Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

هذا العمل وتلقى تمويل من "المركز الألماني" للبحوث العدوى (دزيف) ووحدة تعقب المعاملات التهاب الكبد مشاريع 5.807 5.704، TRR179 الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) (ن 15)، و "المركز الأسترالي" لبحوث علم الفيروسات التهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية.
نحن مدينون للبروفسور وليام ماسون من جانبه في تطوير طريقة إينفبكر الأصلية، ومما يدل على أنه بالنسبة لنا. نود أن نشكر الدكتور يي ني وفلوريان ألف ليمب على الكواشف (خطوط الخلايا والعدوى HBV). نحن نسلم Rippert إنجا، [فرنزيسكا Schlund، انجيلهاردت سارة، والدكتورة كاترين Schöneweis للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون ميريام كلينيج لتصحيح التجارب المطبعية، والأساتذة نيكولاس شاكيل ورالف بارتينشلاجير للدعم المستمر.

1-الخلية العدوى واستخراج الحمض النووي
<ol><li>الحفاظ على مثقف Huh7-نتكب الخلايا8،9 في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 10% v/v الجنين المصل البقري، 1 x البنسلين/ستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين. ملاحظة: هذا قد سبق أبلغ في التفصيل40.</li>
	<li>البذور 2 × 105 خلايا/مل Huh7-نتكب الخلايا في صفيحة 12-جيدا مع 1 مل دميم.</li>
	<li>إذا كان اختبار علاجات الخلية (مثل مثبطات HBV)، تطبيقها لثقافة طاف ح 4 بعد البذر (يوم واحد قبل الإصابة HBV). تطبيق عنصر تحكم سلبية، 200 نانومتر ميركلوديكس ب (قوية HBV دخول المانع41).</li>
	<li>استخدام المادة طافية42 عمود الهيبارين تنقيته من HepAD3843 العدوى لتصيب خلايا في 1,000 فج/خلية في 500 ميليلتر للثقافة الإعلامية (دميم وتستكمل مع 10% v/v الجنين المصل البقري، 1 x البنسلين/ستربتوميسين و 2 مم الجلوتامين ل 2.5% v/v [دمس])، الذي يحتوي على 4% w/v البولي إثيلين غليكول 8000 [حله في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)].</li>
	<li>ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية (تعيين في شركة 5%2 و 90% رطوبة).</li>
	<li>تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل PBS العقيمة 1 س في ح 16-24 بعد الإصابة.</li>
	<li>استبدال وسائط الثقافة كل يومين بعد الإصابة بالتهاب حتى الحصاد.</li>
	<li>في يوم 3 ما بعد الإصابة، علاج الخلايا مع ديسوبروكسيل التنفوفير مكم 5 و 10 ميكرون ولاميفودين للحد من إنتاج HBV وسيطة ريبليكاتيفي التي يتم أمبليفيابل من إينفبكر.</li>
	<li>في يوم 5 ما بعد الإصابة، تريبسينيزي الخلايا مع 200 ميليلتر يدتا التربسين وريسوسبيند لهم في 2 مل دميم (تستكمل مع 10% v/v الجنين المصل البقري، 1 x البنسلين/ستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين)، التي تتضمن أيضا ديسوبروكسيل التنفوفير مكم 5 و 10 ميكرومتر ولاميفودين.</li>
	<li>نقل تعليق خلية إلى لوحة 6-جيدا للحث على جولة واحدة من الانقسام (التي أبلغت للحث على فقدان HBV كككدنا44 وأخرى وسيطة الحمض النووي HBV التي أمبليفيابلي إينفبكر).</li>
	<li>في اليوم السابع بعد الإصابة، تريبسينيزي الخلايا الموسعة في 400 ميليلتر يدتا التربسين وريسوسبيند المخلوط في 1 مل دميم. ضع التعليق في أنبوب 1.5 مل وبيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية بالطموح.</li>
	<li>(اختياري) تخزين الكريات الخلية في-20 درجة مئوية حتى أنهم على استعداد لاستخراج الحمض النووي.</li>
	<li>استخراج الحمض النووي من خلية بيليه باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تقدير تركيز الحمض النووي النهائي باستخدام قياس كثافة بصرية. ملاحظة: الحمض النووي العائد في وحدة تخزين شطف 100 ميكروليتر هو عموما ~ 250-400 نانوغرام/ميكروليتر.</li>
</ol>2-انعكاس للحمض النووي
<ol><li>استخراج ميكروغرام ~1.5–2.5 الكوة من الحمض النووي المجموع من الخطوة 1 في أنبوب بكر 200 ميكروليتر. إضافة المقدار المناسب من إنزيم التقييد الرئيسي-مزيج ليسفر عن رد فعل ميكروليتر 40 مجلد يتضمن 1 × خلاصة رد فعل المخزن المؤقت (مثلاً.، كوتسمارت المخزن المؤقت) و 10 يو ضابط صفمن أنا-التردد.</li>
	<li>مزيج ردود الفعل دقة وتدور إلى أسفل في الطرد أنبوب صغير. تبني رد فعل إنزيم التقييد في جهاز PCR عند 37 درجة مئوية لح 1 لكفاءة الهضم الأمثل.</li>
	<li>إلغاء تنشيط إنزيم التقييد التي تفرخ في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>نقل رد فعل إنزيم التقييد الكامل لأنبوب 1.5 مل. إضافة ميكروليتر 400 1 x T4 الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت و 500 ش دنا T4 ليجاسى ومزجها جيدا. وتشجع حجم رد فعل كبيرة داخل الجزيئية (مقارنة بين الجزيئية) ربط أجزاء الحمض النووي هضمها.</li>
	<li>تبني رد فعل ربط في درجة حرارة الغرفة ح 2 لضمان ربط كاملة.</li>
	<li>إلغاء تنشيط ليجاسى T4 الحمض النووي عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>إضافة 10 ميكروليتر من 10% w/v الصوديوم دوديسيل كبريتات ضمان المنظمة كاملة من ليجاسى T4.</li>
	<li>مزج الأنابيب بنبض فورتيكسينج وتدور بإيجاز ميكس رد فعل. إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي 100 مم وديكستران (35 – 45 كاتشين) بتركيز نهائي 90 ميكروغرام/مل. مزج الأنابيب بنبض فورتيكسينج وتدور بإيجاز ميكس رد فعل.</li>
	<li>إضافة 900 ميكروليتر من الإيثانول 100% ومزيج من انعكاس. يعجل في الحمض النووي في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>بيليه الحمض النووي سرع بالطرد المركزي في 14,000 س ز على 15 دقيقة إزالة المادة طافية بتطلع مع ماصة P200. أغسل بيليه مع 500 ميكروليتر من 70% v/v الإيثانول والطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>إزالة الإيثانول بتطلع مع ماصة P200. أيردري بيليه الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>حل بيليه في 20 ميكروليتر من ح2سين إضافة 20 ميكروليتر مزيج ماجستير إنزيم التقييد ليسفر عن رد فعل ميكروليتر 40 مجلد يتضمن 1 × خلاصة رد فعل المخزن المؤقت و 5 يو من مكتب التحقيقاتهكاي، و 5 يو من Sph-HF. إينكوباتي رد فعل إنزيم التقييد في كتلة الحرارة عند 37 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى سفأنا-HF) ح 1.</li>
	<li>باختصار تدور أسفل هذا المزيج رد فعل. تبني رد فعل إنزيم التقييد في كتلة حرارة عند 65 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى ل مكتب التحقيقاتهكاي) ح 1.</li>
	<li>باختصار تدور أسفل هذا المزيج رد فعل.</li>
	<li>تخزين الحمض النووي مقلوب في-20 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.</li>
</ol>3-يعشق [بكر]
<ol><li>إزالة أمبليكونس المحتملة من ختم حصيرة سيليكون القابل لإعادة الاستخدام باستخدام حل تدهور الحمض النووي وشطف حصيرة جيدا بمياه خالية من الحمض النووي، وأيردري في درجة حرارة الغرفة أثناء تحضير الخليط PCR.</li>
	<li>إعداد 1 مل مزيج x PCR 1 التي تحتوي على الأمام الخارجي (5 '-عقاري بنا TCA CCT CTG CAC ز-3')، وعكس (5 '-AAA GGA CGT CCC فريق المساعدة النقدية-3') الإشعال في تركيز من 0.5 ميكرومتر.</li>
	<li>إضافة 170 ميكروليتر من مزيج x PCR 1 إلى الآبار A1 و E1 في صفيحة بكر 96-جيدا.</li>
	<li>إضافة ميكروليتر 120 من مزيج x PCR 1 إلى الآبار B1 إلى H1.</li>
	<li>إضافة 10 ميكروليتر من الحمض النووي المقلوب من الخطوة 2 إلى الآبار A1 و E1 (يمكن تحليل عينات معكوس مختلفة 2 على نفس اللوحة PCR). باستخدام مزيج من رد الفعل في كل بئر بلطف بيبيتينج كل منها حوالي 10 مرات P1000 تعيين إلى 100 ميكروليتر.</li>
	<li>الآبار عينات تمييع متسلسل من A1 إلى D1 بنسبة 1:3 بنقل ميكروليتر 60 في كل خطوة. مزيج من الآبار في كل خطوة من بيبيتينج لهم بلطف حول 10 مرات استخدام P1000 تعيين إلى 100 ميكروليتر. تجنب تشكيل الفقاعات. كرر الخطوة E1 جيدا، 3.6 إضعاف وصولاً إلى H1 جيدا.</li>
	<li>الكوة 10 ميكروليتر من خليط رد فعل استخدام ماصة متعدد القنوات من آبار A1-H1 في آبار A2-H2، H3-A3، وهلم جرا حتى وصلت إلى الآبار A12-H12 بليت 96-جيدا. تغطية لوحة بكر مع حصيرة السيليكون الجافة من الخطوة 3.1، ضغط بشدة.</li>
	<li>ضع اللوحة في جهاز PCR وتشغيل البرنامج التالي: 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية؛ دورات 35 من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية، 15 s في 54 درجة مئوية و 3 دقيقة في 72 درجة مئوية؛ 7 دقيقة عند 72 درجة مئوية؛ بعد ذلك، اضغط اللوحة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>الحرارة دبابيس دبوس 96 وحدة النسخ المتماثل إلى ملتهب مع موقد بنسن وثم يبرد لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ملء الآبار من صفيحة بكر الثاني مع 10 ميكروليتر 1 ميكس x PCR (الذي يحتوي على مخزن مؤقت جل جاهزة لتحميل) وإعادة توجيه داخلية (5 '-كجك ATG هفوة لجنة التنسيق الإدارية لجنة التنسيق الإدارية دايمنشن A-3') وعكس (5 '-CAC AGC كبار المستشارين التقنيين الائتلاف دول مجلس التعاون الخليجي ATG ز-3') في 0.5 ميكرومتر.</li>
	<li>بعناية إزالة حصيرة السيليكون من لوحة PCR لصفيحة 96-جيدا من PCR الجولة الأولى، وتجنب التلوث المتبادل بين الآبار.</li>
	<li>استخدام تبريد وحدة النسخ المتماثل لنقل منتجات PCR لوحة 96-جيدا من PCR الجولة الأولى للوحة 96-بئر الكوتيد حديثا. إجراء PCR متداخلة باستخدام نفس الشروط كما هو الحال في الخطوة 3، 8، باستثناء تغيير الخطوة الأولى تمسخ عند 95 درجة مئوية من 10 دقيقة إلى 2 دقيقة.</li>
</ol>4-بكر المنتج العزلة واستخراج هلام
<ol><li>تحليل منتجات PCR بالتفريد جل استخدام 96-جيدا مع 1.3% w/v [اغروس] هلام. لجل [اغروس] 100 مل، تشغيل 200 الخامس لمدة 10 – 15 دقيقة.</li>
	<li>المكوس العصابات الحمض النووي من المواد الهلامية [اغروس] استخدام قش الشرب المتاح. لكل منتج PCR، ضع القش و [اغروس] هلام توصيل أنبوب 1.5 مل وتقليم سترو إلى حجم مع المقص. ملاحظة: أنها كافية لعزل العصابات فقط من تخفيف تلك التي يمكن حلها واحدة [بكر] منتوجات.</li>
	<li>(اختياري) تخزين الأنابيب في-20 درجة مئوية لاستخراج لاحقة.</li>
	<li>إخراج المقابس [اغروس] إلى كل أنبوب بواسطة الضغط على نهاية جزء القش. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لاستخراج جل و 5 ميكروليتر من جل استخراج الزجاج حبة الملاط لكل أنبوبة.</li>
	<li>استخراج منتجات PCR وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لأدوات استخراج هلام (باستثناء باستخدام وحدات التخزين نصف للغسيل الخطوات) والوت الحمض النووي من الخرز مع 30 ميكروليتر من المياه.</li>
	<li>يقدم الحمض النووي المنقي سانغر التسلسل (حسب تعليمات المورد) مع التمهيدي إلى الأمام المستخدمة في الجولة الثانية متداخلة PCR.</li>
</ol>5-تسلسل التحليل
<ol><li>تأكيد تقاطعات الحمض النووي الفيروس الخلية عن طريق إجراء تحليل انفجار النوكليوتيدات (باستخدام الإعدادات الافتراضية المحاذاة إلى جمع كامل النوكليوتيدات). ملاحظة: نتائج تمثيلية مفصلة في الشكل 3 أدناه.<ol>
<li>إلا إذا كان يلاحظ جزئية المحاذاة في التسلسل، تقليم 5 ' تسلسل الحمض النووي HBV قبل إعادة تشغيل إجراء تحليل لانفجار.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تطبيق معايير انتقاء صارمة لتحديد إذا كان تسلسل معين يمثل مفترق طرق تكامل حقيقي كما يلي:<ol>
<li>تشمل فقط تسلسلات التي تحتوي على > 20 شركة بريتيش بتروليوم لتسلسل الخلوية لتعيين ثقة بالجينوم الخلوي.</li>
		<li>تجاهل أية تسلسلات التي تحتوي على مواقع تقييد أي الإنزيمات المستخدمة داخل 10 bp لملتقى التكامل خلية الفيروس المفترض، كما أنها تمثل احتمالاً في المختبر ربط الأحداث بدلاً من تقاطعات التكامل الحقيقي.</li>
		<li>تجاهل أي تسلسل مع مستويات fluorescence الذروة متباينة واضحة على جانبي ملتقى التكامل المفترض في تسلسل تشروماتوجرافس، أن هذه هي التحف المحتمل المتولدة عن التلوث عبر خلال تفاعل التسلسل أو الشعرية اللوني.</li>
		<li>تعريف أحداث تكامل فريد كتلك مع HBV الدقيقة وتسلسل الخلوية عند مفرق خلية الفيروس. ملاحظة: يمكن أن يؤدي تكرار أحداث تكامل فريد من الاستنساخ توسيع نطاق الخلايا التي تحتوي على هذه التكاملات أو التلوث عبر خلال بكر (الذي يمكن اختبار باستخدام ردود الفعل السلبية لمراقبة، بمزيد من التفصيل في نتائج تمثيلية أدناه). ومن المتوقع متكررة التكاملات في تسلسل الخلايا المحددة لعرض المواقع الطرفية HBV المختلفة لكل حدث التكامل، كما هي مسارات الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة تستخدم15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حساب تردد التكامل بضرب عامل تخفيف لقوالب الحمض النووي مقلوب عدد من تقاطعات خلية الفيروس اكتشفت في إضعاف ذلك، يليه تطبيع لمبلغ إجمالي الحمض النووي الإدخال إلى رد فعل انعكاس. عموما، تواتر التكامل بناء على أمر من 01:104 خلايا.</li>
</ol>

S.U. هو المشارك مقدم الطلب والمخترع المشارك ب ميركلوديكس كمثبطات دخول HBV/عالية الجودة حماية براءات الاختراع. وتعلن T.T. لا تضارب في المصالح.

قبل تنفيذ البروتوكول، من المهم أن نلاحظ أن هذا الإنزيم إينفبكر تقنية عالية حساسية، قادرة على تضخيم نسخة واحدة من قالب الحمض النووي. ولذلك، الحد من التلوث الناجم عن منتجات PCR ذات أهمية قصوى. فيما يلي الاستراتيجيات العامة للحد من تلوث المنتج PCR. (ط) إنشاء مناطق منفصلة فعلياً للخطوات المختلفة للأسلوب. ينبغي أن يكون لكل مجال المعاطف مختبر منفصلة، ويجب تغيير القفازات عند التنقل بين هذه المناطق. لدينا سرد هذه المجالات أدناه بالترتيب من معظم إلى الأقل احتمالاً تكون ملوثة: بكر الاستخراج وتتابع رد فعل إنشاء منطقة المنتج (وظيفة-PCR)؛ إضافة قالب بكر ودبوس ملتهب نقل المنطقة (وقد استخدمنا أغطية PCR مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية ديكونتاميناتينج مع نتائج جيدة)؛ منطقة الاستخراج وانعكاس الحمض النووي (ما قبل-PCR)؛ ومنطقة "الحمض النووي خال من قالب" تستخدم فقط لإعداد الأوراق المالية وحلول PCR. (ثانيا) أن يكون علم بتدفق الهواء في المختبر كسائق محتملة للتلوث عبر. على وجه الخصوص، التلوث عبر ردود الفعل بكر أثناء الخطوة نقل دبوس ملتهب الأكثر احتمالاً أن يحدث، وسوف يؤدي إلى التقدير الكمي غير دقيقة لوتيرة التكامل. يمكن استخدام أغطية PCR للحد من هذه التيارات العابرة. آبار المراقبة السلبية (مثلاً عينات تعامل ب ميركلوديكس أو أية عناصر تحكم قالب) في ال [بكر] يمكن استخدامها أيضا لاختبار للتلوث عبر. (ثالثا) الحد من الملوثات المحتملة بكر على الماصات وأسطح العمل بانتظام مسح أسفل مع حل تدهور الحمض النووي.
يتم ترتيب البروتوكول المحدد هنا للكشف عن تكامل استنساخ HBV المعدية المعروفة التي تم إنشاؤها من خط خلية HepAD3842. إذا كانت العدوى استخدام تسلسل الحمض النووي HBV مختلفة (مثلاً، من مصل المريض)، ثم الجينوم HBV ينبغي أن تكون أول متسلسلة لتأكيد التوافق [بكر] كبسولة تفجير وتصميم انعكاس. في19من الدراسات المنشورة سابقا، فقد استخدمنا 3 مجموعات من الإشعال التي تربط المصانة تسلسل الحمض النووي HBV المرافقة الموقع المتوقع للحمض النووي HBV تكامل الوصلات. تسلسلات التمهيدي والبروتوكولات الأخرى قد ورد وصف لتحديد تسلسل الجينوم HBV44،،من4546،،من4748 وقد تعمل بنجاح.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام خلايا HBV-عرضه مختلفة (مثلاً خلايا الكبد البشرية الأساسية، هيبرج المتباينة، HepG2-نتكب الخلايا)؛ ومع ذلك، وجدنا أن الخلايا Huh7-نتكب توفير أكبر نسبة الإشارة إلى الضجيج، عند النظر في عدد خلايا الفيروس الحمض النووي الوصلات التي تزداد مقارنة بفيروس الحمض النووي الوسيطة التي يتم تضخيم13. على وجه الخصوص، لا تخضع الخلايا المتمايزة لا شفاء منها مثل خلايا الكبد البشرية الأولية أو هيبرج المتباينة كفاءة الانقسام، أدى إلى ارتفاع مستوى الحمض النووي HBV أمبليفيابل وسيطة replicative المتبقية داخل الخلايا. وقد وجدنا أن ~ 90% تسلسلات تضخيم تمثيل الحمض النووي HBV ترتيبات جديدة (وعدم إدماج الأحداث) في الخلايا المتمايزة لا شفاء منها، مقارنة مع 70-50% في خطوط الخلايا الكبدي13. هذه المنتجات عموما جينوم الحمض النووي HBV المحتوية على الحذف الكبيرة في المياه السطحية والأساسية قراءة الإطارات المفتوحة، أو أنها يمكن أن تمثل الأنواع شبه HBV مع إضافية ضابط صفأنا الموقع قبل Sphأنا الموقع. التضخيم من هذه الأنواع HBV (بما في ذلك الرسم تخطيطي) قد وصفت بالتفصيل سابقا13.
وهناك عدة عيوب لهذا الأسلوب. نظراً لطبيعة شاقة ومتعددة اليوم من هذا البروتوكول، لا تتناسب مع إينفبكر إلى تحليلات الفائق لعدد كبير من العينات. وعلاوة على ذلك، كما أنها تعتمد على الحد من معايرة تمييع، أسلوبنا ليس درجة عالية من الدقة في التحديد الكمي؛ وعلى الرغم من أنه ينبغي قياس بسهولة تغيير مستوى سجل في وتيرة التكامل.
وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول انعكاس فقط مناسب للكشف عن التكاملات التي تقع بين منطقة DR2 و DR1 الجينوم HBV، كما تحدث غالبية HBV التكامل داخل هذه المنطقة49. خ ع تحليل HBV أنسجة المريض قد أظهرت أن أقلية كبيرة (تصل إلى ~ 50 ٪) قد تحدث أيضا خارج هذه المنطقة49. تصاميم إينفبكر جديدة نظرياً قادراً على الكشف عن هذه المواقع التكامل الأخرى، على الرغم من أنهم لا (على حد علمنا) قد نفذت حتى الآن. فائدتين، بسبب المواقع إنزيم التقييد اللازمة المطلوبة المصب من تسلسل الفيروس--خلية تقاطع لرد فعل انعكاس، إينفبكر لم يكشف جميع التكاملات التي تقع داخل مناطق الجينوم HBV DR2 و DR1 (أي، نحن ويقدر أن ~ 10% من جميع التكاملات قابلة للاكتشاف باستخدام المحاكاة في السيليكون 13). ومع ذلك، عند تطبيق مجموعة مركزة من العينات مع عدد قليل من العلاجات المختلفة، إينفبكر واحدة من طرق العملي الوحيد للكشف عن الحمض النووي HBV المتكاملة في قرار واحد لزوج قاعدي.
ونحن نتصور ذلك تطبيقات هذا الأسلوب يخدم دوراً رئيسيا في إيجاد الفيروسية (عن طريق طفرات العدوى HBV)، الخلوي (عن طريق خروج المغلوب أو overexpression من الجينات الخلوية محددة، أو من خلال تطبيق مختلف العقاقير)، والبيئة ( مثلاً، التعرض للأكسدة) العوامل التي تحفز الحمض النووي HBV التكامل. مع هذا الأسلوب ونظم العدوى HBV المطورة حديثا، ونحن تمكين التحكم لم يسبق لها مثيل لهذه العوامل حتى يمكن أن تكون معزولة جيدا واتسمت أفضل. ونتوقع أيضا أن هذا سيؤدي إلى فهم رئيسية لعواقب الخلوية للحمض النووي HBV التكامل، بما في ذلك ما مدى المضادات الفيروسية (مثلاً، HBx أو HBsAg50) يتم التعبير عنها من خلال نموذج متكامل، ما هي الضوابط هذا التعبير، وأم لا يتغير HBV التكامل إلى حد كبير النمط الظاهري الخلوية تجاه دولة برو-النمطان أكثر. نتائج هذه الدراسات في المستقبل سيكون لها أثر عميق على الاستراتيجيات العلاجية المستخدمة لعلاج التهاب الكبد المزمن وعلى الفهم الأساسي للفيروس نفسه.

HBV هو فيروس الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي يمكن أن تسبب العدوى المزمنة مدى الحياة، مما يؤدي إلى تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية (HCC)1،،من23. وفي حين توجد عدة آليات الجزيئية القيادة HBV استمرار4 (مثلاً، ارتفاع ثبات القالب النسخي جينية فيروسية)، وتهرب مراقبة المناعية، وانخفاض معدل الدوران لخلايا الكبد في الكبد وما يرتبط بها مخاطر العقود بدء5،6 (مثل التهاب مزمن وتفعيل الخلوية التشديد على مسارات)، تم درس إدماج الحمض النووي HBV في جينوم الخلية المضيفة (إليه المبلغ عنها لكل من هذه الظواهر) ضعيف . سبب رئيسي هو عدم مناسبة في المختبر العدوى نظم HBV التي تتيح كشف يعول عليها لإحداث التكامل. هنا، نحن وصف بروتوكول وضعت مؤخرا لكل جيل في المختبر والكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات التي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة والآثار المترتبة عليها.
واستعرضت HBV النسخ المتماثل وتشكيل الحمض النووي HBV التكامل سابقا بالتفصيل7. بإيجاز، يدخل HBV خلايا الكبد باستخدام الصوديوم توروتشولاتي كوترانسبورتينج الببتيد (نتكب) مستقبلات الخلوية الرئيسية للعدوى8،9. نوكليوكابسيدس HBV المحتوية على استرخاء HBV التعميم الحمض النووي (ركدنا) يدخل الجينوم النواة، حيث ركدنا يتم تحويلها إلى الحمض النووي دائرية مغلقة تساهمي ابيسومال (كككدنا). كككدنا النووية بمثابة قالب النسخي مرناس الفيروسية وقبل المجينية الحمض النووي الريبي (بجرنا)10. ثم يتم حزم بوليميريز HBV وبجرنا في نوكليوكابسيدس المشكلة حديثا (التي تتألف من dimers البروتين الأساسية HBV). بجرنا HBV عكس نسخها داخل نوكليوكابسيد، مما أدى إلى أما جينوم ركدنا أو مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل خطي الحمض النووي (دسلدنا) جينوم11،12. وأخيراً هذه نوكليوكابسيدس الناضجة تحتوي على مورثات الحمض النووي HBV يلفها وتصديرها فيريونس.
يمكن أن تؤدي العدوى من خلايا الكبد بجسيمات المغلفة التي تحتوي على جزيئات دسلدنا الفيروسية إدماج المضيف الخلية الجينوم13، مما أدى إلى أشكال غير كفء النسخ المتماثل من الحمض النووي HBV7،،من1415. يحدث التكامل الحمض النووي HBV في موقع الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الصبغية فواصل15. تتراكم الأدلة تشير إلى أن يحدث كل حدث التكامل في وضع أساسا عشوائية داخل الخلية المضيفة الجينوم16،17. وبالإضافة إلى ذلك، يحدث التكامل الحمض النووي HBV نوعا ما إلا نادراً، بمعدل 1 من كل 104 خلايا13،18،،من1920. أسئلة هامة فيما يتعلق بإدماج الحمض النووي HBV لا تزال دون إجابة، لا سيما فيما يتعلق بالمسارات الجزيئية الدقيقة المعنية، الاعتماد على الفيروسية وعوامل المضيف، مولدات المضادات الفيروسية أعرب من النماذج المتكاملة، ومساهمتها المحتملة لاستمرار الفيروسية7. أنشأنا نموذجا في المختبر لتسليط الضوء على بعض هذه الأسئلة.
ندرة أحداث التكامل الحمض النووي HBV (سواء فيما يتعلق بمعدل إدماج كل خلية وعدد النسخ من كل تكامل فريد) في الإصابة في المختبر HBV نماذج جعل لهم تحديا للكشف. الانقسام الخلية محدودة في نظامنا في المختبر ، كما لا تدعم تقسيم الخلايا العدوى بكفاءة. وهكذا، خلافا في أنسجة الكبد المريض حيث يحدث توسع كبير الاستنساخ من خلايا الكبد1918،،20، جداً قليلة (1 إلى 2) نسخ من كل التكامل موجودة في مجمع معين من الخلايا المصابة في المختبر . وقد وجدنا أيضا أن التكامل يحدث أساسا أثناء الإصابة الأولى لخلايا الكبد (وليس بشكل مستمر في خلايا الكبد المصابين بأمراض مزمنة)13. تبعاً لذلك، لا يمكن زيادة التكامل الحمض النووي HBV ببساطة استزراع الخلايا لفترة أطول.
وبصفة عامة، الأساليب المستخدمة سابقا للكشف عن الحمض النووي HBV المتكاملة، بما في ذلك جنوب لطخة التهجين21،،من2223،24،25، الو-بكر26،27 ، كاسيت بوساطة ربط PCR28، والجينوم كله التسلسل29،،من3031،،من3233، لم يكن لديك حساسية للكشف عن نسخ واحدة من التكامل. ونحن وغيرهم من الباحثين استخدموا معكوس متداخلة بكر (إينفبكر) للكشف عن تكامل الحمض النووي هيبادنافيرال في داك ووودكوك الاكباد المصابة البشرية13،14،،من1819، 35،،من 3436. أخرى أدخلت التعديلات الإجرائية إلى تقنية إينفبكر التي قد يغير توليد إشارات إيجابية كاذبة وتقييد القدرة على القياس الكمي37. إذا نفذ الفحص كما هو موضح في هذا البروتوكول، يمثل إينفبكر مقايسة الخاصة والحساسة التي تحدد ويوضحها (بالأرقام المطلقة نسخة) متعددة الحمض النووي HBV التكاملات. يتم تعيين تسلسل الحمض النووي HBV-خلية التقاطع بدقة زوج قاعدة واحدة، السماح للدراسات بيوينفورماتيكال من الفيروسية وتسلسل الحمض النووي المضيفة في مواقع التكامل13.
التي وصفناها سابقا نتائج38 من إينفبكر في الأنسجة المصابة بالحمض النووي HBV المستخرجة من مجموعة كبيرة من المصادر، بما في ذلك أنسجة الكبد مجمدة في الأداة الإضافية وجزءاً لا يتجزأ من البارافين أقسام الكبد وعينات الأنسجة الصغيرة للغاية تم عزلة بواسطة الليزر-ميكروديسيكتيون19. ويحدد هذا البروتوكول إصدار محدث من الإنزيم إينفبكر استخدام الحمض النووي المستخرج من الخلية المستمدة من الثقافة الأنسجة بعد الإصابة في المختبر ، التي يتم إنشاؤها بإعداد نسخة منخفضة من التكاملات (1 – 2 نسخ كل التكامل). الحمض النووي HBV التكاملات شكلت في المختبر تشبه تلك الموجودة في أنسجة المريض فيما يتعلق بتوزيعها على الجينوم الخلوي وتقاطع داخل التسلسل الفيروسي هو متكامل13،16، مما يوحي الطريق قابلة للمقارنة إلى داخل كبد المصابين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو مشتركة الممرضات المنقولة بالدم تسبب سرطان الكبد وتليف الكبد الناجمة عن العدوى المزمنة. الفيروس يتطابق عموما من خلال الحمض النووي ابيسومال متوسطة؛ ومع ذلك، إدماج شظايا من الحمض النووي HBV في جينوم مضيف وقد لوحظ، على الرغم من أن هذا النموذج ليس ضروريا للنسخ المتماثل الفيروسية. الهدف المحدد، وتوقيت، والآليات بالحمض النووي HBV الذي يحدث التكامل لم تظهر البيانات واضحة، ولكن مؤخرا أنه يحدث في وقت مبكر جداً بعد الإصابة. هنا، في المختبر توليد والكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات موصوفة بالتفصيل. لدينا بروتوكول على وجه التحديد يستفيض نسخة واحدة من خلايا الفيروس الحمض النووي التكاملات ويسمح الكمي المطلق والقرار زوج واحد-قاعدة تسلسل مفرق. طبق هذا الأسلوب على مختلف أنواع الخلايا HBV-عرضه (بما في ذلك خلايا الكبد البشري الأساسي)، إلى مختلف HBV طفرات، وبالاقتران مع مختلف المخدرات التعرض. ونتوقع هذه التقنية أصبح مقايسة مفتاح تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الظاهرة ذات الصلة سريرياً.

تمثيل تخطيطي لتقنية إينفبكر يرد في الشكل 1. ويرد مثال [اغروس] هلام التفريد من إينفبكر نجاح في الشكل 2 قبل وبعد عزلة منتج PCR. ويبين الشكل 3 تحليل الانفجار ناتج خطوة وسيطة replicative الحمض النووي HBV 5.1 في الحالات (ط) تضخيم مفرق الحمض النووي الفيروس الخلية والتضخيم (ثانيا).
النتائج من الضوابط الإيجابية المتوقعة: Huh7-نتكب الخلايا المصابة مع الهيبارين تنقية مخزونات HBV كما هو موضح أعلاه (الشكل 1) يمكن أن تكون بمثابة عنصر إيجابي. في هذه الحالة، ينبغي تحقيق واحد بكر المنتجات بتمييع الثانية أو الثالثة 1:3 لكل عينة (يقابل ~ 104 مكافئات الخلية الواحدة وتمييع، الشكل 2). في تخفيف هذه، سيمثل حوالي 50% منتجات خلية الفيروس الحقيقي تقاطعات الحمض النووي، بينما يمثل النصف الآخر تضخيم الحمض النووي HBV وسيطة (الشكل 3).
في الدراسات السابقة13، وجدنا حالات قليلة من تقاطعات خلية الفيروس المتكررة، مما يشير إلى لا مواقع المجينية الخلوية التفضيلية الحمض النووي HBV التكامل. ونجد أيضا أن >80% من تقاطعات خلية الفيروس تحدث بين النيوكليوتيدات 1732 و 1832 (وفقا النوكليوتيدات ترقيم HBV الوراثي د، "الانضمام إلى بنك الجينات" #U95551.1)، حيث تمثل هذه المحطة الأيسر من النموذج دسلدنا HBV. تسلسل تقاطعات خلية الفيروس الحقيقي وجدت من خلال أسلوبنا في تجارب في المختبر متاحة للجمهور في بنك الجينات (أرقام انضمام MH057851 إلى MH058006).
النتائج من الضوابط السلبية المتوقعة: وقاية الخلايا Huh7-نتكب أو تلقيح Huh7-نتكب الخلايا قبل التعامل مع ب ميركلوديكس يمكن أن تعمل كعناصر سلبية. يجب أن تنتج إينفبكر تحليل الحمض النووي المستخرج من هذه الخلايا لا منتجات PCR. يسمح تشغيل هذه العينات السالبة لمراقبة على نفس اللوحة PCR كعينات إيجابية في اختبار للتلوث عبر أثناء عملية PCR متداخلة. هو الاختبار الأكثر صرامة للتلوث عبر تشغيل عينة سلبية-التحكم في الآبار أ-د وعينه إيجابية في الآبار ح ه على لوحة 96-جيدا. وفي هذه الحالة، يتم تشغيل إضعاف العينة الإيجابية الأكثر تركيزاً في صف المتاخمة مباشرة لإضعاف مركزة أقل من العينة سلبية. إذا كانت منتجات التضخيم لوحظت في عينات مراقبة سلبية، معهد التدابير المقترحة في المناقشة للتقليل من التلوث عبر الأحداث.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> رقم 1: الشكل التخطيطي لعملية إينفبكر للكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات. بعد الإصابة بالتهاب، أقلية فقط من الخلايا Huh7-نتكب تتضمن HBV دسلدنا (أحمر) تدمج في جينوم الخلية المضيفة (أحمر)، يصور في القسم الأعلى. مجموع الحمض النووي هو ثم المستخرجة من الخلايا (الخطوة 1) مقلوب (الخطوة 2) ويضخم من يعشق [بكر] (الخطوة 3). يظهر هي المواضع النسبية للمواقع إنزيم التقييد (ضابط صفو مكتب التحقيقاتحقي) في تقاطع قصت الفيروس خلايا الحمض النووي. هذا الرقم مقتبس من منشور سابق13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> رقم 2: [اغروس] هلام التفريد واستخراج هلام اللاحقة نجاح إينفبكر. ويمثل "M" سلم علامة الحمض النووي. ويمثل كل صف من 12 replicates التقنية في إضعاف واحد على لوحة PCR. يمكن تشغيل اثنين من عينات الحمض النووي مقلوب كل بكر لوح/[اغروس] هلام. ينبغي أن تيتراتي منتجات PCR لتمييع كل أصل في ~ 1: نسبة 3. استخراج المنتجات من تخفيف مركزة على الأقل اثنين حيث العصابات واحدة يمكن أن تكون معزولة بسهولة يكفي بوجه عام، كما يتحدد معدل الاندماج الحمض النووي HBV نقطة نهاية المعايرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> رقم 3: تحليل الانفجار من تسلسل المنتج إينفبكر. كما يتم إنشاء مساحات طويلة من تسلسل من سانغر التسلسل، مصدرا لتسلسل الحمض النووي عموما لا لبس فيها. يلاحظ المحاذاة قوية HBV والجينوم الخلوي في مناطق مختلفة من ملف تسلسل FASTA التي تم إنشاؤها من سانغر التسلسل في أعلى اللوحة، مما يوحي بتقاطع دنا خلية فيروس حقيقي. في أسفل اللوحة، محاذاة التسلسل فقط إلى أجزاء الجينوم HBV، مما يشير إلى منتج المتولدة عن التضخيم الجينوم الحمض النووي HBV آخر أعيد ترتيبه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

يصف لنا هنا الجيل في المختبر للحمض النووي HBV عبر نظام عدوى بفيروس التهاب الكبد البائي والكشف عن درجة عالية من الحساسية للتكامل (1 – 2 نسخة) استخدام معكوس متداخلة PCR.

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الفيروسات التهاب الكبد B، مثل العثور على العوامل الخلوية أو الفيروسية التي تؤثر على دمج الحمض النووي لفيروس الورم الحليمي البشري. هناك مزايا متعددة لهذه التقنية. انها رخيصة نسبيا ، وسهلة لتنفيذ ، وتحليل النتائج بسيطة ، وانها حساسة جدا ، وصولا الى نسخ واحدة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لتوفير نظرة ثاقبة في تكامل فيروس التهاب الكبد B، إلا أنه يمكن استخدامها أيضًا في الفيروسات الأخرى التي تندمج في جينوم الخلية المضيفة، مثل فيروس نقص المناعة البشرية أو فيروس نقص المناعة البشرية HTLV-1 أو فيروس الورم الحليمي البشري. لتصيب الخلايا، بذور 200،000 خلية لكل ملليلتر في لوحة 12 جيدا، مع 1 ملليلتر من د-يم. في اليوم التالي، استخدم عمود هيبارين المنقى سو في نا الدين من HEP-AD 38 كما تلقيح لتصيب الخلايا في 1،000 VGE لكل خلية، في 500 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة.ثم، ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية. ثم، في اليوم التالي، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من العقيمة مرة واحدة برنامج تلفزيوني. ثم، استبدال الوسط ثقافة كل 2 أيام، حتى الحصاد.في اليوم 3 بعد العدوى، وعلاج الخلايا مع 5 تينوفوفير ميكرومولار disoproxil و 10 micromolar Lamivudine للحد من إنتاج وسيطة تكرارية HBV التي يتم تضخيم قادرة على عكس PCR. في اليوم 5, بعد العدوى, trypsinize بعض الخلايا مع 200 ميكرولترات من تريبسين EDTA وإعادة تعليقها في 2 ملليلتر من D-mem تحتوي على 5 ميكرومولار Tenofovir disoproxil و 10 micromolar Lamivudine. في وقت لاحق، نقل تعليق الخلية إلى لوحة ستة بئر، للحث على جولة واحدة من الانقسام.في اليوم 7 بعد العدوى، تبسينيزي الخلايا الموسعة في 400 ميكرولترات من تريبسين EDTA وتعليق الخليط في 1 ملليلتر من مد ميم. ثم، نقل التعليق في أنبوب 1.5 ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 500 مرة G، لمدة خمس دقائق.وإزالة سو في نا الدين عن طريق الطموح. استخراج الحمض النووي من بيليه الخلية باستخدام عدة استخراج الحمض النووي، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة لتحول الحمض النووي، خصص 1.5 إلى 2.5 ميكروغرام من إجمالي استخراج الحمض النووي في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر.المقبل, إضافة كمية مناسبة من المزيج الرئيسي انزيم تقييد لنتيجة 40 ميكرولتر من حجم رد الفعل, تحتوي على 1 مرات الهضم العازلة رد فعل و 10 وحدات NCO-1HF. احتضان رد فعل انزيم التقييد في جهاز PCR عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، لتحقيق الكفاءة المثلى في عملية الهضم. ثم، تعطيل إنزيم تقييد عن طريق احتضانه 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.نقل كامل رد فعل انزيم تقييد إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. في وقت لاحق، إضافة 400 ميكرولترات من 1 مرات T4 الحمض النووي رباط العازلة و 500 وحدة من T4 الحمض النووي ligase، واخلط جيدا. حجم التفاعل الكبير يشجع الربط داخل الغدد الحامات من شظايا الحمض النووي هضم.احتضان تفاعل الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لضمان الربط الكامل. بعد ساعتين، تعطيل الـ T4 للرابطة في 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم أضف 10 ميكرولترات من 10 سلفات دوديسيل صوديوم لضمان تعطيل كامل للرابطة T4.أضف كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ملليمولار، وديكستران إلى تركيز نهائي يبلغ 90 ميكروغرام لكل ملليلتر. مزيج من نبض دوامة، وتدور لفترة وجيزة أسفل مزيج رد الفعل. بعد ذلك، أضف 900 ميكرولترات من 100 إيثانول، واخلط بالانقلاب.يعجل الحمض النووي في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. و بيليه الحمض النووي المُعجل عن طريق الطرد المركزي في 14000 مرة G لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة Su-per-na-dine حسب الطموح.غسل بيليه مع 500 ميكرولترات من 70 الإيثانول. والطرد المركزي في 14000 مرة G لمدة 15 دقيقة. ثم، إزالة الإيثانول عن طريق الطموح والهواء الجافة بيليه الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.حل بيليه في 20 ميكرولترتر من الماء وإضافة 20 ميكرولترات من المزيج الرئيسي الحد من الانزيم لنتيجة في حجم رد فعل ميكرولتر 40، تحتوي على 1 مرات هضم التفاعل العازلة، 5 وحدات BSIHK-1، و 5 وحدات من SPH-1HF. عش، احتضان رد فعل انزيم تقييد في كتلة الحرارة في 37 درجة مئوية، لمدة 1 ساعة. تدور لفترة وجيزة أسفل مزيج رد الفعل، احتضان رد فعل انزيم تقييد في كتلة الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.في هذا الإجراء، إزالة أمبيركونات المحتملة من ختم حصيرة السيليكون القابلة لإعادة الاستخدام، وذلك باستخدام محلول تدهور الحمض النووي. شطف حصيرة جيدا مع الماء خال من الحمض النووي والهواء الجافة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعداد ميليلتر واحد من 1 مرات مزيج PCR تحتوي على التمهيديات الأمامية الأمامية العكسية الخارجية بتركيز 0.5 ميكرومولار.إضافة 170 ميكرولترات إذا كان 1 مرات مزيج PCR إلى الآبار A-1 و E-1، في لوحة 96 جيدا PCR. ثم، إضافة 120 ميكرولترات من 1 مرات مزيج PCR إلى الآبار B-1 و H-1. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من الحمض النووي المقلوب إلى الآبار A-1 و E-1.مزيج من رد فعل في كل بئر، عن طريق الأنابيب بلطف كل، حوالي 10 مرات باستخدام مجموعة P-1000 إلى 100 ميكرولترات. قم بتخفيف العينات من الآبار A-1 إلى D-1 بشكل متسلسل، بنسبة 1:3 عن طريق نقل 60 ميكرولترات في كل خطوة. اخلط الآبار في كل خطوة عن طريق الأنابيب بلطف حول 10 مرات باستخدام مجموعة P-1000 إلى 100 ميكروليتر.تجنب تشكيل فقاعات، كرر الإجراء لE-1 جيدا، وتمييع وصولا الى H-1 بشكل جيد. وفي وقت لاحق، خصص 10 ميكرولترات من خليط التفاعل، باستخدام ماصة متعددة القنوات، من ويلز A-1، H-1، إلى آبار A-2 و H2 و A-3 و H-3 وما إلى ذلك، حتى تصل إلى الآبار A-12 و H-12 من 96 بئراً. غطي لوحة PCR بحصيرة سليكون جافة، واضغط بقوة.ثم، ضع لوحة في جهاز PCR، وتشغيل البرنامج المشار إليه، قبل نقل لوحة إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، سخني دبابيس من 96 دبوس منسوخ إلى أحمر ساخن مع موقد بونسن، ثم يبرد لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ملء آبار لوحة PCR الثانية مع 10 ميكرولترات من 1 مرات مزيج PCR، تحتوي على عازلة هلام جاهزة، والداخلية إلى الأمام وعكس في 0.5 ميكروموللار.إزالة حصيرة السيليكون بعناية من لوحة PCR من لوحة 96 جيدا من PCR الجولة الأولى، وتجنب التلوث المتبادل بين الآبار. استخدام المكرر المبردة لنقل منتجات PCR من لوحة 96 جيدا، من أول جولة PCR، إلى لوحة 96 جيدا المخصصة حديثا. تنفيذ PCR متداخلة، وذلك باستخدام الشرط كما هو مبين.لعزل منتجات PCR، وتحليلها بواسطة جل الكهربائية، وذلك باستخدام لوحة 96 جيدا، مع 1.3 Agarose هلام. للحصول على هلام أغاروز 100 ملليلتر، تشغيل في 200 فولت لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، استئصال عصابات الحمض النووي من جل أغاروز، وذلك باستخدام قش الشرب المتاح.لكل منتج PCR، ضع القش و أجاروز هلام سد في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتقليم القش إلى حجم مع مقص. بعد ذلك، طرد المقابس Agarose في كل أنبوب، عن طريق الضغط على نهاية جزء القش. ثم إضافة 300 microliters من هلام استخراج العازلة ، وميكرلترات 5 من هلام استخراج الزجاج الخرز لكل أنبوب.استخراج منتجات PCR لكل تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة استخراج هلام، وتمييع الحمض النووي من الخرز مع 30 ميكرولترات من الماء. تقديم الحمض النووي المنقى لتسلسل Sanger ، مع التمهيدي إلى الأمام المستخدمة في الجولة الثانية المتداخلة PCR. مثال Agarose جل electrophoresis من عكسية ناجحة PCR، قبل وبعد عزل المنتج PCR، هو مبين هنا.M يمثل علامة الحمض النووي الأخيرة، كل صف من 12 يمثل التكرارات التقنية في تخفيف واحد على لوحة PCR. وفي هذه الحالة، ينبغي تحقيق منتجات PCR واحدة من خلال التخفيف من 1:3 ثانية أو الثالثة لكل عينة. في هذه التخفيفات، ما يقرب من 50٪ من المنتجات تمثل وصلات الحمض النووي خلية الفيروس الحقيقي.في حين أن النصف الآخر يمثل تضخيم وسيطات الحمض النووي HBV. وقد سمحت هذه التقنية للباحثين باستكشاف تكامل الحمض النووي للحم الحليمي البشري في أنظمة العدوى المختبرية الخاضعة للرقابة العالية. يمكن استخدام طرق إضافية، مثل تحليل المعلوماتية الحيوية، للإجابة على المزيد من الأسئلة.على سبيل المثال، إذا حدث تكامل الحمض النووي HPV في مناطق محددة في الجينوم الخلوي. لا تنس أن العمل مع العدوى فيروس التهاب الكبد B، يمكن أن تكون الضوابط العدوى الخطرة والمناسبة، مثل خزانات السلامة الحيوية والتطعيم المسبق، ينبغي دائما أن تؤخذ أثناء تنفيذ هذه العملية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...