפנמתי הלא מוות תא שברים. יכולת efferocytic של efferocytes נקבע על-ידי לקיחת תמונות פלורסנט של תאים חיים או קבוע לכימות כמות מאוגד נגד מטרות למביטה, כפי מובחנת על ידי צביעת streptavidin. גישה זו מציעה מספר יתרונות על פני שיטות כגון cytometry זרימה, כלומר את התיחום מדויק של הלא-efferocytosed לעומת efferocytosed מוות תא שברים, היכולת למדוד דינמיקה efferocytic על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים, ו היכולת לבצע מחקרים של איתות בתאים המבטאים שכותרתו fluorescently transgenes. משולב, השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה תשמש כבסיס לגישה ניסויית גמיש יכול לשמש כדי לכמת במדויק את פעילות efferocytic ולחקור הסלולר איתות המסלולים פעיל במהלך efferocytosis.

לילה של תאים Jurkat עם תוצאות staurosporine 1 מיקרומטר אפופטוזיס של תרבות > 95% של תאים, אשר יכולים להיות מאושרות עם Annexin V מכתים (איור 1). סוגי תאים אחרים יכול לשמש לניסויים אלה, למרות הריכוז של staurosporine, משך הטיפול staurosporine יצטרכו להיות ממוטבים עבור כל קו תא. זיהוי אמין, כי?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

This method can be used to answer key questions in the efferocytosis field such as the role of signaling molecules in mediating the uptake of apoptotic cells. The main advantage of this technique is that it provides a clear quantification of apoptotic cell uptake including partial or piecemeal apoptotic cell uptake which isn't always apparent with other methods. Though this method can provide insight into efferocytosis by immune cells it can also be applied to other cell types such as epithelial or cancer cells.Generally, individuals new to this method will struggle because of the difficulty in optimizing microscope acquisition settings. After preparing human macrophages and apoptotic Jurkat cells, use a hemocytometer to count the apoptotic cells. Then transfer a sufficient quantity of apoptotic cells to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube.Pellet the Jurkat cells via centrifugation at 500 times g for five minutes. Then resuspend the cells in 500 microliters of PBS. While the Jurkat cells are in the centrifuge, aliquot 10 microliters of DMSO into a new microcentrifuge tube.Next, dissolve a minimal amount of NHS-Biotin in the DMSO. After this, transfer 500 microliters of the apoptotic cell, and PBS suspension to the tube containing DMSO and NHS-Biotin. Then, dilute an appropriate cell-tracking dye according to the manufacturer's instructions.Incubate the cell suspension at room temperature for 20 minutes in the dark. Then, add an equal volume of RPMI 1640 with 10%FBS, and incubate the suspension at room temperature in the dark for an additional five minutes. After this, pellet the cells via centrifugation at 500 times g for five minutes.Then discard the supernatant, and resuspend the stained cells in 100 microliters of RPMI 1640 with 10%FBS. Add 100 microliters of stained cell suspension drop wise to each well of macrophages. Then centrifuge the plate at 200 times g for one minute.Incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5%CO2 in a tissue culture incubator. After the appropriate incubation period, remove the cells from the incubator. Then wash the cells twice with one milliliter of PBS.After this, add diluted FITC-conjugated streptavidin to each well. And incubate the plate for 20 minutes in the dark. Wash the cells three times with one milliliter of PBS, and gently shake the samples for five minutes after each rinse.Then fix the cells with 4%paraformaldehyde in PBS for 20 minutes at room temperature. Rinse the cells once with PBS to remove any excess PFA. Mount coverslips on an imaging slide, and transfer the slide to a fluorescence microscope.Capture Z stacks of a sufficient number of cells for quantification. It is critical to set the distance between said sections such that all engulfed apoptotic material is detected. The maximum distance between said sections should be no greater than the focal depth of your objective lens, typically 0.5 to one micrometers.Load one of the Z stacks into the software using the Import feature. Then select Integrated density as a measurement option under the Set Measurements panel. Analysis is easiest to perform if both the streptavidin and cell tracking dye channels are displayed as an overlay.Any object with streptavidin staining anywhere along a circumference should be considered streptavidin positive, and therefore, should not be quantified as streptavidin negative. Once the image is loaded, using the streptavidin and the Freehand, or polygon selection tool, circle all of the cell tracking dye positives streptavidin negative material in a single plane of the Z stack. Then, measure the integrated intensity of the cell tracking dye in the region.In the same Z section use the streptavidin staining, and the Freehand or polygon selection tool to circle all of the cell tracking dye positive streptavidin positive material. Finally, measure the integrated intensity of this region. Using this procedure, more than 95%of Jurkat cells treated with Staurosporine went through apoptosis.In most experiments, the fraction of apoptotic cells that are efferocytosed increased in a time-dependent fashion. When optimizing this protocol for different efferocytic cell types, or different apoptotic cell targets, it is important to test the range of apoptotic cell to efferocytic cell ratios. Usually ratios of 10 to one or 30 to one work the best.This procedure can be easily modified to track signaling molecule activation, or intracellular trafficking by expressing fluorescent reporter genes in the efferocytic cells, thus allowing for these processes to be imaged during efferocytosis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...