Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de trazo experimental, como cómo reducir asociado con estos modelos y cómo mejorar la reproducibilidad. La principal ventaja de esta técnica es que permite la reperfusión a través de la arteria carótida común, y por lo tanto no depende del círculo de Willis, que puede variar anatómicamente entre los animales, y por lo tanto puede contribuir a la variabilidad observada en las medidas de resultado experimental. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos de reparación del recipiente CCA son difíciles de aprender debido a la dificultad técnica que implica el uso del sellador para asegurarse de que el CCA es completamente patentado, después de la reparación.
Para empezar, preparar y anestesiar el ratón de acuerdo con el protocolo de prueba. Luego usa una cuchilla de bisturí número 15 para hacer una incisión de línea media de 1,5 cm en el cuello ventral expuesto. Usando técnicas de disección contundente, retrae suavemente las glándulas salivales hacia un lado, para exponer la tráquea.
Luego disecciona la arteria carótida común, o CCA, libre del tejido circundante y del nervio vagal. Después de esto, pase dos pequeñas secciones de una sutura no disoluble 6-0 por debajo de la CCA, dorsal a la CCA, y ventral al nervio vagal. Dibuje una corbata de seda más cerca del cirujano y átela libremente alrededor de la CCA.
A continuación, ate libremente una segunda corbata de seda hacia la bifurcación de las arterias carótidas internas y externas. A continuación, aplique un clip microvascular justo encima de la corbata distal, asegurándose de que la bifurcación no esté obstruida. Utilice tijeras micro venosas para hacer un pequeño agujero en el CCA.
Inserte un micro filamento recubierto de silicona 7-0 en el CCA y avance hacia el clip microvascular. A continuación, apriete la corbata distal para fijar el filamento en su lugar. Y utilice los soportes de clip para quitar el clip microvascular.
A continuación, avance el filamento hacia la arteria carótida interna, o ICA. Una vez que la cabeza del filamento pase la corbata distal, tire de la corbata más apretada, para evitar la pérdida de sangre. Usando la corbata de seda distal, levante y tire de la CCA hacia el lado externo del cuerpo del ratón, y dirija el filamento a la curva, pasando la abertura de la arteria pterigopalatina, o PPA.
Una vez que el filamento esté en su lugar, asegúrelo apretando aún más la corbata de seda distal. Al final del período MCAO, retraiga el filamento hasta que la cabeza del filamento blanco sea claramente visible. A continuación, afloje la corbata distal de CCA lo suficiente para quitar la cabeza del filamento la mayor parte del camino, fuera del recipiente.
A continuación, retire completamente la cabeza del filamento del recipiente. Después de esto, coloque un clip microvascular en la posición horizontal, hacia la bifurcación CCA, y al lado de la corbata distal. Luego coloque otro clip debajo de la corbata proximal CCA, hacia el cirujano.
Utilice cuidadosamente los fórceps Dumont 5 para eliminar los dos lazos de seda. Y seque la zona con cogollos de algodón estériles. A continuación, agregue las soluciones sellantes de fibrinógeno y trombina uno y dos, a un plato estéril de Petri.
Usando tijeras micro venosas y técnica de disección contundente, obtener una fina rebanada ventral de músculo esternocleidomastoideo. Luego, usando fórceps Dumont 5, tome la almohadilla de tejido y mezcle uniformemente a través de las soluciones sellantes fibrinógeno y trombina. Aquí es importante asegurarse de que la almohadilla de tejido es lo suficientemente grande como para cubrir la incisión CCA.
Y una vez que se mezcla a través de las dos soluciones, se debe colocar inmediatamente sobre la incisión, para evitar la sobre-coagulación y la mala adherencia. Una vez mezclado entre las dos soluciones, retire la almohadilla de tejido a la incisión CCA. Coloque la almohadilla de tejido plana hacia abajo en la incisión con presión media y abra los fórceps.
Retire rápidamente el clip microvascular distal, mientras mantiene la almohadilla de tejido en su lugar. A continuación, aliviar lentamente la presión de la almohadilla de tejido, permitiendo que la sangre fluya debajo del área de la incisión. Ahora, suelte lentamente y suavemente la presión del clip microvascular proximal, luego retírela por completo.
La eliminación del clip superior permite que una pequeña cantidad de sangre active el sellador. Una liberación constante del clip distal permite un aumento gradual de la presión en el sitio de la incisión, activando más y ayudando a prevenir una reparación fallida. Finalmente, una vez sellado el recipiente, suturar la herida con suturas dissololubles 6-0.
En este protocolo, la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAO, se realizó en 24 ratones macho adultos. Una evitación de la ligadura ECA y la adición de analgesia mostró una tendencia hacia la reducción de la pérdida de peso a las 48 horas después de MCAO. Cinco minutos después de la extracción del filamento, el flujo sanguíneo cerebral regional aumentó significativamente en la región cerebral del MCA.
La perfusión se mantuvo hasta la reparación del recipiente, con un aumento en la perfusión al territorio MCA, después de la reparación del recipiente CCA. Esto sugiere que la reparación de CCA permitió un aumento de la perfusión sanguínea al territorio isquémico, en comparación con la dependencia del círculo de Willis solo. Se utilizó una resonancia magnética ponderada T2 para determinar el total de exploraciones de LV y DTI para determinar el LV principal a las 48 horas después de la MCAO.
No hubo diferencia significativa entre estos dos grupos. Curiosamente, que una variabilidad para el LV total y el núcleo se redujo significativamente en el grupo de reparación CCA. Nuestro análisis indicó que se requeriría menos animales por grupo de tratamiento para demostrar una reducción del 30% en el VI, después de la MCAO, utilizando la reparación de CCA, en comparación con el procedimiento ligado típico de la CCA.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que el paquete de tejido es de tamaño suficiente para cubrir la incisión CCA. Además, la velocidad es importante, para evitar que el sellador sobre-coagulante, antes de colocar la almohadilla en el CCA.
