Name: quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Bu çalışmada sağlık araştırma (CIHR) işletim Grant paspas-123419, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada keşif Grant 418194 ve bir Ontario Bakanlığı araştırma ve yenilik erken Araştırma Ödülü BH için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. DGW bazı resimler, iletişim kuralları'nın bir optimizasyon ve el yazması yazma sunulan katkıda bulunmuştur; Liverpool Üniversitesi bir pompa astar hibe tarafından finanse edildi. CY Vanier Yüksek Lisans Burs ve CIHR MD/doktora öğrencilik tarafından finanse edilmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Sağlıklı gönüllülerden kan toplanması sağlık Bilim Araştırma Etik Kurulu Batı Ontario Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. İz Tri-Konseyi ilke bildirimi insan araştırma yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Kültür ve THP-1 monosit hücre kültürünü hazırlanması
<ol><li>Kültür THP-1 monosit olarak 37 ° C + %5 CO2T25 şişeler bir süspansiyon kültürü. Hücreleri Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640) + % 10 5 mL Fetal sığ?...

Bu protokol için özetlenen yöntemleri görüntüleme ve miktar sabit-hücre ve canlı hücre yaklaşımları kullanarak dinamik efferocytic işleminin etkinleştirin. Bu yaklaşımlar yaygın istihdam akış sitometresi tabanlı yöntemleri23,24çeşitli avantajlar sunuyor. Inside-out ile sabit örnekleri boyama kullanım oranı daha sağlam ve doğru miktar ve efferocytosis kapsamı sağlar — gerçekten de, birçok akış sitometresi tabanlı yöntem sadece...

Apoptozis veya programlanmış hücre ölümü, en çok hücreli canlılar arasında oluşur ve onların gelişme ve homeostasis1için son derece önemli bir son derece düzenlenir fizyolojik süreçtir. Ek olarak normal hücre ciro ve embriyonik geliştirme dahil olmak, apoptozis dokular enfekte veya hasarlı hücreleri ortadan kaldırılması sağlar ve yanıt enfeksiyon, inflamasyon, kanser ve aynı zamanda tıbbi müdahaleler tarafından tetiklenebilir radyoterapi veya steroid1gibi. Apoptotik hücreleri göstermek "ye-bana" fagositler, profesyonel ve profesyonel olmayan bir dizi reseptörler tarafından tanınan sinyalleri onların hücre yüzeyinde topluca "efferocytes" anılacaktır. Bu reseptörler nişan alımı ve apoptotik hücre bozulması efferocyte efferocytosis2,3bilinen işlem aracılığıyla tarafından neden olmaktadır. Fosfatidilserin en iyisi karakterize yemek-sürüş efferocytosis işaret. Normalde plazma zarı iç broşür böylece açığa Fosfatidilserin hücre yüzey4' te bu membran asimetrisi bozan bir lipid scramblase aktive apoptozis ile sınırlanır. Fosfatidilserin olgun makrofajlar gibi bazı sigara apoptotik hücre hücre dışı yüzeyinde bulunan ve trombosit aktive. Ancak, bu hücreler efferocytosed "beni yeme" gibi sinyallerini CD47, onların hücre yüzey5,6,7varlığı nedeniyle değildir. Maruz Fosfatidilserin efferocytic reseptörleri efferocytes tarafından ifade edilen bir dizi tarafından kabul edilmektedir. Bu reseptörler Fosfatidilserin için bağlama, doğrudan veya opsonins, yardım yoluyla etkinleştirir apoptotik hücre engulfment efferosome8, olarak adlandırdığı bir membran bağlı çarpıtması içine teşvik sinyal yolları 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sırayla endosomes ile sigortalar ve Moleküler makineler efferosome acidify ve apoptotik aşağılamak için gerekli teslim organellerin hücre kargo13,14. Bir kez bozulmuş, apoptotik hücre kaynaklı malzemeler için geri dönüşüm endosome ticareti — bir süreç olan bağışıklık yanıtı apoptotik hücre kaynaklı antijenleri için sınırlar ve hangi apoptotik hücre13, besin kurtarma için izin verebilir 15. Engelli izni efferocytosis sonuçlarında apoptotik hücre bir başarısızlık; temizlenmemiş bu hücreler sonunda sekonder nekrozis tabi. Nekrotik hücre pro-inflamatuar sitozolik İçindekiler, patojenler ve autoantigens böylece driving range infektif, enflamatuar ve otoimmün hastalıklar16,17ekstraselüler ortamın yayın. Birlikte, apoptozis ve efferocytosis ölmek üzere olan ve ölü hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırmak ve doku homeostazı bakım için izin.
Efferocytosis temel moleküler mekanizmaları araştıran apoptotik hücre Alım açık bir miktar sağlamak üzere yöntemler gerektirir. Bu miktar diğer alımını mekanizmaları endositoz ve fagositoz18,19, efferocytosis gibi sağlam hedef hücre, parçalı Anlamazdın kaynaklanan engulfment neden olabileceğini değil aslında tarafından karmaşıktır apoptotik hücre efferocyte20. Burada açıklanan protokolü sağlar internalized doğru tarif bir vitro efferocytosis tahlil açıklar karşı bireysel apoptotik hücre bölümleri sigara içselleştirilmiş ve sabit-hücre çeşitli ile kombine edilebilir ve Live-cep mikroskobu yaklaşımlar. Geleneksel fagositoz deneyleri eklemek antikorlar Özel Sigara içselleştirilmiş hedefleri, nerede bizim yöntemi olarak etiketlemek için deney sonunda fagositik hedefe farklı kovalent bağlı biotin21 apoptotik hedefle etiketleme , 22. apoptotik hücre belirli antikor-ebilmek var olmak kullanılmış bu tahlil ederken, biotinylation yaklaşım herhangi bir protein taşıyan hedef etiketlenmeye olanak sağlar ve immunostaining gerçekleştirilirse ikincil antikor olan ile olası sorunları önler . Özellikle, bir hücre izleme boya ve biotin ile çift lekeli edilmiştir apoptotik Jurkat hücreleri hazırlanması anahat. Boya izleme hücre efferocytosis sırasında izleniyor, efferocytosed apoptotik hücre sigara içselleştirilmiş bölümlerden ise yüzey biotinylation ayrımcılık için sağlar internalized apoptotik hücre kaynaklı malzeme sağlar. Ayrıca Kültür ve hazırlanması J774.2 ve THP-1 hücre hatları için fare ve insan efferocytes olarak kullanmak, monosit kaynaklı M2 makrofajlar birincil hücre efferocytosis ve Jurkat hücreleri kullanmak için bir örnek olarak efferocytic hedef olarak açıklar. Bu yöntemler diğer hücre hatlara veya primer hücre, hücre ölümü (Örneğin apoptosis, nekroz ve necroptosis) her türlü geçiren hedef hücrelere ve hangi apoptotik hücreler lipid kaplamalar arasında taklit mikron büyüklüğünde taklit eder kolayca uygulanabilir veya kaplama ligandlar belirli bir faiz efferocytic takımı ile.
Bu protokol için özetlenen yöntemi yaygın olarak kullanılan alan23,24akış sitometresi dayalı yöntemler üzerinde birçok avantajı vardır. NET her iki toplam ve sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi etiketleme ile kombine Fagosit-apoptotik hücre etkileşimi doğrudan görüntüleme tarafından efferocytosis nicel ölçüleri yapılabilir. Ayrıca, pH-duyarlı fluorophores bazı alternatif yöntemler25zihnimi karıştıran lizozomal pH FITC ve GFP floresans bastırılması gibi karıştırıcı faktörlerin kısıtlar. Son olarak, ayrıntılı olarak açıklanmıştır değil iken, bu yöntemler transgenes, fluorescently etiketli ifade efferocytes kullanarak istihdam edilebilir veya sonrası fiksasyon immunostaining molekül etkinlik sinyal ve izlenmesi miktar için izin vermek için ile hücresel süreçler sırasında efferocytosis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>3500-000-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72290-08</td>
			<td>Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>81590</td>
			<td>Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20217</td>
			<td>Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace FarRed</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Orange</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Streptavadin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lympholyte-poly cell sepration medium</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>CL5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774.2 Macrophage Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85011428-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 Human Monocyte Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat T Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of efferocytosis by single-cell fluorescence microscopy

Efferocytosis Yönetmeliği okuyan ve doğru bir şekilde apoptotik hücreler alımını ölçmek için efferocytosis kontrol sinyal ve hücresel işlemleri soruşturma için yöntemler gerektirir. Bu miktar böylece doğru bir şekilde apoptotik hedef karşı artık unengulfed cep efferocytosed kısmı arasında betimlemek Yöntemler gerektiren çoğu kez efferocytosed parça parça, apoptotik hücreler gibi yapmak zor olabilir parçaları. Burada özetlenen yaklaşım doğru makrofajlar gibi efferocytes efferocytosis ve efferocytic kapasitesini dinamikleri ölçmek için çift etiketleme yaklaşımlar kullanır. Apoptotik hücre sitozol apoptotik hücre yüzey biotinylation farklılaşma için sağlar internalized ve sigara içselleştirilmiş arasında iken tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler, izleme özelliğini etkinleştirme bir hücre izleme boya ile etiketlenir apoptotik hücre kesirler. Canlı ya da sabit hücre floresan fotoğraf çekmek ve streptavidin boyama tarafından Ayrıştırılan gibi ilişkili içselleştirilmiş hedefleri karşı miktarı miktarının efferocytes efferocytic kapasitesini belirler. Bu yaklaşım yöntemleri akış sitometresi, yani efferocytosed apoptotik hücre kesirler, efferocytic dynamics tarafından canlı-cep mikroskobu, ölçmek için yetenek karşı efferocytosed doğru tarif gibi birçok avantaj sunar ve hücresel fluorescently etiketli transgenes ifade hücrelerde sinyalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kapasite. Birlikte, bu protokol için özetlenen yöntemleri doğru efferocytic etkinliğini ölçmek ve hücresel sinyal yolları efferocytosis sırasında etkin sorguya çekmek için kullanılan esnek bir deneysel yaklaşım için temel olarak hizmet vermektedir.

Gecede 1 µM staurosporine sonuçlarında apoptozis ile Jurkat hücre kültür > Annexin (Şekil 1) boyama V ile teyit edilmesi hücrelerin % 95'i. Staurosporine konsantrasyonu ve staurosporine tedavi süresi her hücre satırı için optimize edilmiş olması gerekir, ancak diğer hücre tipleri bu deneyler için kullanılabilir. Güvenilir algılama ve efferocytosis, miktar için > hücrelerin % 80'i-meli var olmak efferocytes için eklemeden önce apoptoti...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

This method can be used to answer key questions in the efferocytosis field such as the role of signaling molecules in mediating the uptake of apoptotic cells. The main advantage of this technique is that it provides a clear quantification of apoptotic cell uptake including partial or piecemeal apoptotic cell uptake which isn't always apparent with other methods. Though this method can provide insight into efferocytosis by immune cells it can also be applied to other cell types such as epithelial or cancer cells.Generally, individuals new to this method will struggle because of the difficulty in optimizing microscope acquisition settings. After preparing human macrophages and apoptotic Jurkat cells, use a hemocytometer to count the apoptotic cells. Then transfer a sufficient quantity of apoptotic cells to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube.Pellet the Jurkat cells via centrifugation at 500 times g for five minutes. Then resuspend the cells in 500 microliters of PBS. While the Jurkat cells are in the centrifuge, aliquot 10 microliters of DMSO into a new microcentrifuge tube.Next, dissolve a minimal amount of NHS-Biotin in the DMSO. After this, transfer 500 microliters of the apoptotic cell, and PBS suspension to the tube containing DMSO and NHS-Biotin. Then, dilute an appropriate cell-tracking dye according to the manufacturer's instructions.Incubate the cell suspension at room temperature for 20 minutes in the dark. Then, add an equal volume of RPMI 1640 with 10%FBS, and incubate the suspension at room temperature in the dark for an additional five minutes. After this, pellet the cells via centrifugation at 500 times g for five minutes.Then discard the supernatant, and resuspend the stained cells in 100 microliters of RPMI 1640 with 10%FBS. Add 100 microliters of stained cell suspension drop wise to each well of macrophages. Then centrifuge the plate at 200 times g for one minute.Incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5%CO2 in a tissue culture incubator. After the appropriate incubation period, remove the cells from the incubator. Then wash the cells twice with one milliliter of PBS.After this, add diluted FITC-conjugated streptavidin to each well. And incubate the plate for 20 minutes in the dark. Wash the cells three times with one milliliter of PBS, and gently shake the samples for five minutes after each rinse.Then fix the cells with 4%paraformaldehyde in PBS for 20 minutes at room temperature. Rinse the cells once with PBS to remove any excess PFA. Mount coverslips on an imaging slide, and transfer the slide to a fluorescence microscope.Capture Z stacks of a sufficient number of cells for quantification. It is critical to set the distance between said sections such that all engulfed apoptotic material is detected. The maximum distance between said sections should be no greater than the focal depth of your objective lens, typically 0.5 to one micrometers.Load one of the Z stacks into the software using the Import feature. Then select Integrated density as a measurement option under the Set Measurements panel. Analysis is easiest to perform if both the streptavidin and cell tracking dye channels are displayed as an overlay.Any object with streptavidin staining anywhere along a circumference should be considered streptavidin positive, and therefore, should not be quantified as streptavidin negative. Once the image is loaded, using the streptavidin and the Freehand, or polygon selection tool, circle all of the cell tracking dye positives streptavidin negative material in a single plane of the Z stack. Then, measure the integrated intensity of the cell tracking dye in the region.In the same Z section use the streptavidin staining, and the Freehand or polygon selection tool to circle all of the cell tracking dye positive streptavidin positive material. Finally, measure the integrated intensity of this region. Using this procedure, more than 95%of Jurkat cells treated with Staurosporine went through apoptosis.In most experiments, the fraction of apoptotic cells that are efferocytosed increased in a time-dependent fashion. When optimizing this protocol for different efferocytic cell types, or different apoptotic cell targets, it is important to test the range of apoptotic cell to efferocytic cell ratios. Usually ratios of 10 to one or 30 to one work the best.This procedure can be easily modified to track signaling molecule activation, or intracellular trafficking by expressing fluorescent reporter genes in the efferocytic cells, thus allowing for these processes to be imaged during efferocytosis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...