Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

עבודה זו קיבלה מימון מהמרכז גרמנית זיהום מחקר (DZIF), TTU הפטיטיס פרויקטים 5.807 של 5.704, TRR179 דויטשה פתוח (DFG) (TP 15), והמרכז האוסטרלי HIV ומחקר וירולוגיה הפטיטיס.
. אנחנו חבים פרופסור ויליאם מייסון על חלקו בפיתוח השיטה invPCR המקורי של הוכחת את זה אלינו. ברצוננו להודות ד"ר יי ני, פלוריאן Lempp א. ריאגנטים (שורות תאים ו HBV inoculum). אנו להכיר אניה Rippert, פרנציסקה Schlund, שרה Engelhardt, ד ר קתרין Schöneweis לקבלת סיוע טכני. אנחנו אסירי תודה מרים Kleinig עבור הגהה, פרופסורים ניקולס Shackel, ראלף Bartenschlager עבור תמיכה שוטפת

1. תא זיהום והפקת דנ א
<ol><li>לשמור על תרבות Huh7-NTCP תאים8,9 בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% v/v עוברית שור סרום, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, ו- 2 מ מגלוטמין. הערה: זה בעבר דווח בפירוט40.</li>
	<li>זרע 2 x 105 תאים למ"ל Huh7-NTCP תאים לתוך צלחת 12-ובכן עם 1 מ"ל של DMEM.</li>
	<li>אם בדיקות תא טיפולים (למשל, מעכבי HBV), להחיל אותם על התרבות supernatant 4 שעות לאחר זריעה (יום 1 לפני HBV זיהום). עבור פקד שלילי, להחיל 200 ננומטר Myrcludex B (עוצמה HBV כניסה מעכב41).</li>
	<li>להשתמש הפארין עמודות טיהור42 תגובת שיקוע HepAD3843 inoculum כדי להדביק תאים על 1,000 VGE תא ב- 500 µL של תרבות התקשורת (DMEM בתוספת 10% v/v סרום שור עוברית, 1 x v/v פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 2.5% דימתיל סולפוקסיד), המכיל 4% w/v פוליאתילן גליקול 8000 [מומס 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)].</li>
	<li>התרבות התאים חממה 37 ° C (מוגדר ב- 5% CO2 ו- 90% לחות).</li>
	<li>לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS עקר 1 x ב- 16-24 שעות לאחר הפגיעה.</li>
	<li>החלף את המדיה תרבות כל יומיים בעקבות זיהום HBV עד הקציר.</li>
	<li>-יום 3 לאחר הפגיעה, מתייחסים התאים עם 5 מיקרומטר Tenofovir disoproxil ו- 10 מיקרומטר Lamivudine להגביל את הייצור של HBV intermediates replicative כי הם amplifiable על ידי invPCR.</li>
	<li>יום 5 לאחר הפגיעה, trypsinize את התאים עם 200 µL של טריפסין-EDTA, resuspend אותם ב 2 מ של DMEM (בתוספת 10% v/v סרום שור עוברית, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, ו- 2 מ מגלוטמין), המכיל גם 5 מיקרומטר Tenofovir disoproxil ו- 10 מיקרומטר Lamivudine.</li>
	<li>להעביר את המתלים תא צלחת 6-ובכן לזירוז סיבוב אחד של מיטוזה (אשר דווחה כדי לגרום לאובדן של HBV cccDNA44 , אחרים intermediates HBV DNA כי הם amplifiable על-ידי invPCR).</li>
	<li>יום 7 לאחר הפגיעה, trypsinize בתאים µL 400 של טריפסין-EDTA המורחב, resuspend התערובת של 1 מ"ל של DMEM. למקם את המתלים צינור 1.5 mL הצניפה התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.</li>
	<li>(אופציונלי) אחסן את כדורי תא ב-20 ° C עד שיהיו מוכנים להפקת DNA.</li>
	<li>לחלץ את ה-DNA מ בגדר התא באמצעות ערכת חילוץ דנ א, לפי הוראות היצרן. מעריכים את ריכוז הדנ א הסופי באמצעות densitometry אופטי. הערה: התשואה DNA באמצעי אחסון • תנאי 100 μL בדרך כלל ~ 250-400 ng/μL.</li>
</ol>2. היפוך של דנ א
<ol><li>Aliquot ~1.5–2.5 μg של ה-DNA הכולל לחלץ משלב 1 לתוך צינור PCR μL 200. להוסיף את הכמות המתאימה של אנזים הגבלה מאסטר-מיקס את התוצאה אמצעי תגובה 40 μL המכיל 1 x תקציר התגובה מאגר (למשל., מאגר CutSmart) ו- 10 U המשאני-HF.</li>
	<li>לערבב את התגובות ביסודיות, ספין למטה ומפרידה צינורית קטנה. דגירה התגובה אנזים הגבלה במכונת ה-PCR ב 37 ° C עבור h 1 ליעילות לעיכול אופטימלי.</li>
	<li>בטל את אנזים הגבלה על-ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>להעביר את התגובה אנזים הגבלה כל צינור 1.5 מ. מוסיפים μL 400 1-T4 DNA ליגאז מאגר ו- 500 U של T4 DNA ליגאז ומערבבים אותו ביסודיות. האחסון תגובת גדולה מעודדת אינטרה-מולקולרית (להבדיל בין-מולקולריים) מצדו של שברי DNA מעוכל.</li>
	<li>דגירה התגובה מצדו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים להבטיח מצדו מלאה.</li>
	<li>בטל את T4 DNA ליגאז ב 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 μL של 10% w/v dodecyl סולפט נתרן כדי להבטיח איון מוחלט של ליגאז T4.</li>
	<li>לערבב את הצינורות על ידי הדופק vortexing, בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. להוסיף NaCl ריכוז סופי של 100 מ מ, לתוספי (35-45 kDa) כדי ריכוז סופי של 90 µg/mL. לערבב את הצינורות על ידי הדופק vortexing, בקצרה ספין למטה תערובת התגובה.</li>
	<li>הוסף 900 μL של 100% אתנול וביו -מיקס על ידי היפוך. לזרז את ה-DNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>צניפה הדנ א precipitated על ידי צנטריפוגה-14,000 g x עבור 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה עם פיפטה P200. לשטוף את גלולה עם 500 μL של 70% v/v אתנול וביו -צנטריפוגה ב g x 14,000 למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר האתנול על ידי השאיפה עם פיפטה P200. מילה נהדרת בגדר DNA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>להמיס בגדר ב 20 μL של H2O. להוסיף 20 μL של אנזים הגבלה מאסטר-שילוב את התוצאה אמצעי תגובה 40 μL המכיל 1 x תקציר התגובה מאגר, 5 U של BsiHKAI ו-5 U של Sph-HF. Incubate התגובה אנזים הגבלה ב חום-רחוב 37 ° C (טמפרטורה אופטימלית עבור Sph-HF) לשעה.</li>
	<li>בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. דגירה התגובה אנזים הגבלה בתוך גוש חום-65 ° צ' (טמפרטורה אופטימלית עבור BsiHKAI) לשעה.</li>
	<li>בקצרה ספין למטה תערובת התגובה.</li>
	<li>חנות ה-DNA הופכיים ב-20 ° C עד השלב הבא.</li>
</ol>3. שרשור PCR
<ol><li>להסיר amplicons פוטנציאליים גושפנקה mat סיליקון לשימוש חוזר באמצעות פתרון השפלה דנ א, לשטוף את השטיח ביסודיות עם מים ללא ה-DNA, מילה נהדרת זה בטמפרטורת החדר תוך כדי הכנת התערובת PCR.</li>
	<li>להכין 1 מ"ל של תערובת x PCR 1 המכיל פארווערטס החיצוני (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3'), הפוכה (5'-AAA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה מס רווחי הון CCC GCG חטיבתי-3') תחל בריכוז של 0.5 מיקרומטר.</li>
	<li>להוסיף μL 170 של המיקס x PCR 1 בארות A1 ו- E1 לתוך צלחת PCR 96-ובכן.</li>
	<li>להוסיף 120 μL של המיקס x PCR 1 בארות B1 ל H1.</li>
	<li>להוסיף 10 μL של ה-DNA הופכיים משלב 2 בארות A1 ו- E1 (2 דוגמאות ההפוכה שונות ניתן לנתח באותה צלחת PCR). לערבב התגובה לכל היטב על ידי בעדינות pipetting כל אחד 10 פעמים משתמש של P1000 מוגדר כ- 100 μL.</li>
	<li>באופן סדרתי שתדללו דגימות בארות A1 כדי D1 ביחס של 1:3 על ידי העברת μL 60 בכל שלב. לערבב את הבארות בכל שלב על ידי בעדינות pipetting אותם על פי 10 השימוש של P1000 מוגדר כ- 100 μL. הימנע ויוצרים בועות. חזור על שלב 3.6 עבור טוב E1, דילול ל H1 היטב.</li>
	<li>ΜL 10 aliquot של תערובת התגובה באמצעות פיפטה רב ערוצית של בארות A1-H1 לתוך בארות A2-H2, A3-H3, וכן הלאה עד שהגיע בארות A12-H12 של צלחת 96-ובכן. מכסים את הצלחת ה-PCR עם המשטח יבש סיליקון מהשלב 3.1, כשאגיד.</li>
	<li>מקם את הצלחת במכונת ה-PCR ולהפעיל את התוכנית הבאה: 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 35 מחזורי 15 s ב 95 ° C, 15 s ב 54 ° C ו 3 דקות ב-72 מעלות; 7 דקות ב-72 מעלות; . אז, להחזיק את הצלחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מחממים את הסיכות של משכפל 96-pin כדי לוהט עם מבער בונזן, ואז להתקרר למשך לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למלא הבארות של צלחת PCR השנייה עם μL 10 של תערובת x PCR 1 (מכיל מאגר עומס-מוכנות ג'ל), פארווערטס הפנימי (5'-CGC ATG איסור פרסום ACC ACC חברתנו A-3'), הפוכה (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') ב- 0.5 מיקרומטר.</li>
	<li>בזהירות להסיר הצלחת ה-PCR של צלחת 96-ובכן מ- PCR בסיבוב הראשון שטיח סיליקון, ולהימנע זיהום צולב בין בארות.</li>
	<li>השתמש המשכפלים מקורר להעביר את המוצרים ה-PCR של צלחת 96-ובכן מ- PCR בסיבוב הראשון לצלחת 96-ובכן aliquoted לאחרונה. לבצע את ה-PCR המקונן משתמש באותם התנאים כמו שלב 3.8, למעט שינוי השלב הראשוני דנטורציה ב 95 ° C מ- 10 דקות ל- 2 דקות.</li>
</ol>4. PCR מוצר בידוד והפקת ג'ל
<ol><li>לנתח את המוצרים PCR על-ידי שימוש 96-ובכן עם 1.3% w/v agarose ג'ל אלקטרופורזה בג'ל. עבור agarose 100 מ ל ג'ל, הפעל ב- 200 וולט למשך 10-15 דקות.</li>
	<li>בלו הלהקות דנ א ג agarose באמצעות קשיות שתייה חד פעמיות. עבור כל מוצר ה-PCR, למקם את הקש, agarose ג'ל לחבר צינור 1.5 mL ולחיתוך הקש לגודל עם מספריים. הערה: זה מספיק כדי לבודד להקות רק מפני דילולים האלה שבהם ניתן לפתור מוצרי ה-PCR יחיד.</li>
	<li>(אופציונלי) אחסן את הצינורות ב-20 ° C לחילוץ מאוחר יותר.</li>
	<li>הוצאת השתלים agarose לתוך כל שפופרת לוחצת על הסוף של השבר קש. להוסיף 300 μL ג'ל החילוץ מאגר ו μL 5 של ג'ל החילוץ זכוכית חרוז slurry כל שפופרת.</li>
	<li>לחלץ את המוצרים PCR לפי הוראות היצרן עבור ערכת חילוץ ג'ל (למעט שימוש חצי-אמצעי אחסון לכביסה צעדים), elute את ה-DNA של החרוזים עם 30 μL של מים.</li>
	<li>שלח את ה-DNA מטוהרים עבור סנגר רצף (לפי ההוראות של הספק) עם פריימר לפנים המשמשים את הסיבוב השני מקונן PCR.</li>
</ol>5. רצף ניתוח
<ol><li>לאשר תאים וירוס DNA צמתים על ידי ביצוע ניתוח הפיצוץ נוקלאוטיד (באמצעות הגדרות ברירת המחדל של יישור לאוסף נוקלאוטיד כולו). הערה: תוצאות ייצוגית מפורטים איור 3 להלן.<ol>
<li>אם רק יישור חלקי של הרצף נצפית, לקצץ את 5' HBV DNA רצף לפני הפעלה מחדש ניתוח הפיצוץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החלת קריטריוני הבחירה מחמירים כדי לקבוע אם רצף נתון מייצג שילוב נכון צומת כדלקמן:<ol>
<li>כוללים רק רצפים המכיל > 20 bp של רצף הסלולר עבור בטוח מיפוי הגנום הסלולר.</li>
		<li>להתעלם כל רצפי המכילים הגבלת אתרים של כל אנזימים שמוצעת 10 bp של הצומת שילוב תאים וירוס אמור, כפי שהם מייצגים סביר במבחנה מצדו אירועים במקום שילוב נכון צמתי.</li>
		<li>להתעלם כל רצפי עם רמות קרינה פלואורסצנטית ברור שיא שונה משני צדי הצומת אינטגרציה אמור ב רצף כרומטוגרפי, שכן הן הסבירות חפצים שנוצרו על-ידי זיהום צולב במהלך התגובה רצף או צינור קפילר כרומטוגרפיה.</li>
		<li>מגדירים אירועי שילוב ייחודי כמו אלה עם HBV המדויק, רצפים הסלולר בצומת תאי וירוס. הערה: חזרה על אירועי שילוב ייחודי יכול לנבוע משובט הרחבה של תאים המכילים שילובים אלו או זיהום צולב במהלך ה-PCR (אשר יכול להיבדק באמצעות שלילי-לשלוט בתגובותיו, מפורט נוסף בתוצאות נציג להלן). שילובים חוזרות לתוך רצפים ספציפיים הסלולר צפויים להציג אתרים שונים של מסוף HBV עבור כל אירוע אינטגרציה, כמו מסלולים שאינם הומולוגיים סוף מצטרף גם בשימוש15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב את תדירות אינטגרציה על-ידי הכפלת הגורם דילול של תבניות DNA הפוכה על ידי מספר צמתים וירוס-תא זוהה ליד זה דילול, ואחריו נורמליזציה לסכום הכולל DNA קלט לתוך התגובה היפוך. באופן כללי, תדירות אינטגרציה היא הסדר 1:104 תאים.</li>
</ol>

בוגרות הוא המועמד שותף, שותף ממציא פטנטים מגן Myrcludex B כמו מעכב כניסה HBV/HDV. טי. מצהיר שאין ניגודי אינטרסים.

לפני ביצוע הפרוטוקול, חשוב לציין כי זו assay invPCR היא טכניקה רגישה מאוד, מסוגל הגברה עותקים בודדים של תבנית ה-DNA. לכן, הגבלת הזיהום ממוצרים PCR הוא בעל חשיבות עליונה. אסטרטגיות כלליות להגבלת PCR המוצר זיהום כוללים את הבאים. (i) ליצור אזורים נפרדים עבור שלבים שונים של השיטה. כל אזור צריך חלוקי מעבדה נפרדים, ולכן צריך להיות שונה כפפות בעת העברת בין האזורים השונים. יש לנו המפורטים באזורים אלה להלן לפי סדר מהספציפי ביותר לפחות סביר מזוהם: PCR המוצר החילוץ ורצף התגובה הגדרת אזור (post-PCR); הוספת תבנית ה-PCR פינים האדימו העברת השטח (השתמשנו מיגון PCR עם מנורת UV decontaminating עם תוצאות טובות); הפקת דנ א ואזור היפוך (pre-PCR); ואזור "ללא תבנית ה-DNA" אך ורק לצורך הכנת מלאי ופתרונות ה-PCR. (ii) יהיה מודע זרימת אוויר במעבדה כנהג פוטנציאלי של זיהום צולב. בפרט, זיהום צולב של תגובות PCR במהלך השלב העברה pin האדימו קרוב לוודאי שתתרחש יהיה להוביל כימות לא מדויק של אינטגרציה תדר. וקולטי PCR יכול לשמש כדי להגביל את הצלב-זרמים אלה. וולס בקרה שלילית (למשל, דגימות שטופלו Myrcludex B או פקדים אין תבנית) ב- PCR יכול לשמש גם כדי לבדוק את זיהום צולב. (iii) להגביל מזהמים פוטנציאליים PCR על פיפטות, משטחי עבודה על-ידי בקביעות מנגב אותם עם פתרון ה-DNA השפלה.
הפרוטוקול שמצוין כאן מסודר כדי לזהות שילוב של שיבוט HBV זיהומיות ידוע המופקים HepAD38 תא קו42. אם inoculum בשימוש של רצף HBV DNA שונה (למשל, מסרום החולה), ואז הגנום HBV צריך להיות קודם רציף כדי לאשר את תאימות של ה-PCR תחל ועיצוב היפוך. מחקרים שפורסמו בעבר19, השתמשנו 3 קבוצות של תחל לאגד שנשמרת רצפי HBV DNA איגוף האתר הצפוי של HBV DNA צמתים אינטגרציה. אחרים פריימר רצפי פרוטוקולים תוארו כדי לקבוע את רצף גנומית של HBV44,45,46,47,48 , יפעלו בהצלחה.
יתר על כן, ניתן להשתמש תאים רגישים HBV שונים (למשל, hepatocytes אנושי ראשוני, הבדיל HepaRG, HepG2-NTCP תאים); עם זאת, מצאנו כי תאים Huh7-NTCP מספקים את יחס אות לרעש הגדול ביותר, כאשר בוחנים את מספר תאים וירוס DNA צמתים זה הם מוגבר לעומת הדי ביניים וירוס זה מוגבר13. בפרט, תאים סופני הבדיל כגון ראשי hepatocytes אנושי או HepaRG הבדיל אינם ביעילות עוברים מיטוזה, והתוצאה היא רמה גבוהה של amplifiable HBV DNA replicative intermediates שנותרו בתוך התאים. מצאנו כי ~ 90% של רצפי מוגבר מייצגים HBV DNA rearrangements (וגם לא שילוב אירועים) בתאי סופני הבדיל, לעומת 70 – 50% הפטומה היא תא קווים13. מוצרים אלה הם בדרך כלל הגנום HBV DNA המכיל מחיקות גדולות משטח ו core פתח קריאת מסגרות, או שהן יכולות לייצג HBV מינים החריגה עם נוספים המפקדיםאני באתר לפני Sphאני באתר. ההגברה של המינים הללו HBV (כולל תרשים סכימטי) תוארו ב פירוט בעבר13.
ישנן כמה חסרונות לשיטה זו. בשל אופיו מפרך, הנמשך של פרוטוקול זה, invPCR אינה מתאימה לקצב תפוקה גבוהה ניתוחים של מספר רב של דוגמאות. יתר על כן, כפי זה מסתמך על הגבלת דילול טיטור, השיטה שלנו אינה מדויקת מאוד של כימות; למרות זאת, זה צריך בקלות למדוד שינויים ברמת יומן שתדירותם אינטגרציה.
יתר על כן, הפרוטוקול היפוך שלנו מתאים רק לזהות שילובים בין האזור DR2, DR1 של הגנום HBV, כמו הרוב המכריע של HBV שילובים להתרחש בתוך אזור זה49. ניתוח המיתרים של רקמות החולה HBV הראו מיעוט גדול (עד ~ 50%) עלול להתרחש גם מחוץ לאזור זה49. עיצובים חדשים invPCR הם תיאורטית מסוגל לזהות אלה אתרים אחרים אינטגרציה, אבל הם לא (לידע שלנו) היו ביצעו עדיין. . Relatedly, עקב האתרים נחוץ אנזים הגבלה נדרש במורד הזרם מהרצף בצומת תאי וירוס עבור התגובה היפוך, invPCR אינו מזהה את כל שילובי המתרחשים בתוך האזורים DR2, DR1 של הגנום HBV (קרי, אנחנו משוער כי ~ 10% של כל שילובי הם לזיהוי באמצעות סיליקו סימולציות13). עם זאת, כאשר חל על מנה מרוכזת של דגימות עם מספר קטן של טיפולים שונים, invPCR הוא באחת השיטות המעשית היחידה לגילוי משולב HBV DNA ברזולוציה בסיס-זוג יחיד.
לכן נוכל לדמות יישומים של שיטה זו המגישה תפקיד מפתח במציאת ויראלי (באמצעות מוטציות של inoculum HBV), סלולרי (באמצעות הסתרה או ביטוי של גנים ספציפיים הסלולר או באמצעות יישום של סמים שונים), סביבתיים ( למשל, חשיפה סטרס חמצוני) גורמים זירוז האינטגרציה HBV DNA. זו שיטה, פיתח מערכות זיהום HBV, אנו מאפשרים שליטה חסרת תקדים של גורמים אלה, כך הם יכולים להיות מבודדים טוב יותר מאופיין היטב. אנו מצפים כי זה יוביל להבנה מפתח של ההשלכות הסלולר של HBV DNA אינטגרציה, ובכלל זה מה מידת אנטיגנים ויראלי (למשל, HBx או HBsAg50) מבוטאים מהטופס משולב, מה ששולט בביטוי זה, אם לאו HBV אינטגרציה משתנה באופן משמעותי על פנוטיפ הסלולר כלפי מדינה יותר pro-oncogenic התוצאות של מחקרים עתידיים אלו תהיה השפעה עמוקה על האסטרטגיות הטיפוליות המשמשות לטיפול הפטיטיס B כרונית ועל ההבנה הבסיסית של הנגיף עצמו.

HBV הוא וירוס DNA גדילי כפול שיכולים לגרום זיהום כרוני חיים ארוך, המוביל שחמת הכבד hepatocellular קרצינומה (HCC)1,2,3. בעוד ישנם מספר המנגנונים המולקולריים נהיגה HBV התמדה4 (למשל, ביציבות גבוהה של התבנית תעתיק ויראלי epigenetic), התחמקות של מעקב המערכת החיסונית, תחלופה נמוכה של hepatocytes בכבד ו המשויך הסיכון של HCC חניכה5,6 (למשל, דלקת כרונית, ההפעלה של הסלולרי להדגיש מסלולים), שילוב HBV DNA הגנום של התא המארח (מנגנון דיווח עבור שתי התופעות הללו) לקוי נחקרה . הסיבה הראשית היא חוסר מתאימים במבחנה זיהום מערכות HBV המאפשרים זיהוי אמין של אירועי שילוב. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שפותח לאחרונה גם במבחנה הדור וגם גילוי של שילובי HBV DNA זה יכול לשמש כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס והשלכות הימנו.
היווצרות של HBV DNA אינטגרציה ושכפול של HBV נצפה בעבר בפרטים7. בקצרה, HBV נכנס hepatocytes שימוש פפטיד Co-transporting של נתרן Taurocholate (NTCP) הקולטן הסלולר העיקרי עבור זיהום8,9. Nucleocapsids HBV המכיל (rcDNA) רגוע-HBV DNA מעגלי הגנום נכנס לגרעין, איפה rcDNA מומר DNA מעגלי סגור covalently episomal (cccDNA). CccDNA גרעיני משמש תבנית תעתיק של נגיפי mRNAs ל- RNA (pgRNA) מראש גנומית10. פולימראז HBV ו pgRNA ארוזים ואז לתוך nucleocapsids החדשה (מורכבת הדימרים חלבון הליבה HBV). HBV pgRNA היא הפוכה-עיבד בתוך nucleocapsid, וכתוצאה מכך גם על הגנום rcDNA או כפול גדילי לינארי דנ א (dslDNA) הגנום11,12. אלה nucleocapsids בוגר המכיל HBV DNA הגנום סוף סוף אפוף, ייצוא virions.
זיהום של hepatocytes על ידי מעטפת חלקיקים המכילים מולקולות dslDNA יכול לגרום ויראלי השתלבותם המארח תא הגנום13, מוביל לטפסים פסול השכפול של HBV DNA7,14,15. שילוב HBV DNA מתרחשת באתר של כרומוזומלית כפול גדילי DNA מעברי15. צבירת הראיות עולה כי כל אירוע אינטגרציה מתרחשת במצב בעיקרו של דבר אקראי בתוך16,17הגנום בתא המארח. בנוסף, שילוב HBV DNA מתרחשת מעט לעיתים רחוקות, בקצב של 1 לכל 104 תאים13,18,19,20. שאלות חשובות בנוגע לשילוב HBV DNA נותרו ללא מענה, במיוחד לגבי המדויק מסלולים מולקולריים המעורבים, התלות ויראלי וגורמים המארח, אנטיגנים ויראלי הביע טפסים משולב, ואת תרומתם אפשרי התמדה ויראלי7. הקמנו מודל במבחנה לשפוך אור על חלק מהשאלות האלה.
בנגישות של HBV DNA שילוב אירועים (הן לגבי קצב אינטגרציה בכל תא, למספר עותק של כל שילוב ייחודי) במבחנה HBV זיהום מודלים להפוך אותם מאתגר כדי לזהות. תא מיטוזה מוגבל במערכת שלנו במבחנה , כמו החלוקה תאים שלא תומכים זיהום יעיל. לפיכך, בניגוד ברקמות הכבד החולה שבו משובט הרחבה משמעותית של hepatocytes מתרחשת18,19,20, מאוד (1-2) עותקים של כל שילוב נוכחים בבריכה מסוים של תאים נגועים במבחנה . מצאנו גם כי שילוב מתרחשת בעיקר במהלך זיהום ראשוני של hepatocytes (וגם לא ברציפות ב נגועה באופן כרוני hepatocytes)13. בהתאם לכך, שילוב HBV DNA לא יכול להיות מוגברת על ידי פשוט culturing תאים לתקופה ארוכה יותר.
באופן כללי, שיטות השתמשת קודם לכן כדי לזהות משולב HBV DNA, כולל דרום כתם הכלאה21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , בתיווך קלטת מצדו PCR28, הגנום כל רצף29,30,31,32,33, אין לי את הרגישות לזהות יחיד-עותקים של שילובים. ואנו חוקרים אחרים השתמשו ההופכי מקונן PCR (invPCR) לאתר האינטגרציה דנ א hepadnaviral ברווז וודצ'אק, כבדי אדם נגוע13,14,18,19, 35, 34,36. אחרים הציגו פרוצדורלי שינויים הטכניקה invPCR עשוי לשנות את הדור של אותות חיובי-false, להגביל את היכולת של כימות37. אם וזמינותו מתבצעת כפי שמתואר פרוטוקול זה, invPCR מייצג assay בדיקה רגישה וספציפית מזהה, מכמת (במספרים העתקה מוחלטת) שילובים HBV DNA מרובים. צומת תאים HBV DNA הוא רציף ברזולוציה זוג יחיד-בסיסים, ומאפשר bioinformatical מחקרים של נגיפי, מארח ה-DNA רצף באתרים של אינטגרציה13.
בעבר תארנו38 תוצאות של invPCR על רקמה נגועה הדנ א של HBV מופק מגוון רחב של מקורות, כולל מוקפאים snap רקמות הכבד, פרפין-מוטבע מקטעים הכבד של דגימות רקמה קטן מאוד מבודד על ידי לייזר-microdissection19. פרוטוקול זה מתאר גרסה מעודכנת של וזמינותו invPCR באמצעות DNA מופק רקמות נגזר התרבות תאים לאחר במבחנה זיהום, שבו נוצרות עותק נמוך מספרים של שילובי (1-2 עותקים לכל שילוב). ה HBV DNA שילובים יצרו במבחנה דומים לאלה שנמצאו רקמות החולה לגבי פריסתם על הגנום הסלולר ועל צומת בתוך הרצף ויראלי זה משולב13,16, רומז מסלול דומה כדי בתוך הכבד נגוע.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

וירוס הפטיטיס B (HBV) הוא נישא בדם הפתוגן השכיח גרימת סרטן כבד, שחמת הכבד הנובע דלקת כרונית. הנגיף משכפל בדרך כלל דרך DNA episomal ביניים; עם זאת, שילוב של קטעים HBV DNA הגנום מארח נצפתה, אף-על-פי טופס זה אינו נחוץ לצורך שכפול ויראלי. מטרתו המדויקת, תזמון, mechanism(s) על ידי איזה HBV DNA מתרחש שילוב הוא עדיין לא ברורה, אבל לאחרונה נתונים להראות כי זה מתרחשת בשלב מוקדם מאוד לאחר ההדבקה. . הנה, הדור במבחנה וזיהוי של HBV DNA שילובי מתוארים בפירוט. פרוטוקול שלנו במיוחד מגביר עותקים בודדים של תאים וירוס DNA שילובי והיא מאפשרת כימות מוחלט וגם זוג יחיד-בסיסים ברזולוציה של הרצף צומת. טכניקה זו הוחלה על סוגי תאים שונים HBV, רגישים (כולל ראשי hepatocytes אנושי), המוטנטים HBV שונים, בשילוב עם חשיפות סמים שונים. ? למה אתה מתכוון. אנחנו חוזה טכניקה זו הופכת וזמינותו מפתח כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של תופעה זו הרלוונטית קלינית.

ייצוג סכמטי של הטכניקה invPCR מוצג באיור1. דוגמה agarose בג'ל של invPCR מוצלח מוצג באיור 2 לפני ואחרי הבידוד מוצר ה-PCR. איור 3 מראה את הפלט ניתוח הפיצוץ מהשלב 5.1 במקרים של הגברה (i) של צומת ה-DNA וירוס-תא ו (ii) הגברה של ביניים replicative HBV DNA.
צפוי תוצאות חיוביות פקדים: Huh7-NTCP תאים נגועים מטוהרים הפארין HBV מניות כפי שתואר לעיל (איור 1) יכול לשמש פקד חיובי. במקרה זה, מוצרי ה-PCR יחיד צריך להיות מושגת על ידי דילול 1:3 השני או השלישי של כל דגימה (תואם ל- ~ 104 תאים המקבילים לכל דילול, איור 2). -אלה דילולים, כ- 50% של מוצרים מייצגות וירוס אמיתי-תא DNA צמתים, בעוד החצי השני מייצג הגברה של HBV DNA intermediates (איור 3).
מחקרים קודמים13, מצאנו כמה מופעים של צמתי תא וירוס חוזרות ונשנות, רומז אין אתרי גנומית הסלולר של אינטגרציה HBV DNA מועדף. גם נמצא כי ^80% של תאים וירוס צמתי להתרחש בין נוקלאוטידים 1732 ו- 1832 (לפי נוקלאוטיד המספור של HBV גנוטיפ D, ההצטרפות GenBank #U95551.1), כאשר האחרון מייצג הסופית יד ימינו של הטופס dslDNA HBV. רצפים של צמתי וירוס אמיתי-תא מצא דרך השיטה שלנו ניסויים במבחנה זמינים בפומבי ב GenBank (ההצטרפות מספרים MH057851 כדי MH058006).
צפוי תוצאות שליליות פקדים: uninfected Huh7-NTCP תאים או מחוסן Huh7-NTCP תאים טרום טיפול עם Myrcludex B יכול לשמש כפקדי שלילי. ניתוח InvPCR של ה-DNA שחולצו מן התאים האלה צריך לייצר מוצרים PCR. הפעלת הדגימות שלילי-פקד באותה צלחת PCR כדוגמאות חיובית מאפשרת בדיקה של זיהום צולב במהלך תהליך מקונן-PCR. הבדיקה המחמירים ביותר של זיהום צולב הוא הפעלה של מדגם שלילי-בקרה בבארות A-D והמדגם חיובי בבארות E-H על צלחת 96-ובכן. במקרה זה, דילול הכי מרוכז של המדגם חיובי מופעל ברציפות סמוכים ישירות הדילול לפחות מרוכז של הדגימה שלילית. אם מוצרי הגברה הם נצפו בדגימות שלילי-control, מכון האמצעים הציע בדיון כדי למזער את אירועי זיהום צולב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> איור 1: איור סכמטי של תהליך invPCR כדי לזהות HBV DNA שילובים. לאחר זיהום HBV, רק מיעוט של תאים Huh7-NTCP מכילות HBV dslDNA (אדום) משולב לתוך הגנום של התא המארח (אדום), מתואר בחלק העליון. סה כ ה-DNA ואז שחולצו מן התאים (שלב 1), הפוכה (שלב 2), מוגבר על ידי ה-PCR מקוננים (שלב 3). מוצגות היחסיים של האתרים אנזים הגבלה (המש BsiHKAI ואני) בצומת DNA תאי וירוס נכרת. הדמות היא ממאמרו של הפרסום הקודם13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> איור 2: Agarose ג'ל אלקטרופורזה והפקת ג'ל עוקבות invPCR מוצלח. "M" מייצג את הסולם סמן הדנ א. כל שורה של 12 מייצג משכפל טכני-לדילול יחיד על הצלחת ה-PCR. ניתן להפעיל את שתי דגימות DNA הופכיים לכל PCR צלחת/agarose ג'ל. מוצרים PCR עבור כל דילול אמור titrate בחוץ ב ~ 1:3 יחס. הפקת המוצרים מן דילולים מרוכז לפחות שני איפה להקות יחיד ניתן בקלות לבודד מספיקה בדרך כלל, כפי שיעור אינטגרציה HBV DNA נקבעת על-ידי טיטור מובילים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> איור 3: הפיצוץ אנליזה של רצפים המוצר invPCR. כפי ספינלי ארוך של רצף מופקים מן סנגר רצף, המקור של רצפי DNA הוא בדרך כלל ברורה וחד משמעית. יישור חזקה HBV ו הגנום הסלולר נצפית בתחומים שונים של הקובץ רצף FASTA המופקים סנגר רצף בחלונית העליונה ', רומז צומת ה-DNA תאי וירוס אמיתי. בחלונית התחתונה, מיישר הרצף רק על שברי הגנום HBV, מציעה מוצר שנוצר על ידי ההגברה של HBV DNA הגנום שסודר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

נתאר כאן במבחנה הדור של HBV DNA באמצעות מערכת זיהום וירוס הפטיטיס B, זיהוי רגישה מאוד שלה אינטגרציה (1-2 עותקים) באמצעות ההופכי מקונן PCR.

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח וירולוגיה הפטיטיס B, כגון מציאת גורמים הסלולר או וירולוגי המשפיעים על שילוב DNA HPV. ישנם יתרונות רבים לטכניקה זו. זה זול יחסית, וקל לבצע, ניתוח של התוצאות הוא פשוט, וזה מאוד רגיש, עד עותקים בודדים.למרות שיטה זו יכולה לשמש כדי לספק תובנה אינטגרציה HBV, זה יכול לשמש גם עבור וירוסים אחרים המשתלבים בגנום התא המארח, כגון HIV, HTLV-1, או HPV. כדי להדביק את התאים, זרע 200, 000 תאים למיליליטר בצלחת 12 באר, עם 1 מיליליטר של D-mem. ביום שלמחרת, השתמש בטור הפרין מטוהר su-per-na-din מ HEP-AD 38 כמו inoculant להדביק את התאים ב 1, 000 VGE לכל תא, ב 500 microliters של מדיום תרבות.לאחר מכן, תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס. ואז, ביום שלמחר, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של סטרילי פעם PBS. לאחר מכן, להחליף את מדיום התרבות כל 2 ימים, עד הקציר.ביום 3 לאחר זיהום, לטפל בתאים עם 5 micromolar tenofovir disoproxil ו 10 מיקרומולרי Lamivudine כדי להגביל את הייצור של ביניים שכפול HBV כי הם להגביר את היכולת על ידי PCR ההופכי. ביום 5, לאחר זיהום, trypsinize כמה תאים עם 200 microliters של טריפסין EDTA ולהשעות אותם 2 מיליליטר של D-mem המכיל 5 micromolar Tenofovir disoproxil ו 10 מיקרומולרי Lamivudine. לאחר מכן, להעביר את המתלים התא לצלחת שש גם, כדי לגרום לסיבוב אחד של מיטוזה.ביום 7 לאחר זיהום, טריפסין התאים המורחבים ב 400 microliters של טריפסין EDTA ולהשעות את התערובת ב 1 מיליליטר של D-mem. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה בצינור 1.5 מיליליטר. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 פעמים G, במשך חמש דקות.ולהסיר את הסו-פר-נה-דין בשאיפה. לחלץ את ה-DNA מכדור התא באמצעות ערכת מיצוי DNA, לפי הוראת היצרן. עבור היפוך DNA, להקצות 1.5 כדי 2.5 מיקרוגרם של תמצית ה-DNA הכולל לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר.לאחר מכן, להוסיף את הכמות המתאימה של אנזים הגבלה לערבב כדי לגרום 40 microliter של נפח התגובה, המכיל 1 פעמים חיץ תגובת עיכול ו 10 יחידות NCO-1HF. הדגירה את תגובת האנזים הגבלה במכונת PCR ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, ליעילות עיכול אופטימלית. לאחר מכן, להשבית את האנזים הגבלה על ידי דגירה זה 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.העבר את תגובת האנזים ההגבלה כולה לצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של 1 פעמים T4 מאגר ליגאז DNA ו 500 יחידות של T4 DNA ligase, ומערבבים ביסודיות. נפח תגובה גדול מעודד רצועות תוך-מולקולריות של שברי הדנ"א המתעכלים.הדגירה את תגובת הקשירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות כדי להבטיח קשירה מלאה. לאחר שעתיים, יש להשבית את רצועת הדנ"א T4 ב-70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של 10 נתרן דודצ'יל סולפט כדי להבטיח השבתה מלאה של ligase T4.מוסיפים נתרן כלורי לריכוז סופי של 100 מילימולר, ודקסטרן לריכוז סופי של 90 מיקרוגרם למיליליטר. מערבבים על ידי מערבולת דופק, ולסובב בקצרה את תערובת התגובה. לאחר מכן, להוסיף 900 microliters של 100 אתנול, ומערבבים על ידי היפוך.לזרז את ה-DNA ב 20 מעלות צלזיוס שלילי בן לילה. ו גלולה DNA זירז על ידי צנטריפוגה ב 14000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את Su-per-na-לסעוד על ידי שאיפה.לשטוף את גלולה עם 500 microliters של 70 אתנול. וצנטריפוגה ב 14000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, להסיר את אתנול על ידי שאיפה לייבש את האוויר גלולת ה-DNA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.ממיסים את גלולה ב 20 microliters של מים ולהוסיף 20 microliters של הגבל אנזימים מאסטר לערבב לגרום 40 נפח התגובה microliter, המכיל 1 פעמים חיץ תגובת עיכול, 5 יחידות BSIHK-1, ו 5 יחידות של SPH-1HF. קן, הדגירה תגובת האנזים הגבלה בבלוק חום ב 37 מעלות צלזיוס, במשך שעה אחת. בקצרה לסובב את תערובת התגובה, לה הדגירה את תגובת האנזים הגבלה בבלוק חום ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.בהליך זה, להסיר אמפילונים פוטנציאליים מחתם מחצלת סיליקון לשימוש חוזר, באמצעות פתרון השפלה DNA. יש לשטוף את המחצלת ביסודיות במים נטולי דנ"א ולייבש אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להכין מיליליטר אחד של 1 פעמים PCR לערבב המכיל את פריימרים קדימה והפוך בריכוז של 0.5 micromolar.הוסף 170 microliters אם 1 פעמים PCR לערבב בארות A-1 ו E-1, בצלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן, להוסיף 120 microliters של 1 פעמים PCR לערבב בארות B-1 ו H-1. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של ה-DNA הפוך בארות A-1 ו E-1.מערבבים את התגובה בכל באר, על ידי צינור בעדינות כל אחד, כ 10 פעמים באמצעות P-1000 להגדיר 100 microliters. לדלל באופן סדרתי את הדגימות מ בארות A-1 ל- D-1, ביחס של 1:3 על ידי העברת 60 microliters בכל שלב. מערבבים את הבארים בכל שלב על ידי צינורות בעדינות אותם על 10 פעמים באמצעות P-1000 להגדיר 100 microliters.הימנע להרכיב בועות, לחזור על ההליך גם E-1, דילול עד גם H-1. לאחר מכן, להקצות 10 microliters של תערובת התגובה, באמצעות פיפטה רב ערוצית, מ ולס A-1, H-1, לתוך בארות A-2, H2, A-3, H-3 וכן הלאה, עד להגיע בארות A-12, H-12 של צלחת 96 באר. מכסים את צלחת PCR עם מחצלת סיליקון יבשה, ולחץ בחוזקה.לאחר מכן, למקם את הצלחת במכונת PCR, ולהפעיל את התוכנית המצוינת, לפני העברת הצלחת לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מחממים את הסיכות של משכפל 96 פינים לחום אדום עם מבער בונזן, ואז מצננים לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר. מלאו את בארות לוחית PCR שנייה ב-10 מיקרוליטרים של תערובת PCR 1 פעמים, המכילה חיץ מוכן לעומס ג'ל, ואת הפנימי קדימה ואחורה ב-0.5 מיקרו-מולאר.בזהירות להסיר את מחצלת הסיליקון מצלחת PCR של צלחת 96 גם מן PCR הסיבוב הראשון, ולהימנע זיהום צולב בין בארות. השתמש משכפל מקורר להעביר את מוצרי PCR של צלחת 96 גם, מ PCR בסיבוב הראשון, כדי צלחת 96 באר שהוקצה לאחרונה. לבצע את PCR מקונן, באמצעות התנאי כפי שצוין.כדי לבודד את מוצרי PCR, לנתח אותם על ידי אלקטרופורזה ג'ל, באמצעות צלחת 96 גם, עם 1.3 ג'ל אגרוז. עבור 100 מיליליטר ג'ל אגרוז, לרוץ ב 200 וולט במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, יש למלמל את רצועות הדנ"א מהג'לים של אגרוז, תוך שימוש בקשיות שתייה חד פעמיות.עבור כל מוצר PCR, מניחים את הקש ואת תקע ג'ל אגרוז בצינור 1.5 מיליליטר, לקצץ את הקש לגודל עם מספריים. לאחר מכן, להוציא את אגארוז מתחבר לתוך כל צינור, על ידי סחיטה על קצה שבר הקש. לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי ג'ל, ו-5 מיקרוליטרים של בחנוזי זכוכית מיצוי ג'ל לכל צינור.לחלץ את מוצרי PCR לפי הוראות היצרן עבור ערכת מיצוי ג'ל, ולדלל את ה-DNA מן חרוזים עם 30 microliters של מים. שלח את ה- DNA המטוהר עבור רצף סנגר, עם פריימר קדימה בשימוש בסיבוב השני מקונן PCR. דוגמה אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של PCR הפוכה מוצלחת, לפני ואחרי בידוד מוצר PCR, מוצג כאן.M מייצג סמן DNA האחרון, כל שורה של 12 מייצג את השכפולים הטכניים בדילול יחיד על לוח PCR. במקרה זה, מוצרי PCR יחיד צריך להיות מושגת על ידי דילול 1:3 השני או השלישי של כל מדגם. בדילול זה, כ-50% מהמוצרים ייצגו צמתים אמיתיים של DNA של תאי וירוס.בעוד החצי השני מייצג הגברה של מתווכים DNA HBV. טכניקה זו אפשרה לחוקרים לחקור אינטגרציית דנ"א HPV במערכות זיהום במבחנה מבוקרות מאוד. שיטות נוספות, כגון ניתוח ביותמטיקה, ניתן להשתמש כדי לענות על שאלות נוספות.לדוגמה, אם אינטגרציה של דנ"א HPV מתרחשת באזורים ספציפיים בגנום התאי. אל תשכח כי עבודה עם זיהום הפטיטיס B וירוס, יכול להיות מסוכן ובקרות זיהום מתאימות, כגון ארונות בטיחות ביולוגית וחיסון קודם, תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...