Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

Dette arbejde fik støtte fra den tyske infektion forskning (DZIF), TTU Hepatitis projekter 5.807 og 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15), og den australske Center for HIV og Hepatitis virologi forskning.
Vi står i gæld til Professor William Mason for sin rolle i udviklingen af den oprindelige invPCR metode og viser det til os. Vi vil gerne takke Drs. Yi Ni og Florian A. Lempp for reagenser (cellelinjer og HBV inokulum). Vi anerkender Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt og Dr. Katrin Schöneweis for teknisk bistand. Vi er taknemmelige for Miriam Kleinig til korrekturlæsning og professorer Nicholas Shackel og Ralf Bartenschlager for løbende support.

1. celle infektion og DNA-ekstraktion
<ol><li>Vedligeholde kulturperler Huh7-NTCP celler8,9 i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% v/v føtal bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin. Bemærk: Er det tidligere blevet rapporteret i detaljer40.</li>
	<li>Frø 2 x 105 celler/mL Huh7-NTCP celler ind i en 12-godt plade med 1 mL af DMEM.</li>
	<li>Hvis test celle behandlinger (fx HBV hæmmere), anvende dem til kultur supernatanten 4 h efter såning (1 dag før HBV infektion). For en negativ kontrol, anvende 200 nM Myrcludex B (en potent HBV post hæmmer41).</li>
	<li>Brug heparin-kolonne renset42 supernatanten fra HepAD3843 som et inokulum for at inficere celler på 1.000 VGE/celle i 500 µL af kultur medier (DMEM suppleret med 10% v/v føtal bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-glutamin og 2,5% v/v DMSO), som indeholder 4% w/v polyethylenglycol 8000 [opløst i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS)].</li>
	<li>Kultur cellerne i et 37 ° C inkubator (sat til 5% CO2 og 90% fugtighed).</li>
	<li>Cellerne vaskes to gange med 1 mL sterilt 1 x PBS på 16-24 h efter infektionen.</li>
	<li>Erstatte kultur medierne hver 2 dage efter HBV infektion indtil høsten.</li>
	<li>På dag 3 efter infektion, behandling af celler med 5 µM Tenofovir disoproxil og 10 µM lamivudin begrænse produktionen af HBV replicative mellemprodukter, der er amplifiable af invPCR.</li>
	<li>På dag 5 efter infektionen, trypsinize celler med 200 µL af Trypsin-EDTA og resuspend dem i 2 mL af DMEM (suppleret med 10% v/v føtal bovint serum, 1 x Penicillin/Streptomycin og 2 mM L-glutamin), der også indeholder 5 µM Tenofovir disoproxil og 10 µM Lamivudin.</li>
	<li>Overføre celle suspensioner til en 6-godt plade til at fremkalde en runde i mitosen (som er blevet rapporteret til at fremkalde tab af HBV cccDNA44 og andre HBV DNA mellemprodukter, der er amplifiable af invPCR).</li>
	<li>På dag 7 efter infektionen, trypsinize de udvidede celler i 400 µL af Trypsin-EDTA og resuspend blandingen i 1 mL DMEM. Placer suspension i en 1,5 mL tube, sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min, og Fjern supernatanten ved aspiration.</li>
	<li>(Valgfrit) Opbevar celle pellets ved-20 ° C, indtil de er klar til DNA-ekstraktion.</li>
	<li>Uddrag af DNA fra celle pellet ved hjælp af en DNA-ekstraktion kit, ifølge producentens anvisninger. Vurdere den endelige DNA koncentration ved hjælp af optisk densitometri. Bemærk: DNA udbyttet i en 100 μL eluering volumen er generelt ~ 250-400 ng/μl.</li>
</ol>2. inversion af DNA
<ol><li>Alikvot ~1.5–2.5 μg af det samlede DNA uddrag fra trin 1 i en 200 μl PCR rør. Tilføje den passende mængde begrænsning enzym master-blanding til at resultere i en 40 μL reaktion volumen indeholdende 1 x digest reaktion buffer (fx., CutSmart buffer) og 10 U Ncojeg-HF.</li>
	<li>Bland Reaktionerne grundigt og spin ned i en lille tube centrifuge. Inkuber begrænsning enzym reaktion i en PCR-maskine ved 37 ° C i 1 time til optimal fordøjelse effektivitet.</li>
	<li>Deaktiver begrænsning enzym ved at inkubere ved 80 ° C i 20 min.</li>
	<li>Overføre hele begrænsning enzym reaktion på en 1,5 mL tube. Tilsæt 400 μL 1 x T4 DNA ligase buffer og 500 U af T4 DNA ligase og bland det grundigt. Den store reaktion volumen tilskynder intra molekylære (i modsætning til Inter Molekylær) ligatur af fordøjet DNA fragmenter.</li>
	<li>Inkuber ligatur reaktion ved stuetemperatur i 2 timer til at sikre komplet ligatur.</li>
	<li>Inaktivere T4 DNA ligase ved 70 ° C i 20 min.</li>
	<li>Tilføje 10 μl af 10% w/v sodium dodecyl sulfat til at sikre fuldstændig inaktivering af T4 ligase.</li>
	<li>Bland rør ved puls vortexing og kortvarigt spin ned mastermix. Tilføje NaCl til en endelig koncentration på 100 mM og dextran (35 – 45 kDa) til en slutkoncentration på 90 µg/mL. Bland rør ved puls vortexing og kortvarigt spin ned mastermix.</li>
	<li>Tilføje 900 μl af 100% ethanol og mix af inversion. Udfældes DNA ved-20 ° C natten over.</li>
	<li>Pellet udfældet DNA ved centrifugering ved 14.000 x g i 15 min. Fjern supernatanten ved aspiration med P200 pipette. Vask pellet med 500 μL af 70% v/v ethanol og centrifugering ved 14.000 x g i 15 min.</li>
	<li>Fjerne ethanolen ved aspiration med P200 pipette. Lufttørre DNA pellet ved stuetemperatur i 20 min.</li>
	<li>Opløse pellet i 20 μL af H2O. tilføje 20 μL af en restriktion enzym master-blanding til at resultere i en 40 μL reaktion volumen indeholdende 1 x digest reaktion buffer, 5 U i BsiHKAI og 5 U i Sph-HF. Incubate begrænsning enzym reaktion i en varme-blok ved 37 ° C (den optimale temperatur for Sphjeg-HF) i 1 h.</li>
	<li>Kort spin ned mastermix. Inkuber begrænsning enzym reaktion i en varme-blok på 65 ° C (den optimale temperatur for BsiHKAI) i 1 time.</li>
	<li>Kort spin ned mastermix.</li>
	<li>Gemme den inverterede DNA ved-20 ° C indtil det næste skridt.</li>
</ol>3. indlejrede PCR
<ol><li>Fjerne potentielle amplikoner fra en genanvendelig silicium mat tætning ved hjælp af en DNA nedbrydning løsning, skyl mat grundigt med DNA-gratis vand og lufttørre det ved stuetemperatur mens de forbereder PCR-blandingen.</li>
	<li>Forberede 1 mL af en 1 x PCR blanding indeholdende den ydre frem (5'-TTC GCT TCA FTT CTG CAC G-3') og omvendt (5'-AAA GGA KBRT CCC GCG CAG-3') primere i en koncentration på 0,5 µM.</li>
	<li>Tilføje 170 μL af 1 x PCR blandingen til brønde A1 og E1 i en 96-brønd PCR plade.</li>
	<li>Tilsæt 120 μL af 1 x PCR mix brønde B1 til H1.</li>
	<li>Tilsættes 10 μL inverteret DNA fra trin 2 brønde A1 og E1 (2 forskellige inverteret prøver kan analyseres på de samme PCR-plade). Mix reaktion i hver brønd ved forsigtigt pipettering hver omkring 10 gange ved hjælp af en P1000 indstillet til 100 μL.</li>
	<li>Seriefremstillede fortyndede prøver fra wells A1 til D1 i forholdet 1:3 ved at overføre 60 μl på hvert trin. Bland brønde på hvert trin af forsigtigt pipettering dem om 10 gange ved hjælp af en P1000 indstillet til 100 μL. Undgå at danne bobler. Gentag trin 3.6 for godt E1, fortynding ned til godt H1.</li>
	<li>Alikvot 10 μL af reaktionsblandingen benytter en multikanal-pipette af wells A1-H1 i brønd A2-H2, A3-H3, og så videre indtil nå pladens huller A12-H12 96-brønd. Dække PCR-plade med tørre silicium mat fra trin 3.1, at trykke på fast.</li>
	<li>Pladen anbringes i en PCR-maskine og køre følgende program: 10 min. ved 95 ° C; 35 cyklusser af 15 s ved 95 ° C, 15 s på 54 ° C og 3 min ved 72 ° C; 7 min. ved 72 ° C; derefter holde pladen ved stuetemperatur.</li>
	<li>Varme stifter af en 96-pin replicator til rødglødende med en bunsenbrænder og afkøles i mindst 5 min. ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fylde brøndene af en anden PCR-plade med 10 μL af 1 x PCR mix (der indeholder en gel belastning-ready buffer) og den indre frem (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') og omvendt (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') på 0,5 µM.</li>
	<li>Omhyggeligt fjerne silicium måtten fra PCR-plade af 96-brønd plade fra første runde PCR, og undgå krydskontaminering mellem brønde.</li>
	<li>Brug den afkølede replicator overførsel PCR-produkter af 96-brønd plade fra første runde PCR til den nyligt aliquoted 96 brønde plade. Udføre den indlejrede PCR ved hjælp af de samme betingelser som i trin 3.8, undtagen ændre det oprindelige denaturering skridt ved 95 ° C fra 10 min til 2 min.</li>
</ol>4. PCR produkt Isolation og Gel udvinding
<ol><li>Analysere PCR-produkter af gelelektroforese ved hjælp af en 96-brønd med 1,3% w/v agarosegel. Til en 100 mL agarosegel, køre på 200 V for 10-15 min.</li>
	<li>Punktafgifter DNA bands fra agarosegelitris bruge engangs drikke sugerør. For hver PCR produkt, placere halmen og agarosegel tilsluttes en 1,5 mL tube og trim halm til størrelse med saks. Bemærk: Det er tilstrækkeligt at isolere bands kun fra de fortyndinger som enkelt PCR produkter kan løses.</li>
	<li>(Valgfrit) Gemme rør ved-20 ° C for senere udvinding.</li>
	<li>Skubbe Agarosen stik i hver tube ved at klemme på enden af den halm fragment. Tilføje 300 μL af gel ekstraktionsbuffer og 5 μl af gel udvinding glas perle gylle til hver tube.</li>
	<li>Uddrag af PCR produkter ifølge producentens anvisninger for gel udvinding kit (undtagen ved hjælp af halv-diskenheder til at vaske trin) og elueres DNA fra perler med 30 μL af vand.</li>
	<li>Indsend oprenset DNA til Sanger sekventering (ifølge leverandørens anvisninger) med den fremadrettede primer anvendes i anden runde indlejret PCR.</li>
</ol>5. Sekvensanalyse
<ol><li>Bekræfte virus-celle DNA vejkryds ved at udføre nukleotid BLAST analyse (ved hjælp af standardindstillingerne for tilnærmelse til samlingen hele nukleotid). Bemærk: Repræsentative resultater er beskrevet i figur 3 nedenfor.<ol>
<li>Hvis der kun delvis justering af sekvensen er observeret, trim 5' HBV DNA sekvens før du igen kører en BLAST analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gælde strenge udvælgelseskriterier for at afgøre, om en given sekvens repræsenterer en sand integration junction som følger:<ol>
<li>Omfatter kun sekvenser der indeholder > 20 bp af en cellulær sekvens for sikker tilknytning til cellular genomet.</li>
		<li>Se bort fra enhver sekvenser, der indeholder begrænsning websteder af alle enzymer, der anvendes inden for 10 bp formodede virus-celle integration vejkryds, som de sandsynligvis repræsenterer in vitro- ligatur arrangementer snarere end ægte integration vejkryds.</li>
		<li>Se bort fra enhver sekvenser med indlysende ulige peak fluorescens niveauer på begge sider af den formodede integration junction i sekventering gaskromatografer, da disse er sandsynligvis artefakter genereret af krydskontaminering under sekventering reaktion eller kapillar kromatografi.</li>
		<li>Definere unik integration begivenheder som dem med nøjagtige HBV og cellulære sekvenser i virus-celle krydset. Bemærk: Gentagelse af unik integration begivenheder kan skyldes klonal ekspansion af celler, der indeholder disse integrationer eller kontaminering under PCR (som kan testes ved hjælp af negative-kontrol reaktioner, yderligere detaljerede i de repræsentative resultater nedenfor). Gentagne integrationer til specifikke cellulære sekvenser forventes at vise forskellige HBV terminal websteder for hver hændelse, integration, som ikke-homologe at deltage i slutningen veje er brugt15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beregne integration frekvens ved at multiplicere fortyndingsfaktoren inverteret DNA skabeloner med antallet af virus-celle vejkryds opdaget på den fortynding, efterfulgt af normalisering til mængden af samlede DNA input i inversion reaktion. Generelt, integration frekvens er på rækkefølgen af 1:104 celler.</li>
</ol>

S.U. er en co ansøgeren og medopfinderen af patenter beskytter Myrcludex B som en HBV/HDV post hæmmer. T.T. erklærer ingen interessekonflikter.

Før du udfører protokollen, er det vigtigt at bemærke, at denne invPCR assay er en yderst følsom teknik, i stand til at forstærke enkelt kopier af DNA skabelon. Derfor er begrænse forurening fra PCR produkter af allerstørste betydning. Generelle strategier til at begrænse PCR produktkontaminering omfatter følgende. a etablere fysisk adskilte områder til forskellige trin i metoden. Hvert område skal have separate lab frakker, og handsker bør ændres, når du flytter mellem disse områder. Vi har opført disse områder nedenfor i rækkefølge fra mest at det mindste sandsynligt være kontamineret: PCR produkt udvinding og sekventering reaktion set-up område (post-PCR); PCR skabelon tilsætning og flammede-benet overføre område (vi har brugt PCR emhætter med en dekontaminering UV lampe med gode resultater); DNA-ekstraktion og inversion område (pre-PCR); og et "DNA-skabelon-fri" område anvendes udelukkende til udarbejdelsen af materiel og PCR løsninger. (ii) være opmærksom på luft flow i lab som en potentiel drivkraft for krydskontaminering. Især krydskontaminering af PCR reaktioner under trinnet flammede pin overførsel er mest sandsynligt at forekomme og vil føre til unøjagtige kvantificering af integration frekvens. PCR hætter kan bruges til at begrænse disse cross-strømme. Negativ kontrol wells (f.eks. Myrcludex B-behandlede prøver eller ingen skabelon kontrol) i PCR kan også bruges til at teste for krydskontaminering. (iii) begrænse potentielle PCR forureninger på pipetter og arbejde overflader jævnligt tørre dem med en DNA nedbrydning løsning.
Den protokol, der er angivet her er arrangeret at opdage integration af en kendt smitsomme HBV klon genereret fra HepAD38 celle linje42. Hvis inokulum bruges af en anden HBV DNA sekvens (f.eks. fra patientens serum), bør derefter HBV genom være første sekventeret for at bekræfte kompatibilitet af PCR primere og inversion design. I tidligere offentliggjorte studier19, har vi brugt 3 sæt primere, som binder bevarede HBV DNA sekvenser flankerer den forventede site af HBV DNA integration vejkryds. Andre primer sekvenser og protokoller er blevet beskrevet til at bestemme genomisk rækkefølgen af HBV44,45,46,47,48 og kan arbejde med succes.
Derudover kan forskellige HBV-følsomme celler (f.eks. primære humane hepatocytter, differentierede HepaRG, HepG2-NTCP celler) bruges; Vi har dog konstateret, at Huh7-NTCP celler giver den største signal / støj-forhold, når de overvejer antallet af virus-celle DNA vejkryds, der er forstærket i forhold til virus mellemliggende DNA, der er forstærket13. Især undergår terminalt differentieret celler som primære humane hepatocytter eller differentierede HepaRG ikke effektivt mitose, hvilket resulterer i et højt niveau af amplifiable HBV DNA replicative mellemprodukter resterende i cellerne. Vi har fundet, at ~ 90% af forstærkede sekvenser repræsenterer HBV DNA rearrangementer (og ikke integration begivenheder) i terminalt differentieret celler, i forhold til 70-50% i hepatoma celle linjer13. Disse produkter er generelt HBV DNA genomer indeholdende store sletninger i overfladen og core åben læsning rammer, eller de kan repræsentere HBV kvasi arter med en ekstra Ncojeg site forud for Sphjeg site. Forstærkningen af disse HBV arter (herunder et skematisk diagram) er blevet beskrevet i detaljer tidligere13.
Der er flere ulemper til denne metode. På grund af den besværlige og multi-dages karakter af denne protokol, er invPCR ikke velegnet til høj overførselshastighed analyser af et stort antal prøver. Desuden, som det bygger på begrænsning af fortynding titrering, vores metode er ikke meget præcise i kvantificering; selv om det bør nemt måle log-niveau ændringer i integration frekvens.
Desuden er vores inversion protokol kun egnet til at opdage integrationer mellem regionen DR2 og DR1 af HBV genom, som fleste af HBV integrationer forekomme inden for denne region49. NGS analyse af HBV patient væv har vist, at et stort mindretal (op til ~ 50%) kan også forekomme uden for denne region49. Nye invPCR designs er teoretisk købedygtig opdager disse andre websteder, integration, selv om de har ikke (til vores viden) blevet gennemført endnu. Boligområdet, på grund af de nødvendige begrænsning enzym steder kræves nedstrøms fra virus-celle junction sekvens for inversion reaktion, invPCR ikke registrerer alle integrationer forekommer inden for DR2 og DR1 regionerne af HBV genom (dvs, vi har anslået at ~ 10% af alle integrationer kan registreres ved hjælp af i siliciummangan simuleringer13). Men når de påføres en fokuseret batch af prøver med et lille antal forskellige behandlinger, invPCR er en af de eneste praktiske metoder til påvisning af integrerede HBV DNA på en enkelt basepar opløsning.
Vi derfor envision anvendelser af denne metode tjener en nøglerolle i at finde viral (via mutationer af HBV inokulum), cellular (gennem knockout eller overekspression af specifikke cellulære gener, eller ved anvendelse af forskellige stoffer) og miljømæssige ( fx eksponering for oxidativt stress) faktorer, der inducerer HBV DNA integration. Med denne metode og nyudviklede HBV infektion systemer aktivere vi hidtil uset kontrol af disse faktorer, så de kan være godt isoleret og bedre karakteriseret. Vi forventer også, at dette vil føre til en afgørende forståelse af cellulære konsekvenserne af HBV DNA integration, herunder til hvilken grad virale antigener (fx HBx eller HBsAg50) udtrykkes fra integreret form, hvad styrer dette udtryk, og eller ej HBV integration væsentligt ændrer den cellulære fænotype hen imod en mere pro-mutationer tilstand. Resultaterne af disse fremtidige undersøgelser vil have en dybtgående indflydelse på de terapeutiske strategier, der anvendes til behandling af kronisk hepatitis B og på den grundlæggende forståelse af selve virus.

HBV er en dobbelt-strenget DNA-virus, der kan forårsage livslang kronisk infektion, føre til skrumpelever og hepatocellulært carcinom (HCC)1,2,3. Mens der er flere molekylære mekanismer HBV persistens4 (f.eks. høj stabilitet i den epigenetiske viral transcriptional skabelon), unddragelse af immun overvågning og lav omsætning af hepatocytter i leveren og dens tilknyttede kørsel risiko for HCC indledning5,6 (fx, kronisk inflammation og aktivering af cellulære understrege veje), HBV DNA integreres vært celle genomet (en rapporteret mekanisme for begge disse fænomener) er blevet dårligt undersøgt . En væsentlig årsag er manglen på egnede in vitro- infektion systemer for HBV der tillader pålidelig detektering af integration begivenheder. Her, beskriver vi en nyligt udviklede protokol for både in vitro- generation og påvisning af HBV DNA integrationer, der kan bruges til at belyse de underliggende molekylære mekanismer og følgerne heraf.
HBV replikering og dannelsen af HBV DNA integration er tidligere blevet gennemgået i detaljer7. Kort, HBV træder hepatocytter med natrium Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) som den vigtigste cellulær receptor for infektion8,9. HBV nucleocapsids indeholdende HBV-afslappet cirkulære DNA (rcDNA) træder genom atomkernen, hvor rcDNA omdannes til episomal kovalent lukkede cirkulære DNA (cccDNA). Den nukleare cccDNA fungerer som skabelonen transcriptional for viral mRNAs og pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV polymerase og pgRNA er så pakket ind i nydannede nucleocapsids (sammensat af HBV core protein dimerer). HBV pgRNA er omvendt-transskriberet inden for nucleocapsid, hvilket resulterer i enten en rcDNA genom eller en dobbelt-strenget lineære DNA (dslDNA) genom11,12. Disse modne nucleocapsids indeholdende HBV DNA genomer er endelig indhyllet og eksporteres som virioner.
Infektion af hepatocytter af indhyllede partikler indeholdende dslDNA molekyler kan resultere i viral integration i den vært celle genom13, fører til replikering-inkompetente former for HBV DNA7,14,15. HBV DNA integration opstår i stedet for kromosomale dobbelt-strenget DNA pauser15. Akkumulere beviser tyder på, at hver integration begivenhed forekommer i en stort set tilfældig position inden for værten celle genom16,17. Derudover HBV DNA integration sker noget sjældent, med en hastighed på 1 / 104 celler13,18,19,20. Vigtige spørgsmål vedrørende HBV DNA integration forbliver ubesvarede, især med hensyn til præcise molekylære veje involveret, afhængigheden af viral og vært faktorer, de virale antigener udtrykt fra integrerede formularer og deres mulige bidrag til viral persistens7. Vi har oprettet en in vitro- model til at kaste lys over nogle af disse spørgsmål.
Sjældenhed af HBV DNA integration events (både med hensyn til integration sats pr. celle og eksemplarnummer hver unik integration) i in vitro- HBV infektion modeller gør dem udfordrende for at opdage. Celle mitosen er begrænset i vores in vitro- system, som delende celler ikke understøtter effektiv infektion. Således, i modsætning til i patientens leveren væv hvor betydelig klonal ekspansion af hepatocytter opstår18,19,20, meget få (1 til 2) kopier af hver integration er til stede i en given gruppe af celler inficeret in vitro- . Vi har også fundet, at integration hovedsagelig opstår under den initiale infektion af hepatocytter (og ikke løbende i kronisk inficeret hepatocytter)13. I overensstemmelse hermed, HBV DNA integration ikke kan øges ved simpelthen dyrkning af celler i en længere periode.
I almindelighed, duppes tidligere metoder til at opdage integreret HBV DNA, herunder sydlige hybridisering21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kassette-medieret ligatur PCR28, og hele genome sequencing29,30,31,32,33, ikke har følsomhed til at opdage Single-kopier af integrationer. Vi og andre forskere har brugt inverse indlejret PCR (invPCR) for at registrere hepadnaviral DNA integration i duck, woodchuck og menneskelige inficerede lever13,14,18,19, 34,35,36. Andre har indført proceduremæssige ændringer til invPCR teknik, der kan ændre generation af falsk-positive signaler og begrænse muligheden for kvantificering37. Hvis analysen udføres som beskrevet i denne protokol, repræsenterer invPCR en specifik og følsom analyse, som identificerer og kvantificerer (i absolut kopi numre) flere HBV DNA integrationer. HBV-celle DNA krydset er sekventeret på en enkelt-basepar resolution, så bioinformatical undersøgelser af viral og vært DNA sekvenser på steder, hvor integration13.
Vi har tidligere beskrevet38 resultater fra invPCR på DNA af HBV-inficeret væv udvundet fra en lang række kilder, herunder snap-frosne leveren væv, paraffin-embedded lever sektioner og ekstremt små vævsprøver isoleret af laser-microdissection19. Denne protokol beskriver en opdateret version af en invPCR analyse ved hjælp af DNA ekstraheret fra celle kultur-afledte væv efter in vitro- infektion, som genereres lav kopi numre af integrationer (1 – 2 kopier pr. integration). HBV DNA integrationer dannet i vitro ligner dem der findes i patientens væv på deres distribution over det cellulære genom og krydset i den viral sekvens, der er integreret13,16, tyder på en sammenlignelige vej til inden for en inficeret leveren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

Hepatitis B Virus (HBV) er en fælles blodbårne patogener, der forårsager leverkræft og lever cirrose som følge af kronisk infektion. Virussen normalt replikater gennem en episomal DNA mellemliggende; dog har integration af HBV DNA fragmenter i vært genom overholdt, selv om denne form ikke er nødvendige for viral replikation. Nøjagtige formål, timing og mekanismer af hvilke HBV DNA integration sker er endnu ikke klart, men de seneste data viser, at det sker meget tidligt efter infektion. Her, er in vitro- generation og påvisning af HBV DNA integrationer beskrevet i detaljer. Vores protokol specifikt forstærker enkelteksemplarer af virus-celle DNA integrationer og giver mulighed for både absolutte kvantificering og enkelt-basepar opløsning af krydset sekvens. Denne teknik er blevet anvendt til forskellige HBV-modtagelige celletyper (herunder primær humane hepatocytter), til forskellige HBV mutanter og i forbindelse med forskellige stof engagementer. Vi forudser denne teknik bliver en nøgle assay til at bestemme de underliggende molekylære mekanismer af denne klinisk relevante fænomen.

En skematisk gengivelse af invPCR teknikken er vist i figur 1. Et eksempel Agarosen gelelektroforese af en succesfuld invPCR er vist i figur 2 før og efter PCR produkt isolation. Figur 3 viser den BLAST analyse output fra trin 5.1 i tilfælde af (i) forstærkning af virus-celle DNA junction og (ii) forstærkning af HBV DNA replicative mellemliggende.
Forventede resultater fra positive kontroller: Huh7-NTCP celler inficeret med heparin-renset HBV bestande som beskrevet ovenfor (figur 1) kan tjene som positiv kontrol. I dette tilfælde, bør single PCR produkter opnås ved anden eller tredje 1:3 fortynding af hver prøve (svarende til ~ 104 celle ækvivalenter pr. fortynding, figur 2). På disse fortyndinger, vil cirka 50% af produkter repræsenterer ægte virus-celle DNA vejkryds, mens anden halvdelen repræsenterer forstærkning af HBV DNA mellemprodukter (figur 3).
I tidligere studier13, har vi fundet få forekomster af gentagne virus-celle vejkryds, foreslår ingen cellulære genomisk lokaliteter af præferentiel HBV DNA integration. Vi finder også, at >80% af virus-celle vejkryds sker mellem nukleotider 1732 og 1832 (ifølge nukleotid nummereringen af HBV genotype D, GenBank tiltrædelse #U95551.1), hvor sidstnævnte repræsenterer den højre endestation for HBV dslDNA form. Sekvenser af ægte virus-celle vejkryds fundet gennem vores metode i in vitro- eksperimenter er offentligt tilgængelige på GenBank (tiltrædelse numre MH057851 til MH058006).
Forventede resultater fra negative kontroller: enten inficerede Huh7-NTCP celler eller podes Huh7-NTCP celler forbehandlet med Myrcludex B kan fungere som negative kontroller. InvPCR analyse af DNA ekstraheret fra disse celler skal producere ingen PCR produkter. Kører disse negative kontrolprøver på den samme PCR-plade som positive prøver giver mulighed for afprøvning af krydskontaminering under indlejrede PCR-processen. Den strengeste test for krydskontaminering er driften af en negativ kontrolprøve i wells A-D og den positive prøve i wells E-H på en 96-brønd plade. I dette tilfælde køres den mest koncentrerede fortynding af den positive prøve i rækken støder direkte op til den mindste koncentreret fortynding af den negative prøve. Hvis forstærkning produkter er observeret i negative kontrolprøver, Institut de foranstaltninger, som foreslås i diskussionen at minimere kontaminering begivenheder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> Figur 1: skematisk figur af invPCR processen til at registrere HBV DNA integrationer. Efter HBV infektion, kun et mindretal af Huh7-NTCP celler indeholder HBV dslDNA (rød) integreret i vært celle genom (rød), afbildet i den øverste del. Samlede DNA er derefter udvundet fra celler (trin 1), inverteret (trin 2), og forstærket af indlejrede PCR (trin 3). Vist er de relative holdninger af begrænsning enzym websteder (Ncojeg og BsiHKAI) i skåret virus-celle DNA junction. Tallet er tilpasset fra en tidligere publikation13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> Figur 2: Agarosen gel elektroforese og efterfølgende gel udvinding af en vellykket invPCR. "M" repræsenterer DNA markør stigen. Hver række med 12 repræsenterer teknisk replikater i en enkelt fortynding på PCR-plade. To inverteret DNA-prøver kan køre pr. PCR plade/agarosegel. PCR produkter for hver fortynding skal titreres ud i en ~ 1:3 ratio. Udvinding af produkter fra de to mindste koncentreret fortyndinger hvor enkelt bands kan være let isoleret er normalt tilstrækkeligt, som HBV DNA integration satsen bestemmes af end-point titrering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> Figur 3: BLAST analyse af invPCR produkt sekvenser. Som lang skrifter af sekvens er genereret fra Sanger sekventering, kilden til DNA-sekvenser er generelt utvetydige. Stærk tilpasning til HBV og cellulære genomer er observeret i forskellige områder af filen FASTA sekvens genereret fra Sanger sequencing i det øverste panel, hvilket tyder på en sand virus-celle DNA junction. I det nederste panel justeres sekvensen kun til fragmenter af HBV genom, tyder på et produkt, der er genereret af forstærkningen af en omarrangeret HBV DNA genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Vi beskriver her in vitro- generation af HBV DNA via en Hepatitis B virus infektion system og meget følsomme påvisning af dets (1 – 2 kopier) integration ved hjælp af inverse indlejret PCR.

Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af In Vitro Hepatitis B infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Denne metode kan bruges til at besvare centrale spørgsmål i Hepatitis B virology, såsom at finde cellulære eller virologiske faktorer, der påvirker HPV DNA integration. Der er flere fordele ved denne teknik. Det er relativt billigt, og let at udføre, analyse af resultaterne er enkel, og det er meget følsom, ned til enkelte kopier.Selvom denne metode kan bruges til at give indsigt i HBV integration, kan den også bruges til andre vira, der integreres i værtscellegenomet, såsom HIV, HTLV-1 eller HPV. At inficere cellerne, frø 200, 000 celler pr milliliter i en tolv brønd plade, med 1 milliliter D-mem. På den næste dag, bruge Heparin kolonne renset su-per-na-din fra HEP-AD 38 som inokulerende at inficere cellerne på 1, 000 VGE per celle, i 500 mikroliter af kultur medium.Derefter kultur cellerne ved 37 grader Celsius. Derefter, den næste dag, vaske cellerne to gange med en milliliter sterile én gange PBS. Derefter erstatte kulturmediet hver 2 dage, indtil høsten.På dag 3 post infektion, behandle cellerne med 5 mikromolar tenofovir disoproxil og 10 mikromolar Lamivudine at begrænse produktionen af HBV replikative mellemprodukter, der forstærkes i stand ved invers PCR. På dag 5, post infektion, trypsinize nogle celler med 200 mikroliter af Trypsin EDTA og re suspendere dem i 2 milliliter D-mem indeholder 5 mikromolar Tenofovir disoproxil og 10 mikromolar Lamivudine. Derefter overføres cellesuspensionerne til en seks brøndplade for at fremkalde en omgang mitose.På dag 7 post infektion, trypsinize de udvidede celler i 400 mikroliter af Trypsin EDTA og suspendere blandingen i 1 millileter D-mem. Derefter overføres suspensionen i et 1,5 milliliterrør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 500 gange G, i fem minutter.Og fjern Su-per-na-din ved aspiration. Uddrag DNA fra cellen pellet ved hjælp af en DNA ekstraktion kit, som pr producentens instruktion. For DNA-inversion skal der afsættes 1,5 til 2,5 mikrogram af det samlede DNA-ekstrakt til et 200-mikroliter-PCR-rør.Dernæst tilsættes den passende mængde begrænsning enzym master mix at resultere i en 40 microliter af reaktion volumen, der indeholder 1 gange fordøjelsesreaktion buffer og 10 enheder NCO-1HF. Inkuber restenzymets reaktion i en PCR-maskine ved 37 grader Celsius i en time for at opnå optimal fordøjelseseffektivitet. Derefter inaktivere begrænsningenzymet ved at inkubere det 80 grader Celsius i 20 minutter.Hele restriktionensenzymets reaktion overføres til et 1,5 milliliterrør. Derefter tilsættes 400 mikroliter af 1 gange T4 DNA ligase buffer og 500 enheder af T4 DNA ligase, og bland grundigt. Stor reaktionsvolumen tilskynder intramolekylær ligation af de fordøjede DNA-fragmenter.Ligationsreaktionen ved stuetemperatur inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer for at sikre fuldstændig ligation. Efter 2 timer, Inaktivere T4 DNA ligase ved 70 grader Celsius i 20 minutter. Derefter tilsættes 10 mikroliter af 10 natriumdydecylisulfat for at sikre fuldstændig inaktivering af T4 ligase.Natriumchlorid til en endelig koncentration på 100 millimolar og Dextran til en endelig koncentration på 90 mikrogram pr. milliliter. Bland ved puls vortexing, og kort spin ned reaktionen mix. Dernæst tilsættes 900 mikroliter af 100 ethanol, og bland ved inversion.Udfælde DNA'et ved negative 20 grader Celsius natten over. Og pellet den udfældede DNA ved centrifugering ved 14000 gange G i 15 minutter. Derefter fjernes Su-per-na-spis ved aspiration.Vask pellet med 500 mikroliter af 70 ethanol. Og centrifugering ved 14000 gange G i 15 minutter. Fjern derefter Ethanol ved aspiration og lufttørre DNA-pellet ved stuetemperatur i 20 minutter.Pellet opløses i 20 mikroliter vand og tilsættes 20 mikroliter af begrænse enzymmasterblandingen for at resultere i et 40 mikroliters reaktionsvolumen, der indeholder 1 gange fordøjelsesreaktionsbuffer, 5 enheder BSIHK-1 og 5 enheder SPH-1HF. Nest, inkubere begrænsningen enzym reaktion i en varmeblok ved 37 grader Celsius, i 1 time. Drej kortvarigt reaktionsblandingen ned, inkuber restriktionensenzymets reaktion i en varmeblok ved 65 grader Celsius i 1 time.I denne procedure skal du fjerne potentielle ampliconer fra en genanvendelig siliciummåtteforsegling ved hjælp af en DNA-nedbrydningsopløsning. Skyl måtten grundigt med DNA frit vand og lufttørre det ved stuetemperatur. Dernæst forberede en millileter af 1 gange PCR mix, der indeholder de ydre fremad og omvendt primere i en koncentration på 0,5 mikromolar.Tilføj 170 mikroliter, hvis 1 gange PCR mix til brønde A-1 og E-1, i en 96 brønd PCR plade. Derefter tilsættes 120 mikroliter af 1 gange PCR mix til brønde B-1 og H-1. Derefter tilsættes 10 mikroliter af det omvendte DNA til brøndene A-1 og E-1.Bland reaktionen i hver brønd, ved forsigtigt pipettering hver, omkring 10 gange ved hjælp af en P-1000 sat til 100 mikroliter. Serielt fortyndes prøverne fra brøndene A-1 til D-1 i et forhold på 1:3 ved at overføre 60 mikroliter ved hvert trin. Bland brøndene på hvert trin ved forsigtigt pipettering dem omkring 10 gange ved hjælp af en P-1000 sat til 100 mikroliter.Undgå at danne bobler, gentag proceduren for godt E-1, fortynding ned til godt H-1. Derefter tildeles 10 mikroliter af reaktionsblandingen ved hjælp af multikanalpipette, fra Wells A-1, H-1, til brønde A-2, H2, A-3, H-3 og so-on, indtil de når brøndene A-12, H-12 af 96 brøndpladen. Dæk PCR-pladen med en tør siliciummåtte, og tryk godt.Derefter placere pladen i en PCR maskine, og køre programmet angivet, før du overfører pladen til stuetemperatur. Derefter opvarmes stifterne på en 96-bens replikator til rødglødende med en Bunsen-brænder, og afkøles derefter i mindst 5 minutter ved stuetemperatur. Fyld brøndene på en anden PCR plade med 10 mikroliter af 1 gange PCR mix, der indeholder en gel belastning klar buffer, og den indvendige frem og tilbage på 0,5 mikromolar.Fjern forsigtigt siliciummåtten fra PCR-pladen på 96 brøndpladen fra den første runde PCR, og undgå krydskontaminering mellem brøndene. Brug den afkølede replikator til at overføre PCR-produkterne fra 96 brøndpladen, fra første runde PCR, til den nyligt tildelte 96 brøndplade. Udfør den indlejrede PCR ved hjælp af tilstanden som angivet.At isolere PCR produkter, analysere dem ved gel elektroforese, ved hjælp af en 96 godt plade, med 1,3 Agarose gel. For en 100 milliliter Agarose gel, køre ved 200 volt i 10 til 15 minutter. Derefter punktafgifter DNA-bånd fra Agarose geler, ved hjælp af engangsdrikkende sugerør.For hvert PCR-produkt anbringes halmen og Agarosegelstikket i et 1,5 milliliterrør, og halmen trimmes til størrelse med en saks. Derefter skubbes Agarose-stikkene ud i hvert rør ved at klemme på enden af halmfragmentet. Derefter tilsættes 300 mikroliter gel ekstraktionsbuffer og 5 mikroliter gelekstraktionsglasperler til hvert rør.Ekstrakt PCR-produkterne i henhold til producentens anvisninger til gelekstraktionssættet, og fortynd DNA'et fra perlerne med 30 mikroliter vand. Indsend det rensede DNA til Sanger-sekvensering, hvor den fremadrettede primer anvendes i anden runde indlejret PCR. Et eksempel Agarose gel elektroforese af vellykket omvendt PCR, før og efter PCR produkt isolation, er vist her.M repræsenterer DNA-markør sidstnævnte, hver række af 12 repræsenterer de tekniske replikater ved en enkelt fortynding på PCR plade. I dette tilfælde bør enkelt PCR-produkter opnås ved den anden eller tredje 1:3 fortynding af hver prøve. Ved disse fortyndinger vil ca. 50 % af produkterne repræsentere ægte viruscelle-DNA-kryds.Mens den anden halvdel repræsenterer forstærkning af HBV DNA mellemprodukter. Denne teknik har gjort det muligt for forskere at udforske HPV DNA integration i stærkt kontrollerede in vitro infektionssystemer. Yderligere metoder, såsom biotematikanalyse, kan bruges til at besvare yderligere spørgsmål.For eksempel, hvis HPV DNA integration forekommer i bestemte områder i det cellulære genom. Glem ikke, at arbejde med infektion Hepatitis B-virus, kan være farlige og passende infektion kontrol, såsom bio sikkerhedsskabe og forudgående vaccination, bør altid tages, mens du udfører disse procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Påvisning af True IgE-udtrykkende muse-B-afstamningsceller

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Udvikling af en hepatitis B virus Reporter system til at overvåge tidlige stadier af Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling metode til påvisning af menneskelige Norovirus på overflader

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rensning af Viral DNA til identifikation af tilknyttede Viral og cellulær proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Lever-on-a-Chip" kulturer af primære hepatocytter og Kupffer celler for Hepatitis B virusinfektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...