Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
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この研究は、健康研究 (機構) 営業許可モップ-123419、自然科学と工学研究会のカナダ発見グラント 418194 とオンタリオ州省の研究、BH に初期研究賞のカナダの協会によって賄われていた。DGW はいくつかの画像を提示、プロトコルの最適化と; 原稿の執筆に貢献してください。彼はリヴァプールの大学からエコカー補助金で賄われていた。CY はヴァニエ大学院奨学金とされて MD/思い立ったによって資金を供給します。資金提供機関は、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備で役割をなかった。

健康なボランティアから血液は健康科学研究倫理委員会のウェスタン オンタリオ大学によって承認されました。人間研究にトライ理事会方針のガイドラインに従って採血を行った。
1. 文化と THP 1 単球細胞株の作製
<ol><li>37 ° C + 5% CO2T25 フラスコ浮遊培養として文化 THP 1 球。細胞は、ウシ胎児血清 (FBS) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (RPMI 1640) + 10 %5 mL で栽培?...

このプロトコルで説明する方法では、イメージング、固定細胞と生細胞の両方の方法を使用して、動的な efferocytic プロセスの定量化を有効にします。これらのアプローチは、一般的に使用される流れ cytometry 法23,24上のいくつかの利点を提供しています。インサイド アウト染色固定サンプルの使用率のより堅牢で正確な定量化と efferocytosis の範囲?...

アポトーシスまたはプログラム細胞死は、ほとんどの多細胞生物の発生、発達と恒常性1の重要な非常に調整される生理学的プロセスです。正常細胞の代謝回転と萌芽期の開発に関与している、に加えてアポトーシス組織から感染したり、損傷した細胞の除去を有効にし、感染、炎症、癌とも医療介入による応答で引き起こされることができます。放射線療法やステロイド1。アポトーシス細胞を公開"を食べる-私"専門家と非専門家の食細胞の範囲の受容体によって認識される表面に信号をまとめて"efferocytes"と呼びます。これらの受容体の関与は、efferocytosis2,3として知られているプロセスによって efferocyte によって吸収とアポトーシス細胞の劣化を誘導します。ホスファチジルセリンは最高の特徴を食べる-運転 efferocytosis シグナルします。それは通常アポトーシス細胞表面4ホスファチジルセリンを公開するので、この膜非対称を乱す脂質 scramblase をアクティブにすると、血しょう膜の内部のリーフレットに限定されます。ホスファチジルセリンは、成熟マクロファージなどのいくつかの非アポトーシス細胞の細胞表面にあるし、血小板を活性化します。しかし、これらの細胞は、その細胞表面5,6,7CD47 などの「私を食べていない」の信号の存在のために efferocytosed ではありません。露出ホスファチジルセリンは、efferocytes で表される efferocytic 受容体の配列によって認識されます。ホスファチジルセリンにこれらの受容器のバインディング、直接または、オプソニンの援助は efferosome8,と呼ばれる膜結合液胞にアポトーシス細胞の貪食を促進するシグナル伝達経路をアクティブに9,10,11,12.、efferosome は順番にエンドソームと融合し、貨物13,14細胞のリソソームは、分子機械、efferosome を酸性化して、アポトーシスを低下する必要を提供します。リサイクルのエンドソーム アポトーシス細胞由来材料劣化、一度入稿-アポトーシス細胞由来の抗原に対する免疫応答を制限して、可能性がありますによりアポトーシス細胞13から栄養素の回復プロセス 15。Efferocytosis で故障した場合、アポトーシス細胞の障害クリアランスこれらの未確認の細胞は最終的に二次壊死を受けます。壊死細胞は、感染、炎症、自己免疫疾患16,17の範囲を駆動、細胞外の環境に賛成して炎症性のゾル性細胞質の内容、病原体・自己抗原をリリースします。一緒に、アポトーシスと efferocytosis 死んで、死んだ細胞の除去を容易にするため、組織の恒常性の維持を可能にします。
Efferocytosis の基礎となる分子機構を解明、アポトーシス細胞取り込みの明確な数量を提供するメソッドが必要です。他の吸収とは異なりエンドサイトーシスと貪食18,19、efferocytosis などのメカニズムがない結果は断片的な吸収の結果そのままターゲット細胞の貪食で、この数量は複雑します。efferocyte20によるアポトーシス細胞。記載プロトコルの in vitro efferocytosis 試金を記述、内面の正確な描写を提供する個々 のアポトーシス細胞の非内面部分とさまざまな固定セルと組み合わせることができますと生細胞の顕微鏡に近づきます。伝統的な食作用の試金の抗体を追加手法として内在化している非ターゲットをラベル付けするために実験の終わりに貪食のターゲットに固有の共有リンク ビオチン21アポトーシス ターゲットのラベルによって異なります,22. ビオチン化アプローチに分類されるべき任意のタンパク質含有ターゲットを可能にし免疫染色を行った場合、二次抗体の交差反応性の潜在的な問題を回避アポトーシス細胞特異的抗体は、この試金で使用できますが、.具体的には、我々 は、アポトーシス Jurkat 細胞追跡の染料とビオチンの両方でデュアル染色されているの準備を概説します。追跡色素細胞はアポトーシス細胞由来材料 efferocytosis 中に追跡する表面ビオチン化可能の差別に対し efferocytosed アポトーシス細胞の非内面部分から内面のことができます。文化とマウスと人間の efferocytes として使用、M2 マクロファージの J774.2 と THP 1 細胞の efferocytic ターゲットとして一次電池 efferocytosis および Jurkat 細胞の例として準備について述べる。これらのメソッドは、他の細胞や細胞、脂質コーティングを介してアポトーシスをシミュレートするミクロン サイズの模倣し、標的細胞の細胞死 (アポトーシスなど壊死とネクロトーシス) の任意のフォームを受けているに簡単に適用できるか特定の関心の efferocytic 受容体にリガンドでコーティングします。
このプロトコルで説明したメソッドには、フィールド23,24でよく使用される流れ cytometry による方法に比べていくつかの利点があります。両方の合計と内在化している非アポトーシス細胞材料の明確なラベリングと組み合わせる食細胞アポトーシス細胞の相互作用を直接イメージングによる efferocytosis の定量的な対策が可能です。また、pH に依存しない fluorophores の使用は、いくつかの代替方法25を混同するライソゾームの pH で FITC と GFP の蛍光性の抑制などの交絡因子を制限します。最後に、詳細に記述されていませんが、これらのメソッド使用できる蛍光標識遺伝子を表現する efferocytes を使用してまたはポスト固定免疫染色、シグナリング分子の活動との監視の定量化を可能にするのにはefferocytosis 中細胞プロセスは。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Efferocytosis の規制を勉強してアポトーシス細胞の取り込みを正確に定量化する efferocytosis を制御するシグナル伝達と細胞プロセスをプローブすることができる方法が必要です。この数量は、アポトーシス細胞は efferocytosed、断片的、呼び出しと残留 unengulfed 細胞に対するアポトーシス ターゲットの efferocytosed 部分の間正確に記述することができます。 メソッドを実行することは困難することができます。フラグメント。記載方法は、正確にマクロファージなどの efferocytes の efferocytosis と efferocytic の容量のダイナ ミックスを定量化するためのアプローチのデュアル ラベルを利用しています。アポトーシス細胞の細胞質がアポトーシス細胞の表面ビオチン化可能ですが差別化と非内面内面の間すべてのアポトーシス細胞由来物質の監視を有効にするための細胞追跡染料にラベル付けされてアポトーシス細胞画分。Efferocytes の efferocytic 容量は、ライブまたは固定細胞の蛍光画像を撮影し、ストレプトアビジンの汚損によって差別化、内面化されたターゲット対連結の量を定量化によって決定されます。このアプローチは、フローサイトメトリー、すなわち efferocytosed アポトーシス細胞画分、生細胞顕微鏡による efferocytic のダイナミクスを測定する能力と非 efferocytosed の正確な描写などの方法と比べていくつかの利点を提供していますと、蛍光標識した遺伝子を発現する細胞の細胞内シグナル伝達の研究を実行する能力。組み合わせることで、このプロトコルで説明する方法は、正確に efferocytic 活動を定量化し、efferocytosis 中細胞のシグナル伝達経路を調査するために使用することができます柔軟な実験的アプローチのための基礎として機能します。

Jurkat 細胞のアポトーシスに 1 μ M スタウロスポリン結果の文化を一晩 > アネキシン V (図 1) を染色で確認することができます細胞の 95%。スタウロスポリンの濃度とスタウロスポリン処置の持続期間は各セル行の最適化が必要であるが、これらの実験のため他の細胞型を使用できます。信頼性の高い検知及び efferocytosis、定量化の > 細胞の 80% は、...

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

This method can be used to answer key questions in the efferocytosis field such as the role of signaling molecules in mediating the uptake of apoptotic cells. The main advantage of this technique is that it provides a clear quantification of apoptotic cell uptake including partial or piecemeal apoptotic cell uptake which isn't always apparent with other methods. Though this method can provide insight into efferocytosis by immune cells it can also be applied to other cell types such as epithelial or cancer cells.Generally, individuals new to this method will struggle because of the difficulty in optimizing microscope acquisition settings. After preparing human macrophages and apoptotic Jurkat cells, use a hemocytometer to count the apoptotic cells. Then transfer a sufficient quantity of apoptotic cells to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube.Pellet the Jurkat cells via centrifugation at 500 times g for five minutes. Then resuspend the cells in 500 microliters of PBS. While the Jurkat cells are in the centrifuge, aliquot 10 microliters of DMSO into a new microcentrifuge tube.Next, dissolve a minimal amount of NHS-Biotin in the DMSO. After this, transfer 500 microliters of the apoptotic cell, and PBS suspension to the tube containing DMSO and NHS-Biotin. Then, dilute an appropriate cell-tracking dye according to the manufacturer's instructions.Incubate the cell suspension at room temperature for 20 minutes in the dark. Then, add an equal volume of RPMI 1640 with 10%FBS, and incubate the suspension at room temperature in the dark for an additional five minutes. After this, pellet the cells via centrifugation at 500 times g for five minutes.Then discard the supernatant, and resuspend the stained cells in 100 microliters of RPMI 1640 with 10%FBS. Add 100 microliters of stained cell suspension drop wise to each well of macrophages. Then centrifuge the plate at 200 times g for one minute.Incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5%CO2 in a tissue culture incubator. After the appropriate incubation period, remove the cells from the incubator. Then wash the cells twice with one milliliter of PBS.After this, add diluted FITC-conjugated streptavidin to each well. And incubate the plate for 20 minutes in the dark. Wash the cells three times with one milliliter of PBS, and gently shake the samples for five minutes after each rinse.Then fix the cells with 4%paraformaldehyde in PBS for 20 minutes at room temperature. Rinse the cells once with PBS to remove any excess PFA. Mount coverslips on an imaging slide, and transfer the slide to a fluorescence microscope.Capture Z stacks of a sufficient number of cells for quantification. It is critical to set the distance between said sections such that all engulfed apoptotic material is detected. The maximum distance between said sections should be no greater than the focal depth of your objective lens, typically 0.5 to one micrometers.Load one of the Z stacks into the software using the Import feature. Then select Integrated density as a measurement option under the Set Measurements panel. Analysis is easiest to perform if both the streptavidin and cell tracking dye channels are displayed as an overlay.Any object with streptavidin staining anywhere along a circumference should be considered streptavidin positive, and therefore, should not be quantified as streptavidin negative. Once the image is loaded, using the streptavidin and the Freehand, or polygon selection tool, circle all of the cell tracking dye positives streptavidin negative material in a single plane of the Z stack. Then, measure the integrated intensity of the cell tracking dye in the region.In the same Z section use the streptavidin staining, and the Freehand or polygon selection tool to circle all of the cell tracking dye positive streptavidin positive material. Finally, measure the integrated intensity of this region. Using this procedure, more than 95%of Jurkat cells treated with Staurosporine went through apoptosis.In most experiments, the fraction of apoptotic cells that are efferocytosed increased in a time-dependent fashion. When optimizing this protocol for different efferocytic cell types, or different apoptotic cell targets, it is important to test the range of apoptotic cell to efferocytic cell ratios. Usually ratios of 10 to one or 30 to one work the best.This procedure can be easily modified to track signaling molecule activation, or intracellular trafficking by expressing fluorescent reporter genes in the efferocytic cells, thus allowing for these processes to be imaged during efferocytosis.

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