Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af In Vitro Hepatitis B infektion

Denne metode kan bruges til at besvare centrale spørgsmål i Hepatitis B virology, såsom at finde cellulære eller virologiske faktorer, der påvirker HPV DNA integration. Der er flere fordele ved denne teknik. Det er relativt billigt, og let at udføre, analyse af resultaterne er enkel, og det er meget følsom, ned til enkelte kopier.

Selvom denne metode kan bruges til at give indsigt i HBV integration, kan den også bruges til andre vira, der integreres i værtscellegenomet, såsom HIV, HTLV-1 eller HPV. At inficere cellerne, frø 200, 000 celler pr milliliter i en tolv brønd plade, med 1 milliliter D-mem. På den næste dag, bruge Heparin kolonne renset su-per-na-din fra HEP-AD 38 som inokulerende at inficere cellerne på 1, 000 VGE per celle, i 500 mikroliter af kultur medium.

Derefter kultur cellerne ved 37 grader Celsius. Derefter, den næste dag, vaske cellerne to gange med en milliliter sterile én gange PBS. Derefter erstatte kulturmediet hver 2 dage, indtil høsten.

På dag 3 post infektion, behandle cellerne med 5 mikromolar tenofovir disoproxil og 10 mikromolar Lamivudine at begrænse produktionen af HBV replikative mellemprodukter, der forstærkes i stand ved invers PCR. På dag 5, post infektion, trypsinize nogle celler med 200 mikroliter af Trypsin EDTA og re suspendere dem i 2 milliliter D-mem indeholder 5 mikromolar Tenofovir disoproxil og 10 mikromolar Lamivudine. Derefter overføres cellesuspensionerne til en seks brøndplade for at fremkalde en omgang mitose.

På dag 7 post infektion, trypsinize de udvidede celler i 400 mikroliter af Trypsin EDTA og suspendere blandingen i 1 millileter D-mem. Derefter overføres suspensionen i et 1,5 milliliterrør. Pellet cellerne ved centrifugering ved 500 gange G, i fem minutter.

Og fjern Su-per-na-din ved aspiration. Uddrag DNA fra cellen pellet ved hjælp af en DNA ekstraktion kit, som pr producentens instruktion. For DNA-inversion skal der afsættes 1,5 til 2,5 mikrogram af det samlede DNA-ekstrakt til et 200-mikroliter-PCR-rør.

Dernæst tilsættes den passende mængde begrænsning enzym master mix at resultere i en 40 microliter af reaktion volumen, der indeholder 1 gange fordøjelsesreaktion buffer og 10 enheder NCO-1HF. Inkuber restenzymets reaktion i en PCR-maskine ved 37 grader Celsius i en time for at opnå optimal fordøjelseseffektivitet. Derefter inaktivere begrænsningenzymet ved at inkubere det 80 grader Celsius i 20 minutter.

Hele restriktionensenzymets reaktion overføres til et 1,5 milliliterrør. Derefter tilsættes 400 mikroliter af 1 gange T4 DNA ligase buffer og 500 enheder af T4 DNA ligase, og bland grundigt. Stor reaktionsvolumen tilskynder intramolekylær ligation af de fordøjede DNA-fragmenter.

Ligationsreaktionen ved stuetemperatur inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer for at sikre fuldstændig ligation. Efter 2 timer, Inaktivere T4 DNA ligase ved 70 grader Celsius i 20 minutter. Derefter tilsættes 10 mikroliter af 10 natriumdydecylisulfat for at sikre fuldstændig inaktivering af T4 ligase.

Natriumchlorid til en endelig koncentration på 100 millimolar og Dextran til en endelig koncentration på 90 mikrogram pr. milliliter. Bland ved puls vortexing, og kort spin ned reaktionen mix. Dernæst tilsættes 900 mikroliter af 100 ethanol, og bland ved inversion.

Udfælde DNA'et ved negative 20 grader Celsius natten over. Og pellet den udfældede DNA ved centrifugering ved 14000 gange G i 15 minutter. Derefter fjernes Su-per-na-spis ved aspiration.

Vask pellet med 500 mikroliter af 70 ethanol. Og centrifugering ved 14000 gange G i 15 minutter. Fjern derefter Ethanol ved aspiration og lufttørre DNA-pellet ved stuetemperatur i 20 minutter.

Pellet opløses i 20 mikroliter vand og tilsættes 20 mikroliter af begrænse enzymmasterblandingen for at resultere i et 40 mikroliters reaktionsvolumen, der indeholder 1 gange fordøjelsesreaktionsbuffer, 5 enheder BSIHK-1 og 5 enheder SPH-1HF. Nest, inkubere begrænsningen enzym reaktion i en varmeblok ved 37 grader Celsius, i 1 time. Drej kortvarigt reaktionsblandingen ned, inkuber restriktionensenzymets reaktion i en varmeblok ved 65 grader Celsius i 1 time.

I denne procedure skal du fjerne potentielle ampliconer fra en genanvendelig siliciummåtteforsegling ved hjælp af en DNA-nedbrydningsopløsning. Skyl måtten grundigt med DNA frit vand og lufttørre det ved stuetemperatur. Dernæst forberede en millileter af 1 gange PCR mix, der indeholder de ydre fremad og omvendt primere i en koncentration på 0,5 mikromolar.

Tilføj 170 mikroliter, hvis 1 gange PCR mix til brønde A-1 og E-1, i en 96 brønd PCR plade. Derefter tilsættes 120 mikroliter af 1 gange PCR mix til brønde B-1 og H-1. Derefter tilsættes 10 mikroliter af det omvendte DNA til brøndene A-1 og E-1.

Bland reaktionen i hver brønd, ved forsigtigt pipettering hver, omkring 10 gange ved hjælp af en P-1000 sat til 100 mikroliter. Serielt fortyndes prøverne fra brøndene A-1 til D-1 i et forhold på 1:3 ved at overføre 60 mikroliter ved hvert trin. Bland brøndene på hvert trin ved forsigtigt pipettering dem omkring 10 gange ved hjælp af en P-1000 sat til 100 mikroliter.

Undgå at danne bobler, gentag proceduren for godt E-1, fortynding ned til godt H-1. Derefter tildeles 10 mikroliter af reaktionsblandingen ved hjælp af multikanalpipette, fra Wells A-1, H-1, til brønde A-2, H2, A-3, H-3 og so-on, indtil de når brøndene A-12, H-12 af 96 brøndpladen. Dæk PCR-pladen med en tør siliciummåtte, og tryk godt.

Derefter placere pladen i en PCR maskine, og køre programmet angivet, før du overfører pladen til stuetemperatur. Derefter opvarmes stifterne på en 96-bens replikator til rødglødende med en Bunsen-brænder, og afkøles derefter i mindst 5 minutter ved stuetemperatur. Fyld brøndene på en anden PCR plade med 10 mikroliter af 1 gange PCR mix, der indeholder en gel belastning klar buffer, og den indvendige frem og tilbage på 0,5 mikromolar.

Fjern forsigtigt siliciummåtten fra PCR-pladen på 96 brøndpladen fra den første runde PCR, og undgå krydskontaminering mellem brøndene. Brug den afkølede replikator til at overføre PCR-produkterne fra 96 brøndpladen, fra første runde PCR, til den nyligt tildelte 96 brøndplade. Udfør den indlejrede PCR ved hjælp af tilstanden som angivet.

At isolere PCR produkter, analysere dem ved gel elektroforese, ved hjælp af en 96 godt plade, med 1,3 Agarose gel. For en 100 milliliter Agarose gel, køre ved 200 volt i 10 til 15 minutter. Derefter punktafgifter DNA-bånd fra Agarose geler, ved hjælp af engangsdrikkende sugerør.

For hvert PCR-produkt anbringes halmen og Agarosegelstikket i et 1,5 milliliterrør, og halmen trimmes til størrelse med en saks. Derefter skubbes Agarose-stikkene ud i hvert rør ved at klemme på enden af halmfragmentet. Derefter tilsættes 300 mikroliter gel ekstraktionsbuffer og 5 mikroliter gelekstraktionsglasperler til hvert rør.

Ekstrakt PCR-produkterne i henhold til producentens anvisninger til gelekstraktionssættet, og fortynd DNA'et fra perlerne med 30 mikroliter vand. Indsend det rensede DNA til Sanger-sekvensering, hvor den fremadrettede primer anvendes i anden runde indlejret PCR. Et eksempel Agarose gel elektroforese af vellykket omvendt PCR, før og efter PCR produkt isolation, er vist her.

M repræsenterer DNA-markør sidstnævnte, hver række af 12 repræsenterer de tekniske replikater ved en enkelt fortynding på PCR plade. I dette tilfælde bør enkelt PCR-produkter opnås ved den anden eller tredje 1:3 fortynding af hver prøve. Ved disse fortyndinger vil ca. 50 % af produkterne repræsentere ægte viruscelle-DNA-kryds.

Mens den anden halvdel repræsenterer forstærkning af HBV DNA mellemprodukter. Denne teknik har gjort det muligt for forskere at udforske HPV DNA integration i stærkt kontrollerede in vitro infektionssystemer. Yderligere metoder, såsom biotematikanalyse, kan bruges til at besvare yderligere spørgsmål.

For eksempel, hvis HPV DNA integration forekommer i bestemte områder i det cellulære genom. Glem ikke, at arbejde med infektion Hepatitis B-virus, kan være farlige og passende infektion kontrol, såsom bio sikkerhedsskabe og forudgående vaccination, bør altid tages, mens du udfører disse procedure.