Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
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这项工作得到了德国感染研究中心 (dzif)、ttu 肝炎项目5.807 和5.807、德国堡 schunggemeinschaft (dfg) trr179 (tp 15) 和澳大利亚艾滋病毒和肝炎病毒学研究中心的资助。
我们感谢威廉·梅森教授在开发原始的 invcr 方法并向我们展示它方面所发挥的作用。我们要感谢易妮博士和弗洛里安·伦普博士的试剂 (细胞系和乙肝病毒接种剂)。我们感谢 anja rippert、franziska schlund、sarah engelhardt 和 katin schöneweis 博士的技术援助。我们感谢 miriam kreinig 的校对, 并感谢尼古拉斯·沙克尔教授和拉尔夫·巴滕施拉格教授的持续支持。

1. 细胞感染与 dna 提取
<ol><li>在 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 中保持培养 huh7-ntcp 细胞 8, 9, 辅以10% 的 v/v 胎儿牛血清、1x penicilin\ 链霉素和 2 mm l-谷氨酰胺。 注: 这已详细报告40。</li>
	<li>种子 2 x10 5细胞/huh7-ntcp 细胞到一个12孔板与1毫升的 dmem。</li>
	<li>如果检测细胞治疗 (例如,乙肝病毒抑制剂), 将其应用于播种后 4小时 (乙肝病毒感染前 1天) 的培养上清液。对于阴性对照, 应用 200 nm myrcludex b (一种有效的 hbv 进入抑制剂 41)。</li>
	<li>使用肝素柱纯化 42上清液从汉法 38 43 作为接种剂, 在500μl 培养基中感染 1, 000 v/v 细胞的细胞 (dmem 补充 10% v/v 胎牛血清、1x Penicillin/Streptomycin、2 mm l-谷氨酰胺和 2.5% vv)dmso), 含有 4% wl w/聚乙二醇 8000 [溶于1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)]。</li>
	<li>在37°c 的孵化器中培养细胞 (设置为 5% co2和90% 湿度)。</li>
	<li>在感染后16-24小时用1毫升的无菌 1x pbs 清洗细胞。</li>
	<li>在感染乙肝病毒后每2天更换一次培养基, 直至收获。</li>
	<li>在感染后第3天, 用 5μm tenofovir diso抵抗勒和 10μm lamivudine 对细胞进行治疗, 以限制 hbv 复制中间体的生产, 这些中间体可通过 invpcr 扩增。</li>
	<li>在感染后第5天, 用200μl 的胰蛋白酶-edta 对细胞进行胰蛋白酶化, 并在2毫升的 dmem 中重新悬浮细胞 (辅以 10% vw. v. 胎牛血清, 1x penicilin\ 链霉素和 2mm l-谷氨酰胺), 还含有5μm 替诺福韦二氧基和10μm拉米夫 定。</li>
	<li>将细胞悬浮液转移到6孔板, 以诱导一轮有丝分裂 (据报道, 有丝分裂会导致 hbv cccdna 44 和其他 hbv dna 中间体的丢失, 可通过 invcr 扩增).</li>
	<li>在感染后第7天, 在400微米-edta 中对膨胀细胞进行胰蛋白酶化, 并在 dmem 的1毫升中重新悬浮混合物。将悬浮液放入 1.5 ml 管中, 以 500 x g 离心5分钟的离心将细胞颗粒, 并通过吸入去除上清液。</li>
	<li>(可选)将细胞颗粒存放在-20°c, 直到它们准备好进行 dna 提取。</li>
	<li>根据制造商的说明, 使用 dna 提取试剂盒从细胞颗粒中提取 dna。使用光学密度测量估计最终的 dna 浓度。 注: 100μl 洗脱体积的 dna 收率一般为 ~ 250-400 ngμl。</li>
</ol>2. dna 的反转
<ol><li>从步骤1到 200μl pcr 管的总 dna 提取物中, 有一个倾斜的 ~ 1.5-2.5 微克。添加适当数量的限制性酶母细胞混合, 形成含有1x 消化反应缓冲液 (例如, cut智能缓冲液) 和 10 u ncoi-hf 的40μl 反应体积. </li>
	<li>将反应彻底混合, 在一个小管离心机中旋转下来。在37°c 的 pcr 机器中培养限制性酶反应 1小时, 以获得最佳的消化效率。</li>
	<li>在80°c 孵育 20分钟, 使限制性酶失活。</li>
	<li>将整个限制性酶反应转移到 1.5 ml 管。加入400μl 的 1x t4 dna 连接酶缓冲液和 500 u t4 dna 连接酶, 并将其彻底混合。大的反应量鼓励被消化的 dna 片段的分子内 (而不是分子间) 结扎。</li>
	<li>在室温下培养结扎反应 2小时, 确保完全结扎。</li>
	<li>在70°c 下失活 t4 dna 连接酶20分钟。</li>
	<li>加入10μl 的 10% w/v 十二烷基硫酸钠, 以确保 t4 连接酶完全失活。</li>
	<li>通过脉冲涡流混合管, 并短暂旋转下反应混合物。将氯化钠添加到 100 mm 的最终浓度和90% 的浓度 (35–45 kda) 中, 最终浓度为90μgml。通过脉冲涡流混合管, 并短暂旋转下反应混合物。</li>
	<li>加入900μl 的100% 乙醇, 通过倒置搅拌。在-20°c 下一夜沉淀 dna。</li>
	<li>用 14, 000 x g 离心沉淀 dna 15分钟, 用 p200 移液器抽吸去除上清液。用500μl 的 70% v/v 乙醇清洗颗粒, 并在 14, 000 x 克离心15分钟。</li>
	<li>用 p200 移液器抽吸乙醇。在室温下将 dna 颗粒风干20分钟。</li>
	<li>溶解在20μl 的 h2o. 加入20μl 的限制性酶母料混合物, 产生40μl 反应体积, 其中含有1x 消化反应缓冲液、 5 u 的 bsihkai 和5 u 的 sphi-hf 反应. 将限制性酶反应注入在 37°c ( sphi-hf 的最佳温度) 下热块1小时。</li>
	<li>简单地旋转下反应混合物。在 65°c ( bsihkai 的最佳温度) 下, 在热块中培养限制性酶反应1小时。</li>
	<li>简单地旋转下反应混合物。</li>
	<li>将倒置的 dna 存储在-20°c, 直到下一步。</li>
</ol>3. 嵌套 pcr
<ol><li>使用 dna 降解溶液从可重复使用的硅垫密封中取出潜在的放大器, 用无 dna 的水彻底冲洗垫子, 并在室温下进行空气干燥, 同时制备 pcr 混合物。</li>
	<li>制备1毫升的 1x pcr 混合物, 其中包含外部正向 (5 '-ttc gct cct ctg cctg cac g-3 ') 和反向 (5 '-aaa gga cgt cccg ccg cg cg-3 ') 的外正向 (5 '---一度 cca ctg g-3 '), 浓度为0.5μm。</li>
	<li>在96孔 pcr 板的 a1 和 e1 井中加入1xpcr 混合物的170μl。</li>
	<li>在 b1 至 h1 井中加入1xpcr 混合物的120μl。</li>
	<li>将步骤2中的倒置 dna 添加10μl 到 a1 井和 e1 井 (可在同一 pcr 板上分析2个不同的倒置样品)。使用 p1000 设置为 100μl, 每口轻轻移液 10次, 将反应混合在每口井中。</li>
	<li>通过在每一步传输 60μl, 以1:3 的比例从 a1 到 d1 进行串行稀释样品。在每一步使用 p1000 设置为100μl 的 p1000 轻轻移液约 10次, 将井混合在一起。避免形成气泡。对油井 e1 重复步骤 3.6, 向下稀释至井 h1。</li>
	<li>在96孔板中, 用多通道移液器将反应混合物从 a1-h1 输送到 a2-h2、a3-h3 等井, 直到到达 a12-h12 井。用步骤3.1 中的干硅垫覆盖 pcr 板, 用力按压。</li>
	<li>将板材放入 pcr 机器中, 运行以下程序: 95°c 时 10分钟;95°c 时的周期为 15秒, 54°c 时为 15秒, 72°c 时周期为 3分钟;72°c 时 7分钟;然后, 在室温下按住盘子。</li>
	<li>用本森燃烧器将96针复制器的针脚加热到红热, 然后在室温下冷却至少5分钟。</li>
	<li>用10μl 的 1x pcr 混合物 (含凝胶负载就绪缓冲液) 和内部正向 (5 '-cgc atg acc gtg gtg a-3 ') 和反向 (5 '-cac agc gcda gcda gcda gcc aggcg g-3 ') 在0.5μm 处填充第二片 pcr 板的井。</li>
	<li>从第一轮 pcr 中小心地从96孔板的 pcr 板上取出硅垫, 避免井间交叉污染。</li>
	<li>利用冷却复制器将96孔板的 pcr 产物从第一轮 pcr 转移到新引用的96孔板。使用与步骤3.8 相同的条件进行嵌套 pcr, 但在95°c 时将初始变性步骤从10分钟更改为2分钟除外。</li>
</ol>4. pcr 产品分离与凝胶提取
<ol><li>用1.3% 的琼脂糖凝胶96孔对凝胶电泳技术分析了 pcr 产物。对于100毫升琼脂糖凝胶, 以 200 v 的速度运行10-15分钟。</li>
	<li>使用一次性饮用吸管对琼脂糖凝胶的 dna 带进行消费。对于每个 pcr 产品, 将秸秆和琼脂糖凝胶塞放入 1.5 ml 管中, 并用剪刀修剪秸秆以使其大小。 注: 仅从可以解析单个 pcr 产品的稀释中分离带就足够了。</li>
	<li>(可选)将管材存放在-20°C, 供以后提取。</li>
	<li>通过挤压秸秆碎片的末端, 将琼脂糖塞喷射到每个管中。在每个管中加入300μl 的凝胶萃取缓冲液和5μl 的凝胶萃取玻璃珠浆料。</li>
	<li>按照制造商关于凝胶提取试剂盒的说明提取 pcr 产品 (使用半卷清洗步骤除外), 并用30μl 的水从珠子中提取 dna。</li>
	<li>提交纯化的 dna 进行 sanger 测序 (按照供应商的说明) 与第二轮嵌套 pcr 中使用的正向引物。</li>
</ol>5. 序列分析
<ol><li>通过执行核苷酸 blast 分析 (使用与整个核苷酸集合对齐的默认设置) 确认病毒细胞 dna 连接点。 注: 以下图3详细介绍了代表性结果。<ol>
<li>如果只观察到序列的部分对齐, 请先修剪 5 ' hbv dna 序列, 然后再重新进行 blast 分析。</li>
	</ol>
</li>
	<li>应用严格的选择标准来确定给定序列是否表示真正的集成连接点, 如下所示:<ol>
<li>只包括含有 & gt;20 bp 的细胞序列的序列, 以便自信地映射到细胞基因组。</li>
		<li>忽略任何序列, 其中包含在假定的病毒细胞整合连接点的 10 bp 内使用的任何酶的限制位点, 因为它们可能代表体外结扎事件, 而不是真正的整合连接点。</li>
		<li>在测序色谱中, 忽略假定积分结两侧的任何峰值荧光水平明显不同的序列, 因为这些序列化可能是测序反应过程中交叉污染产生的伪影, 或者毛细管色谱。</li>
		<li>定义独特的整合事件, 因为那些与确切的乙肝病毒和细胞序列在病毒细胞交界处。 注: 重复独特的积分事件可能是由于 pcr 过程中含有这些积分或交叉污染的细胞的克隆扩张 (可以使用负对照反应进行测试, 在具有代表性的结果中进一步详细说明))。由于使用非同源端接路径, 预计将与特定细胞序列重复集成, 并为每个集成事件显示不同的 hbv 终端位点,因为使用了15个非同源端接路径。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通过将倒置 dna 模板的稀释因子乘以在该稀释时检测到的病毒细胞连接点的数量来计算积分频率, 然后将 dna 输入量归一化到反演反应中。一般情况下, 积分频率约为 1:104 个单元。</li>
</ol>

s. u. 是保护 Myrcludex b 作为 hbv/hdv 进入抑制剂的专利的共同申请和共同发明者。t. t. 声明没有利益冲突。

在执行该协议之前, 需要注意的是, 此入侵 pcr 检测是一种高度敏感的技术, 能够扩增 dna 模板的单个副本。因此, 限制 pcr 产品的污染至关重要。限制 pcr 产品污染的一般策略包括以下内容。(i) 为方法的不同步骤建立实际独立的区域。每个区域都应该有单独的实验室外套, 在这些区域之间移动时, 应更换手套。我们列出了以下区域, 以便从最可能受到污染的区域到最不可能受到污染的区域: pcr 产品提取和测序反应设置区域 (pcr 后);pcr 模板添加和火焰引脚转移区域 (我们使用 pcr 罩与去污紫外线灯, 效果良好);dna 提取和倒置区 (pcr 前);以及专门用于制备库存和 pcr 溶液的 "无 dna 模板" 区域。(ii) 注意实验室中的气流是交叉污染的潜在驱动因素。特别是, 在燃烧引脚转移步骤中 pcr 反应的交叉污染最有可能发生, 并将导致积分频率的定量不准确。pcr 罩可用于限制这些交叉电流。pcr 中的负控制井 (例如, myrcludex b 处理样品或无模板控制) 也可用于检测交叉污染。(iii) 通过定期使用 dna 降解溶液擦拭移液器和工作表面上潜在的 pcr 污染物来限制这些污染物。
此处指定的协议用于检测由 hep38 细胞系42产生的已知传染性乙肝病毒克隆的整合。如果所使用的接种是不同的乙肝病毒 dna 序列 (例如,从患者血清), 那么 hbv 基因组应首先测序, 以确认 pcr 引物和倒置设计的兼容性。在先前发表的研究19中, 我们使用了3套引物, 这些引物结合了保存的 hbv dna 序列, 这些引物位于预期的 hbv dna 积分连接点的两侧。还描述了其他引物序列和协议, 以确定 hbv44、45、46、47、48的基因组序列, 并可能成功工作。
此外, 还可以使用不同的 hbv 易感细胞 (例如原代人肝细胞、分化的 heprg、hepg2-ntcp 细胞);然而, 我们发现, huh7-ntcp 细胞提供了最大的信噪比, 当考虑到病毒细胞 dna 连接的数量被放大相比, 被扩增的病毒中间 dna 被放大13。特别是, 最终分化的细胞, 如原代人肝细胞或分化的 heprg 不能有效地进行有丝分裂, 导致高水平的可放大乙型肝炎病毒 dna 复制中间体留在细胞内。我们发现, 约90% 的扩增序列代表最终分化细胞中的 hbv dna 重排 (而不是整合事件), 而肝癌细胞组 13的这一比例为70–50%。这些产品通常是 hbv dna 基因组, 在表面和核心开放阅读框架中含有大量缺失, 或者它们可以代表 hbv 准物种, 在sphi 站点之前有一个额外的ncoi 位点。这些乙肝病毒物种的扩增 (包括示意图) 在以前的 13个详细介绍了。
这种方法有几个缺点。由于该协议的费力和多日性质, invpcr 不适合大量样本的高通量分析。此外, 由于它依赖于限制稀释滴定, 我们的方法在定量上并不高;不过, 它应该很容易地测量集成频率的日志级变化。
此外, 我们的反演协议只适用于检测乙肝病毒基因组 dr2 和 dr1 区域之间的整合, 因为大多数乙肝病毒整合发生在该区域49内。对乙肝病毒患者组织的 ngs 分析表明, 在这一地区49之外也可能发生很大的少数 (高达 50%)。新的 oppcr 设计理论上能够检测到这些其他集成站点, 尽管它们 (据我们所知) 尚未进行。相对地, 由于反演所需的病毒细胞结点序列下游所需的限制性酶位点, invpcr 并没有检测到 hbv 基因组 dr2 和 dr1 区域内发生的所有整合 (即,我们估计约10% 的集成是可检测到的, 在硅胶模拟13) 中使用。然而, 当应用于具有少量不同处理方法的聚焦样本时, invpcr 是在单个基对分辨率下检测 hbv 综合 dna 的唯一实用方法之一。
因此, 我们设想这种方法的应用在寻找病毒 (通过乙肝病毒接种突变)、细胞 (通过敲除或过度表达特定细胞基因, 或通过应用各种药物) 和环境 (例如,暴露于氧化应激) 诱导乙肝病毒 dna 整合的因素。通过这种方法和新开发的乙肝病毒感染系统, 我们实现了对这些因素前所未有的控制, 使其能够被很好地隔离和更好地描述。我们还期望, 这将导致对乙肝病毒 dna 整合的细胞后果的关键理解, 包括病毒抗原 (例如hbx 或 hbsag50) 在多大程度上从集成形式表达, 是什么控制了这种表达,乙肝病毒整合是否显著改变细胞表型, 走向更有利于致癌的状态。这些未来研究的结果将对用于治疗慢性乙型肝炎的治疗策略和对病毒本身的基本了解产生深远影响。

hbv 是一种双链 dna 病毒, 可引起终身慢性感染, 导致肝硬化和肝细胞癌 (hcc)1,2,3。虽然有多种分子机制驱动乙肝病毒持久性4 (例如,表观遗传病毒转录模板的高稳定性, 逃避免疫监测, 以及肝脏中肝细胞的低更替率) 及其相关hcc 发生 5,6 (例如,慢性炎症和激活细胞应激途径) 的风险, hbv dna 整合到宿主细胞基因组 (报告的这两种现象的机制) 已经研究得很差.一个主要原因是缺乏合适的乙肝病毒体外感染系统, 无法可靠地检测整合事件。在这里, 我们描述了最近开发的 hbv dna 积分体外生成和检测的协议, 可用于阐明潜在的分子机制及其后果。
乙肝病毒复制和乙肝病毒 dna 整合的形成已在前面详细回顾了 7。简单地说, 乙肝病毒进入肝细胞使用 tau胆酸钠联合运输肽 (ntcp) 作为感染的主要细胞受体8,9。hbv 核壳体含有 hbv 松弛的圆形 dna (rcdna) 基因组进入细胞核, 将 rcdna 转化为会代共价闭合的圆形 dna (cccdna)。核 cccDNA 作为病毒 rna 和基因组 rna (pgrna)10的转录模板。然后将 hbv 聚合酶和 pgrna 包装成新形成的核细胞 (由 hbv 核心蛋白质二聚体组成)。hbv pgrna 在核壳内进行逆转录酶转录, 导致 rcdna 基因组或双链线性 dna (dsldna) 基因组 11,12。这些含有 hbv dna 基因组的成熟核壳最终被包覆并作为病毒出口。
含有 dsldna 分子的包覆颗粒对肝细胞的感染可导致病毒整合到宿主细胞基因组 13中, 从而导致 hbv dna 7、14、15的复制不合格形式。hbv dna 整合发生在染色体双链 dna 断裂15。越来越多的证据表明, 每个积分事件发生在宿主细胞基因组16,17中的一个基本随机位置。此外, 乙肝病毒 dna 整合很少发生, 每 10 4个细胞中就有 1个细胞 13、18、19、20。有关乙肝病毒 dna 整合的重要问题仍未得到答案, 特别是所涉及的确切分子途径、对病毒和宿主因子的依赖、从整合形式表达的病毒抗原及其可能的贡献病毒持久性7。我们建立了一个体外模型, 以阐明其中的一些问题。
在 hbv 感染模型中, 乙肝病毒 dna 整合事件 (包括每个细胞的整合率和每个独特整合的拷贝数) 的稀缺性使其难以检测。细胞有丝分裂在我们的体外系统是有限的, 因为分裂细胞不支持有效的感染。因此, 与患者肝组织不同的是, 在患者肝细胞的显克隆扩张发生18,19, 20, 很少 (1 到 2) 副本的每一个整合存在于给定的细胞池在体外感染.我们还发现, 整合主要发生在肝细胞的初始感染期间 (而不是连续在慢性感染的肝细胞中)13。因此, hbv dna 整合不能仅仅通过延长细胞培养时间来提高。
一般而言, 以前用于检测乙肝病毒综合 dna 的方法, 包括南方印迹杂交21、22、23、24、25、alu-pcr26、27, 磁带介导的结扎 pcr28,和全基因组测序29, 30,31, 32,33, 没有灵敏度检测集成的单拷贝。我们和其他研究人员使用反向嵌套 pcr (invpcr) 检测鸭子、土木和人类感染肝脏中的肝病毒 dna整合 13,14, 18,19, 34,35,36。另一些国家对 inpcr 技术进行了程序修改, 这可能会改变假阳性信号的产生, 并限制定量的能力37。如果按照本协议的描述进行检测, invpcr 代表一种特定而敏感的检测方法, 用于识别和定量 (在绝对拷贝数中) 多个 hbv dna 积分。hbv 细胞 dna 连接以单碱基对分辨率测序, 允许在整合13的位点对病毒和宿主 dna 序列进行生物信息研究.
我们之前已经描述了38条来自 hbv 感染组织 dna 的抗光 pcr 结果, 这些组织从广泛的来源中提取, 包括冷冻肝脏组织、石蜡嵌入肝脏切片和分离出的极小的组织样本。激光显微解剖19。该协议概述了利用体外感染后从细胞培养组织中提取的 dna 进行的入侵 pcr 检测的更新版本, 其中生成的整合拷贝数量较低 (每次整合1-2 份)。体外形成的 hbv dna 积分类似于在患者组织中发现的 dbd 整合, 其分布在细胞基因组和病毒序列中的结合部, 整合13,16, 这表明在受感染的肝脏内的可比途径。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

乙型肝炎病毒 (hbv) 是一种常见的血液传播病原体, 可引起肝癌和慢性感染引起的肝硬化。这种病毒一般通过可发性 dna 中间体复制;然而, 已经观察到 hbv dna 片段整合到宿主基因组中, 尽管这种形式不是病毒复制所必需的。hbv dna 整合发生的确切目的、时间和机制尚不清楚, 但最近的数据显示, hbv dna 整合发生在感染后很早就发生了。本文详细介绍了乙型肝炎病毒 dna 积分的体外生成和检测。我们的协议专门放大病毒细胞 dna 积分的单拷贝, 并允许对结点序列进行绝对定量和单碱对解析。这项技术已被应用于各种 hbv 易感细胞类型 (包括原代人肝细胞), 各种乙肝病毒突变体, 并结合各种药物接触。我们预见这种技术将成为确定这种临床相关现象的潜在分子机制的关键分析方法。

图 1显示了发明 pcr 技术的示意图。图 2在 pcr 产品分离前后显示了一个成功的入侵 pcr 的琼脂糖凝胶电泳。图 3显示了步骤5.1 的 blast 分析输出, 即 (i) 病毒细胞 dna 连接体扩增和 (ii) hbv dna 复制中间体扩增的情况。
阳性对照的预期结果: hh7-ntcp 细胞感染肝素纯化的乙肝病毒, 如上文 (图 1) 所述 (图 1)), 可作为阳性对照。在这种情况下, 单个 pcr 产品应通过每个样品的第二或第三次1/3 稀释来实现 (相当于每次稀释约 10 4个细胞当量,图 2)。在这些稀释剂中, 大约50% 的产品将代表真正的病毒细胞 dna 连接点, 而另一半则代表 hbv dna 中间体的扩增 (图 3)。
在以前的研究13中, 我们发现很少有反复的病毒细胞连接的例子, 这表明没有细胞基因组位的优先乙肝病毒 dna 整合。我们还发现, & gt; 80% 的病毒细胞连接发生在1732和1832年的核苷酸之间 (根据 hbv 基因型 d、genotype 加入 #U95551. 等的核苷酸编号), 后者代表 hbdsdna 形式的右手末端。通过我们的体外实验方法发现的真正病毒细胞连接的序列在基因库上公开 (加入号码 mh057851 至 MH057851)。
阴性对照的预期结果: 未感染的 huh7-ntcp 细胞或接种过 myrcludex b 的 huh7-ntcp 细胞都可以起到负对照的作用。从这些细胞中提取的 dna 的 inpcr 分析不应产生 pcr 产物。将这些负对照样本作为阳性样品在同一 pcr 板上运行, 可以在嵌套 pcr 过程中检测交叉污染。交叉污染最严格的测试是在 a-d 井中运行负控制样品, 在96井板上的 e-h 井中运行阳性样品。在这种情况下, 阳性样品最集中的稀释是在与负样品的最不集中稀释相邻的一行中运行的。如果在负控样品中观察到放大产物, 请制定讨论中建议的措施, 以最大限度地减少交叉污染事件。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> 图1:invcr 检测 hbv dna 积分的发明技术示意图.乙肝病毒感染后, 只有少数 huh7-ntcp 细胞含有 hbv dsldna (红色), 整合到宿主细胞基因组 (红色) 中, 在顶部部分描述。然后从细胞中提取总 dna (步骤 1), 倒置 (步骤 2), 并通过嵌套 pcr (步骤 3) 扩增。显示的是在切除病毒细胞 dna 交界处的限制性酶位点 (ncoi 和bsihkai) 的相对位置。该数字改编自以前的一份出版物13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> 图 2: 琼脂糖凝胶电泳和随后的凝胶提取成功的入侵 pcr."m" 代表 dna 标记阶梯。每排12代表 pcr 板上一次稀释时的技术复制。每种 pcr 平台琼脂糖凝胶可检测出两个倒置 dna 样本。每次稀释的 pcr 产物应以 ~ 1/3 的比例滴定。从两个最不集中的稀释物中提取产品, 在这两个稀释剂中, 单带可以很容易地分离, 这通常是足够的, 因为 hbv dna 整合率是通过端点滴定法确定的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> 图 3: 对入侵 pcr 产品序列的 blast 分析.由于 sanger 测序产生了长的序列, dna 序列的来源通常是明确的。在顶部面板的 sanger 测序生成的 fasta 序列文件的不同区域观察到与 hbv 和细胞基因组的强对齐, 这表明存在真正的病毒细胞 dna 连接点。在底部面板中, 序列只与 hbv 基因组的片段对齐, 这表明通过重新排列的 hbv dna 基因组的扩增而产生的产物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

我们这里描述了 hbv dna 的体外生成通过乙型肝炎病毒感染系统和高度敏感的检测其 (1-2 拷贝) 整合使用反向嵌套 pcr。

乙型肝炎体外感染形成的低拷贝数综合病毒 dna 的检测

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

此方法可用于回答乙型肝炎病毒学中的关键问题，例如发现影响HPVDNA整合的细胞或病毒学因素。这种技术有多种优点。它相对便宜，而且易于执行，分析结果很简单，而且非常敏感，归结为单份。虽然此方法可用于提供对 HBV 集成的见解，但也可用于集成到宿主细胞基因组的其他病毒，如 HIV、HTLV-1 或 HPV。为了感染这些细胞，每毫升在12个井盘中播种20万个细胞，用1毫升D-mem。第二天，使用 HEP-AD 38 中的 Heparin 柱纯化 su-na-din 作为 inoculant，以每细胞 1，000 VGE 的速度感染细胞，在 500 微升培养基中感染细胞。然后，在37摄氏度下培养细胞。然后，第二天，用一毫升无菌PBS清洗细胞两次。然后，每2天更换一次培养，直到收获。在感染后的第3天，用5微摩尔特诺福韦异体和10微摩尔拉米夫定治疗细胞，以限制通过反向PCR放大的HBV复制中间体的生产。在第5天，感染后，用200微升的三丁辛EDTA对一些细胞进行三试，并在含有5微摩尔特诺福韦去洛西和10微摩尔拉米夫丁的2毫升D-mem中重新悬浮。随后，将细胞悬浮液转移到六井板，诱导一轮线粒体。在感染后的第7天，在400微升的尝试性细胞的尝试，并在1毫微的D-mem中悬浮混合物。然后，在1.5毫升管中转移悬浮液。在500倍G下离心，使细胞分裂5分钟。并删除苏每纳丁的愿望。根据制造商的指示，使用DNA提取试剂盒从细胞颗粒中提取DNA。对于DNA反转，将总DNA提取物的1.5至2.5微克分配到200微升PCR管中。接下来，加入适当数量的限制性酶主混合，产生40微升的反应量，含有1倍的消化反应缓冲液和10个单位NCO-1HF。在37摄氏度的PCR机中孵育限制性酶反应一小时，以获得最佳的消化效率。然后，通过孵育80摄氏度20分钟，使限制酶灭活。将整个限制性酶反应转移到1.5毫升管中。随后，加入400微升1倍T4 DNA连体缓冲液和500单位T4DNA连体，并彻底混合。大反应量鼓励消化的DNA片段的分子内结扎。在室温下孵育结扎反应2小时，确保完全结扎。2小时后，在70摄氏度下灭活T4 DNA连结酶20分钟。然后，加入10微升的10钠硫酸钠，以确保T4利塞完全灭活。将氯化钠加入到100毫摩尔的最终浓度中，将脱氧二氧化碳加入每毫升90微克的最终浓度。通过脉冲涡旋混合，并短暂地旋转反应混合。接下来，加入900微升100乙醇，通过反转混合。一夜之间将DNA沉淀在负20摄氏度。在14000次G下离心，在15分钟内对沉淀的DNA进行颗粒化。之后，通过渴望去除苏/纳-用餐。用 500 微升 70 乙醇清洗颗粒。并在 14000 次 G 下离心 15 分钟。然后，通过吸气去除乙醇，并在室温下风干DNA颗粒20分钟。将颗粒溶解在20微升水中，加入20微升的限制性酶主混合，产生40微升反应量，含有1倍消化反应缓冲液、5个单位BSIHK-1和5个单位的SPH-1HF。巢，孵育限制酶反应在37摄氏度的热块，1小时。简要地旋转反应混合物，在65摄氏度的热块中孵育限制性酶反应1小时。在此过程中，使用 DNA 降解溶液从可重复使用的硅垫密封件中去除潜在的安普利森。用脱氧核糖核酸水彻底冲洗垫子，并在室温下风干。接下来，准备一毫器的1倍PCR混合包含外向和反向底向在浓度为0.5微摩尔。如果 1 倍 PCR 混合到 96 孔 PCR 板中的 A-1 和 E-1 井中，则添加 170 微升。然后，在B-1和H-1井中加入1倍PCR混合的120微升。之后，在 A-1 和 E-1 井中加入 10 微升的倒置 DNA。使用 P-1000 设置为 100 微升，通过轻轻移液每个井中的反应混合约 10 次。通过在每个步骤中转移 60 微升，以 1：3 的比例连续稀释从 A-1 到 D-1 的样品。使用 P-1000 设置为 100 微升，轻轻移液 10 次，将孔在每一步混合。避免形成气泡，重复井 E-1 的过程，稀释到井 H-1。随后，使用多通道移液器将10微升反应混合物从井中的 A-1、H-1 放入井中，进入 A-2、H2、A-3、H-3 等油井，直到到达 96 孔板的 A-12、H-12 井。用干硅垫盖住 PCR 板，然后用力按压。然后，将板放在 PCR 机器中，然后运行指示的程序，然后再将板传输到室温。之后，使用 Bunsen 燃烧器将 96 针复制器的引脚加热至红热，然后在室温下冷却至少 5 分钟。用 10 微升 1 倍 PCR 混合的孔填充第二个 PCR 板的孔，包含凝胶负载就绪缓冲液，内向和反向为 0.5 微摩尔。小心地将硅垫从第一轮 PCR 的 96 孔板的 PCR 板上拆下，避免井间交叉污染。使用冷却的复制器将 96 井板的 PCR 产品从第一轮 PCR 传输到新分配的 96 井板。执行嵌套的 PCR，使用指示的条件。要分离 PCR 产品，请使用 96 井板和 1.3 Agarose 凝胶，通过凝胶电泳分析它们。对于 100 毫升的阿加罗斯凝胶，以 200 伏特运行 10 到 15 分钟。之后，使用一次性吸管从阿加罗斯凝胶中切除DNA带。对于每个 PCR 产品，将吸管和 Agarose 凝胶塞插入 1.5 毫升管中，用剪刀修剪吸管大小。之后，通过挤压稻草碎片的末端，将阿加罗斯插头弹出到每个管中。然后在每个管中加入300微升凝胶提取缓冲液和5微升凝胶提取玻璃珠。根据制造商对凝胶提取套件的说明提取 PCR 产品，用 30 微升水稀释珠子中的 DNA。提交桑格测序的纯化DNA，使用第二轮嵌套PCR中使用的前底。此处显示了一个成功反向 PCR 的 Agarose 凝胶电泳示例，该示例在 PCR 产品隔离之前和之后。M 代表后者的 DNA 标记，每行 12 表示 PCR 板上单个稀释时的技术复制。在这种情况下，单个 PCR 产品应通过每个样品的第二次或第三次 1：3 稀释实现。在这些稀释时，大约50%的产品将代表真正的病毒细胞DNA结。而另一半代表HBVDNA中间体的放大。这项技术使研究人员能够探索HPVDNA在高度控制的体外感染系统中的整合。其他方法，如生物学分析，可用于回答进一步的问题。例如，如果HPV DNA整合发生在细胞基因组的特定区域。不要忘记，在执行这些程序时，应始终使用感染乙型肝炎病毒（可能具有危险和适当的感染控制，如生物安全柜和事先接种疫苗）。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

从核衣壳的病毒DNA的制备

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

科研

免疫与感染

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

建立一个<em&gt;在体外</em&gt;系统来研究细胞内的行为<em&gt;光滑念珠菌</em&gt;在人THP-1巨噬细胞

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

检测真正的IgE的表达小鼠B​​系细胞

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

冻干环介导等温扩增试剂的检测中的发展<em&gt;贝氏柯克斯体</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

通过酶联凝集素测定来测量神经氨酸酶流感抑制抗体滴度

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

在动物标本呼吸道病原体的高通量检测通过纳米PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

乙型肝炎病毒记者系统的开发监控复制周期的早期阶段

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

人类诺沃克病毒的表面上检测拭子采样方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

病毒 DNA 的纯化及相关病毒和细胞蛋白的鉴定

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

乙型肝炎病毒感染原代肝细胞和库珀细胞的 "肝片上" 培养

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...