Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie

Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in hepatitis B virologie te beantwoorden, zoals het vinden van cellulaire of virologische factoren die de HPV-DNA-integratie beïnvloeden. Er zijn meerdere voordelen aan deze techniek. Het is relatief goedkoop, en gemakkelijk uit te voeren, analyse van de resultaten is eenvoudig, en het is zeer gevoelig, tot enkele kopieën.

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te geven in HBV-integratie, kan deze ook worden gebruikt voor andere virussen die in het genoom van de gastheercel worden geïntegreerd, zoals HIV, HTLV-1 of HPV. Om de cellen te infecteren, zaad 200.000 cellen per milliliter in een twaalf put plaat, met 1 milliliter D-mem. Op de volgende dag, gebruik Heparin kolom gezuiverd su-per-na-din van HEP-AD 38 als inentingsmiddel om de cellen te infecteren op 1,000 VGE per cel, in 500 microliters van cultuurmedium.

Dan, cultuur de cellen op 37 graden Celsius. Vervolgens, op de volgende dag, was de cellen twee keer met een milliliter steriele een keer PBS. Vervang vervolgens het kweekmedium om de 2 dagen, tot de oogst.

Behandel de cellen op dag 3 na infectie met 5 micromolar tenofovir disoproxil en 10 micromolar Lamivudine om de productie van HBV-replicatieftemiddelen te beperken die kunnen worden versterkt door inverse PCR. Op dag 5, na infectie, trypsinize sommige cellen met 200 microliters van Trypsin EDTA en opnieuw opschorten ze in 2 milliliter D-mem met 5 micromolar Tenofovir disoproxil en 10 micromolar Lamivudine. Breng vervolgens de celsuspensies over naar een zes putplaat, om één ronde mitose te induceren.

Op dag 7 na infectie, trypsinize de uitgebreide cellen in 400 microliters van Trypsin EDTA en schort het mengsel in 1 millileter van D-mem. Breng de vering vervolgens over in een buis van 1,5 milliliter. Pellet de cellen door centrifugatie op 500 keer G, gedurende vijf minuten.

En verwijder de Su-per-na-din door aspiratie. Haal het DNA uit de celpellet met behulp van een DNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Voor DNA-inversie, toewijzen 1,5 tot 2,5 microgram van het totale DNA-extract in een 200 microliter PCR buis.

Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid beperkingsenzym master mix toe om te resulteren in een 40 microliter reactievolume, met 1 keer de digestiereactiebuffer en 10 eenheden NCO-1HF. Broed de beperking enzymreactie in een PCR machine op 37 graden Celsius gedurende een uur, voor een optimale spijsvertering efficiëntie. Activeer vervolgens het beperkingsenzym door het 20 minuten lang 80 graden Celsius uit te broeden.

Breng de volledige beperking enzym reactie op een 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens 400 microliters van 1 keer T4 DNA ligase buffer en 500 eenheden T4 DNA ligase toe en meng grondig. Het grote reactievolume moedigt intramoleculaire ligatie van de verteerde DNA-fragmenten aan.

Broed de ligatiereactie 2 uur lang bij kamertemperatuur om volledige ligatie te garanderen. Na 2 uur activeer je de T4 DNA-ligase op 70 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens 10 microliter van 10 Natrium Dodedecyl Sulfaat toe om volledige inactivatie van de T4 ligase te garanderen.

Voeg natriumchloride toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 millimolar en Dextran tot een uiteindelijke concentratie van 90 microgram per milliliter. Meng door puls vortexing, en kort spin vaststelling van de reactie mix. Voeg vervolgens 900 microliter van 100 ethanol toe en meng door inversie.

Precipitate het DNA bij negatieve 20 graden Celsius 's nachts. En pellet het neergeslagen DNA door centrifugatie op 14000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder daarna de Su-per-na-dine door aspiratie.

Was de pellet met 500 microliter van 70 ethanol. En centrifugatie op 14000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder vervolgens de ethanol door aspiratie en droog de DNA-pellet 20 minuten op kamertemperatuur.

Los de pellet op in 20 microliter water en voeg 20 microliter van beperken enzym master mix om te resulteren in een 40 microliter reactievolume, met 1 keer spijsvertering reactie buffer, 5 eenheden BSIHK-1, en 5 eenheden van SPH-1HF. Nest, broed de beperking enzym reactie in een warmteblok op 37 graden Celsius, gedurende 1 uur. Draai de reactiemix kort naar beneden, broed de reactie van het beperkingsenzym in een warmteblok bij 65 graden Celsius gedurende 1 uur uit.

Verwijder in deze procedure potentiële amplicons uit een herbruikbare siliconenmatafdichting met behulp van een DNA-afbraakoplossing. Spoel de mat grondig af met DNA-vrij water en de lucht droogt deze op kamertemperatuur. Bereid vervolgens een millileter van 1 keer PCR-mix met de buitenste voorwaartse en omgekeerde primers bij een concentratie van 0,5 micromolar.

Voeg 170 microliters toe als de 1 keer PCR-mix naar putten A-1 en E-1, in een 96 goed PCR-plaat. Voeg vervolgens 120 microliters van de 1 keer PCR-mix toe aan putten B-1 en H-1. Voeg daarna 10 microliter van het omgekeerde DNA toe aan putten A-1 en E-1.

Meng de reactie in elke put, door zachtjes pipetteren elk, ongeveer 10 keer met behulp van een P-1000 ingesteld op 100 microliters. Verdun de monsters van putten A-1 tot D-1 in serie, met een verhouding van 1:3 door bij elke stap 60 microliters over te brengen. Meng de putten bij elke stap door ze voorzichtig pipetting ongeveer 10 keer met behulp van een P-1000 ingesteld op 100 microliters.

Vermijd het vormen van bellen, herhaal de procedure voor goed E-1, verdunnen tot goed H-1. Vervolgens, toewijzen 10 microliters van het reactiemengsel, met behulp van multichannel pipet, van Wells A-1, H-1, in putten A-2, H2, A-3, H-3 en ga zo maar door, tot het bereiken van putten A-12, H-12 van de 96 goed plaat. Bedek de PCR-plaat met een droge siliconenmat en druk stevig.

Plaats vervolgens de plaat in een PCR-machine en voer het aangegeven programma uit voordat u de plaat op kamertemperatuur zet. Verwarm daarna de pinnen van een 96-pins replicator tot roodgloeiend met een Bunsen-brander en koel vervolgens minstens 5 minuten af bij kamertemperatuur. Vul de putten van een tweede PCR-plaat met 10 microliters van 1 keer PCR-mix, met een gel load ready buffer, en de binnenste voorwaartse en omgekeerde op 0,5 micromolar.

Verwijder voorzichtig de siliconenmat van de PCR-plaat van de 96 putplaat uit de eerste ronde PCR en voorkom kruisbesmetting tussen putten. Gebruik de gekoelde replicator om de PCR producten van de 96 put plaat, van de eerste ronde PCR, over te dragen aan de nieuw toegewezen 96 put plaat. Voer de geneste PCR uit, met behulp van de aangegeven voorwaarde.

Om de PCR producten te isoleren, analyseren ze door gel elektroforese, met behulp van een 96 put plaat, met 1.3 Agarose gel. Voor een 100 milliliter Agarose gel, draaien op 200 volt gedurende 10 tot 15 minuten. Daarna, accijns de DNA-banden van de Agarose gels, met behulp van wegwerp drinkrietjes.

Voor elk PCR-product, plaats het stro en Agarose gel plug in een 1,5 milliliter buis, trim het stro op maat met een schaar. Daarna, uitwerpen van de Agarose stekkers in elke buis, door knijpen op het einde van het stro fragment. Voeg vervolgens 300 microliter gelextractiebuffer en 5 microliter gelextractieglaskralen toe aan elke buis.

Haal de PCR-producten per fabrikant instructies voor de gel extractie kit, en verdun het DNA uit de kralen met 30 microliters van water. Dien het gezuiverde DNA voor Sanger sequencing, met de voorwaartse primer gebruikt in de tweede ronde geneste PCR. Een voorbeeld Agarose gel elektroforese van succesvolle omgekeerde PCR, vóór en na DE productisolatie van PCR, wordt hier getoond.

M vertegenwoordigt DNA marker laatste, elke rij van 12 vertegenwoordigt de technische replica's bij een enkele verdunning op de PCR-plaat. In dit geval moeten afzonderlijke PCR-producten worden bereikt door de tweede of derde 1:3 verdunning van elk monster. Bij deze verdunningen zal ongeveer 50% van de producten echte dna-knooppunten van viruscellen vertegenwoordigen.

Terwijl de andere helft vertegenwoordigt versterking van HBV DNA tussenproducten. Deze techniek heeft onderzoekers in staat gesteld om HPV DNA-integratie in zeer gecontroleerde in-vitro infectiesystemen te verkennen. Aanvullende methoden, zoals biothematische analyse, kunnen worden gebruikt om verdere vragen te beantwoorden.

Bijvoorbeeld als HPV-DNA-integratie plaatsvindt in specifieke gebieden in het cellulaire genoom. Vergeet niet dat het werken met infectie Hepatitis B-virus, kan gevaarlijk zijn en passende infectie controles, zoals bio veiligheid kasten en voorafgaande vaccinatie, moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.