Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
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इस काम के लिए जर्मन सेंटर फॉर इंफेक्शन रिसर्च (DZIF), TTU हेपेटाइटिस प्रोजेक्ट्स ५.८०७ और ५.७०४, ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (टी. एस. 15), और ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर एचआईवी एंड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च से फंडिंग मिली ।
हम प्रोफेसर विलियम मेसन के लिए मूल invPCR विधि के विकास में अपनी भूमिका के लिए ऋणी है और यह हमारे लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । Yi Ni और फ्लोरियन A. Lempp के लिए रिएजेंट (सेल लाइंस और एचबीवी इनोक्युलम) । हम आंजा Rippert, Franziska Schlund, सारा Engelhardt, और तकनीकी सहायता के लिए डॉ Katrin Schöneweis स्वीकार करते हैं । हम ठीक करने के लिए मरियम Kleinig के लिए आभारी हैं, और प्रोफेसरों निकोलस Shackel और Ralf Bartenschlager निरंतर समर्थन के लिए ।

S.U. एक सह आवेदक और सह एक एचबीवी/HDV प्रवेश अवरोधक के रूप में Myrcludex बी की रक्षा पेटेंट के आविष्कारक है । टीटी ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की ।

प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले, यह ध्यान दें कि इस invPCR परख एक अति संवेदनशील तकनीक, डीएनए की एकल प्रतियां बढ़ाना करने में सक्षम है महत्वपूर्ण है टेंपलेट । इसलिए, पीसीआर उत्पादों से संक्रमण सीमित अत्यंत महत्वपूर्ण है । पीसीआर उत्पाद संदूषण को सीमित करने के लिए सामांय रणनीतियों में निंनलिखित शामिल हैं । (i) विधि के विभिंन चरणों के लिए भौतिक रूप से पृथक क्षेत्र स्थापित करना । प्रत्येक क्षेत्र अलग लैब कोट होना चाहिए, और दस्ताने जब इन क्षेत्रों के बीच चलती परिवर्तित किया जाना चाहिए । हम नीचे इन क्षेत्रों सूचीबद्ध किया है क्रम में सबसे अधिक से कम करने के लिए दूषित होने की संभावना: पीसीआर उत्पाद निष्कर्षण और sequencing प्रतिक्रिया सेट-अप क्षेत्र (पोस्ट-पीसीआर); पीसीआर टेम्पलेट इसके अलावा और ज्वाला-पिन स्थानांतरण क्षेत्र (हम अच्छे परिणाम के साथ एक दूषित यूवी लैंप के साथ पीसीआर डाकू का इस्तेमाल किया है); डीएनए निष्कर्षण और उलटा क्षेत्र (पूर्व पीसीआर); और एक "डीएनए टेंपलेट मुक्त" क्षेत्र केवल स्टॉक और पीसीआर समाधान की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया । (ii) प्रयोगशाला में वायु प्रवाह को क्रॉस-संदूषण के संभावित चालक के रूप में जागरूक करना । विशेष रूप से, क्रॉस-संदूषण पीसीआर प्रतिक्रियाओं के दौरान लौ पिन स्थानांतरण चरण होने की संभावना है और एकीकरण आवृत्ति के गलत ठहराव करने के लिए नेतृत्व करेंगे । पीसीआर डाकू इन पार धाराओं को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नकारात्मक नियंत्रण कुओं (जैसे, Myrcludex बी-इलाज नमूने या कोई टेम्पलेट नियंत्रण) पीसीआर में भी क्रॉस-संदूषण के लिए परीक्षण किया जा सकता है । (iii) एक डीएनए क्षरण समाधान के साथ नियमित रूप से उंहें नीचे पोंछते द्वारा पिपेट और काम सतहों पर संभावित पीसीआर दूषित पदार्थों की सीमा ।
यहां निर्दिष्ट प्रोटोकॉल एक ज्ञात संक्रामक एचबीवी HepAD38 सेल लाइन४२से उत्पंन क्लोन के एकीकरण का पता लगाने के लिए व्यवस्था की है । यदि इनोक्युलम इस्तेमाल एक अलग एचबीवी डीएनए अनुक्रम का है (जैसे, रोगी सीरम से), तो एचबीवी जीनोम पहले पीसीआर प्राइमरों और उलटा डिजाइन की अनुकूलता की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम किया जाना चाहिए । में पहले प्रकाशित अध्ययन19, हम प्राइमरों कि बांध संरक्षित एचबीवी डीएनए एचबीवी डीएनए एकीकरण जंक्शनों की उंमीद की साइट पार्श्व दृश्यों के 3 सेट का इस्तेमाल किया है । अन्य प्राइमरी दृश्यों और प्रोटोकॉल एचबीवी४४,४५,४६,४७,४८ के जीनोमिक अनुक्रम का निर्धारण करने के लिए वर्णित किया गया है और सफलतापूर्वक काम कर सकते हैं.
इसके अलावा, विभिंन एचबीवी अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (जैसे, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स, विभेदित HepaRG, HepG2-NTCP कोशिकाओं) इस्तेमाल किया जा सकता है; लेकिन, हमने पाया है कि Huh7-NTCP कोशिकाओं को सबसे बड़ा संकेत-शोर अनुपात प्रदान करते हैं, जब वायरस सेल डीएनए जंक्शनों कि वायरस मध्यवर्ती डीएनए है कि13प्रवर्धित है की तुलना में परिवर्धित कर रहे है की संख्या पर विचार । विशेष रूप से, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स या विभेदित HepaRG जैसे टर्मिनल विभेदित कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक बँटवारा से गुजरना नहीं पड़ता, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के भीतर शेष प्रवर्धित एचबीवी डीएनए नकलत्मक मध्यवर्ती होते हैं । हमने पाया है कि ~ ९०% प्रवर्धित अनुक्रम एचबीवी डीएनए पुनर्व्यवस्थाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं (और नहीं एकीकरण की घटनाओं) में टर्मिनल-विभेदित कोशिकाओं, 70 की तुलना में-hepatoma सेल लाइनों13में 50%. इन उत्पादों को आम तौर पर कर रहे है डीएनए जीनोम एचबीवी सतह और कोर खुले पढ़ने के फ्रेम में बड़े विलोपन युक्त, या वे एक अतिरिक्त Ncoमैं Sphसाइट से पहले साइट के साथ एचबीवी अर्ध प्रजातियों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इन एचबीवी प्रजातियों के प्रवर्धन (एक योजनाबद्ध आरेख सहित) विस्तार से वर्णित किया गया है पहले13।
इस विधि में कई कमियां हैं । इस प्रोटोकॉल की श्रमसाध्य और बहु-दिवसीय प्रकृति के कारण, invPCR नमूनों की एक बड़ी संख्या का उच्च प्रवाह विश्लेषण करने के लिए अनुकूल नहीं है । इसके अलावा, के रूप में यह कमजोर पड़ने अनुमापन सीमित पर निर्भर करता है, हमारी विधि ठहराव में अत्यधिक सटीक नहीं है; हालांकि, यह आसानी से एकीकरण आवृत्ति में लॉग-स्तर परिवर्तन को मापने चाहिए ।
इसके अलावा, हमारे उलटा प्रोटोकॉल केवल एचबीवी जीनोम के DR2 और DR1 क्षेत्र के बीच होने वाले एकीकरण का पता लगाने के लिए अनुकूल है, एचबीवी एकीकरण के बहुमत के रूप में इस क्षेत्र४९के भीतर होते हैं । एचबीवी रोगी ऊतकों के NGS विश्लेषण से पता चला है कि एक बड़े अल्पसंख्यक (अप करने के लिए ~ ५०%) भी इस क्षेत्र के बाहर हो सकता है४९। नई invPCR डिजाइन सैद्धांतिक रूप से इन अंय एकीकरण साइटों का पता लगाने में सक्षम हैं, हालांकि वे (हमारे ज्ञान के लिए) नहीं किया गया है अभी तक । संबंधित, आवश्यक प्रतिबंध के कारण एंजाइम साइटों के लिए वायरस से बहाव की आवश्यकता-सेल जंक्शन अनुक्रम उलटा प्रतिक्रिया के लिए, invPCR सभी DR2 और एचबीवी जीनोम के DR1 क्षेत्रों के भीतर होने वाले एकीकरण का पता नहीं लगाता है (यानी, हम अनुमान है कि ~ सभी एकीकरण के 10% silico सिमुलेशन13 में उपयोग कर रहे हैं) । हालांकि, जब विभिंन उपचार की छोटी संख्या के साथ नमूनों की एक केंद्रित बैच के लिए आवेदन किया, invPCR एक ही आधार युग्म संकल्प पर एकीकृत एचबीवी डीएनए का पता लगाने के लिए केवल व्यावहारिक तरीकों में से एक है ।
इसलिए हम इस विधि के अनुप्रयोगों के वायरल खोजने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा कल्पना (एचबीवी इनोक्युलम के उत्परिवर्तनों के द्वारा), सेलुलर (विशिष्ट सेलुलर जीन के नॉकआउट या के माध्यम से, या विभिंन दवाओं के आवेदन के माध्यम से), और पर्यावरण ( उदाहरण के लिए, ऑक्सीडेटिव तनाव के जोखिम) कारकों है कि एचबीवी डीएनए एकीकरण प्रेरित । इस विधि और नव विकसित एचबीवी संक्रमण प्रणालियों के साथ, हम इन कारकों का अभूतपूर्व नियंत्रण इतना है कि वे अच्छी तरह से अलग और बेहतर विशेषता हो सकता है सक्षम करें । हम यह भी उंमीद करते है कि यह एचबीवी डीएनए एकीकरण के सेलुलर परिणामों की एक महत्वपूर्ण समझ के लिए नेतृत्व करेगा, सहित किस हद तक वायरल एंटीजन (जैसे, HBx या HBsAg५०) एकीकृत रूप से व्यक्त कर रहे हैं, क्या इस अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, और चाहे या नहीं एचबीवी एकीकरण काफी सेलुलर phenotype एक अधिक समर्थक oncogenic राज्य की ओर बदलता है । इन भावी अध्ययनों के परिणामों में क्रोनिक हेपेटाइटिस बी के इलाज और वायरस की बुनियादी समझ पर इस्तेमाल होने वाली चिकित्सीय रणनीतियों पर गहरा असर पड़ेगा.

एचबीवी एक डबल-कतरा डीएनए वायरस है कि जीवन भर पुराने संक्रमण का कारण बन सकता है, लीवर सिरोसिस और hepatocellular कार्सिनोमा (HCC)1,2,3के लिए अग्रणी । जबकि वहां कई आणविक एचबीवी हठ4 ड्राइविंग तंत्र रहे है (जैसे, epigenetic वायरल transcriptional टेंपलेट के उच्च स्थिरता, प्रतिरक्षा निगरानी के चोरी, और जिगर में हेपैटोसाइट्स के कम कारोबार) और उससे जुड़े HCC दीक्षा के जोखिम5,6 (जैसे, पुरानी सूजन और सेलुलर तनाव रास्ते के सक्रियकरण), मेजबान सेल जीनोम में एचबीवी डीएनए एकीकरण (इन घटनाओं के दोनों के लिए एक रिपोर्ट तंत्र) खराब अध्ययन किया गया है . एक प्रमुख कारण एचबीवी के लिए इन विट्रो संक्रमण प्रणालियों में उपयुक्त की कमी है जो एकीकरण की घटनाओं का विश्वसनीय पता लगाने की अनुमति देते हैं । यहां, हम इन विट्रो पीढ़ी और एचबीवी डीएनए एकीकरण कि अंतर्निहित आणविक तंत्र और तत्संबंधी स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का पता लगाने के लिए एक हाल ही में विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन ।
एचबीवी प्रतिकृति और एचबीवी डीएनए एकीकरण के गठन के पहले7विस्तार में समीक्षा की गई है । संक्षेप में, एचबीवी8,9संक्रमण के लिए मुख्य सेलुलर रिसेप्टर के रूप में सोडियम Taurocholate सह-परिवहन पेप्टाइड (NTCP) का उपयोग कर हेपैटोसाइट्स में प्रवेश करती है । एचबीवी-आराम परिपत्र डीएनए (rcDNA) जीनोम युक्त एचबीवी nucleocapsids नाभिक में प्रवेश करती है, जहाँ rcDNA episomal covalently बंद परिपत्र डीएनए (cccDNA) में परिवर्तित हो जाता है । परमाणु cccDNA वायरल mRNAs और पूर्व जीनोमिक आरएनए (pgRNA)10के लिए transcriptional टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है । एचबीवी पोलीमरेज़ और pgRNA तो नए बनते nucleocapsids (एचबीवी कोर प्रोटीन dimers से बना) में पैक कर रहे हैं । एचबीवी pgRNA रिवर्स है nucleocapsid के भीतर टाइप, या तो एक rcDNA जीनोम में जिसके परिणामस्वरूप या एक डबल-कतरा रैखिक डीएनए (dslDNA) 11 जीनोम,12। ये परिपक्व nucleocapsids युक्त एचबीवी डीएनए जीनोम अंत में लिफाफे और virions के रूप में निर्यात कर रहे हैं ।
dslDNA अणुओं युक्त द्वारा हेपैटोसाइट्स का संक्रमण मेजबान सेल जीनोम13में वायरल एकीकरण में परिणाम कर सकते हैं, प्रतिकृति करने के लिए अग्रणी-एचबीवी डीएनए7,14,15के अक्षम रूपों । एचबीवी डीएनए एकीकरण गुणसूत्र के स्थल पर होता है डबल असहाय डीएनए टूटता है15। सबूत जमते पता चलता है कि प्रत्येक एकीकरण घटना मेजबान सेल जीनोम16,17के भीतर एक अनिवार्य रूप से यादृच्छिक स्थिति में होता है । इसके अलावा, एचबीवी डीएनए एकीकरण होता है कुछ शायद ही कभी, 1 प्रति 104 कोशिकाओं13,18,19,20की दर से । एचबीवी डीएनए एकीकरण के बारे में महत्वपूर्ण सवाल अनुत्तरित रहते हैं, विशेष रूप से शामिल सटीक आणविक रास्ते के बारे में, वायरल और मेजबान कारकों पर निर्भरता, वायरल एकीकृत रूपों से व्यक्त एंटीजन, और उनके संभावित योगदान वायरल हठ7के लिए । हम एक इन विट्रो मॉडल में स्थापित किया है इन सवालों में से कुछ पर प्रकाश डाला ।
एचबीवी डीएनए एकीकरण घटनाओं की दुर्लभ वस्तु (सेल प्रति एकीकरण दर के संबंध में और प्रत्येक अद्वितीय एकीकरण की प्रतिलिपि संख्या के लिए) इन विट्रो में एचबीवी संक्रमण मॉडल उन्हें पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाने के लिए. सेल बँटवारा हमारे इन विट्रो प्रणाली में सीमित है, के रूप में विभाजित कोशिकाओं कुशल संक्रमण का समर्थन नहीं करते. इस प्रकार, रोगी जिगर के ऊतकों के विपरीत जहां हेपैटोसाइट्स के महत्वपूर्ण क्लोनल विस्तार18,19,20, बहुत कुछ होता है (1 से 2) प्रत्येक एकीकरण की प्रतियां इन विट्रो में संक्रमित कोशिकाओं के एक दिए गए पूल में मौजूद हैं . हमने यह भी पाया है कि एकीकरण मुख्य रूप से हेपैटोसाइट्स के प्रारंभिक संक्रमण के दौरान होता है (और लगातार नहीं जीर्ण-संक्रमित हेपैटोसाइट्स में)13. तदनुसार, एचबीवी डीएनए एकीकरण एक लंबी अवधि के लिए बस संवर्धन कोशिकाओं द्वारा नहीं बढ़ाया जा सकता है ।
सामान्य तौर पर, पहले एकीकृत एचबीवी डीएनए का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, दक्षिणी दाग सहित संकरण21,22,23,24,25, Alu-पीसीआर26,27 , कैसेट-मध्यस्थता बंधाव पीसीआर28, और पूरे जीनोम अनुक्रमण29,30,31,३२,३३, का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता नहीं है एकल-एकीकरणों की प्रतियां । हम और अंय शोधकर्ताओं ने उलटा नेस्टेड पीसीआर (invPCR) का इस्तेमाल किया है बतख, woodchuck में hepadnaviral डीएनए एकीकरण का पता लगाने, और मानव संक्रमित जिगर13,14,18,19, ३४,३५,३६. दूसरों invPCR तकनीक है कि झूठी सकारात्मक संकेतों की पीढ़ी को बदल सकता है और३७ठहराव के लिए क्षमता को सीमित करने के लिए प्रक्रियात्मक संशोधनों शुरू की है । यदि परख बाहर किया जाता है के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, invPCR एक विशिष्ट और संवेदनशील परख कि पहचानती है और quantifies (निरपेक्ष प्रति संख्या में) एकाधिक एचबीवी डीएनए एकीकरण का प्रतिनिधित्व करता है । एचबीवी-सेल डीएनए जंक्शन एक एकल आधार युग्म संकल्प पर अनुक्रम है,13एकीकरण की साइटों पर वायरल और मेजबान डीएनए दृश्यों के bioinformatical अध्ययन की अनुमति ।
हम पहले से३८ परिणामों के डीएनए पर invPCR से एचबीवी-संक्रमित ऊतक स्रोतों की एक बड़ी रेंज से निकाले, स्नैप-जमे हुए जिगर के ऊतकों, आयल-एंबेडेड जिगर वर्गों सहित, और बहुत छोटे ऊतक नमूने द्वारा पृथक वर्णित है लेजर-microdissection19. इस प्रोटोकॉल एक invPCR परख के एक अद्यतन संस्करण की रूपरेखा सेल संस्कृति से निकाले डीएनए का उपयोग कर-के बाद इन विट्रो संक्रमण, जिसमें एकीकरण के कम कॉपी संख्या (1-2 एकीकरण प्रति प्रतियां) उत्पंन कर रहे हैं । एचबीवी डीएनए में गठित इन विट्रो उन रोगी ऊतकों में पाया सेलुलर जीनोम और जंक्शन पर वायरल अनुक्रम है कि13एकीकृत है,16के भीतर उनके वितरण के संबंध में, एक सुझाव एक संक्रमित जिगर के भीतर के लिए तुलनीय मार्ग ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) एक आम रक्त जनित रोगज़नक़ जिगर कैंसर और जिगर सिरोसिस के कारण पुरानी संक्रमण से उत्पन्न होता है । वायरस आम तौर पर एक episomal डीएनए मध्यवर्ती के माध्यम से दोहराने; हालांकि, मेजबान जीनोम में एचबीवी डीएनए टुकड़े के एकीकरण मनाया गया है, भले ही इस फार्म वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक नहीं है । सटीक प्रयोजन, समय, और तंत्र (ओं) द्वारा जो एचबीवी डीएनए एकीकरण होता है अभी तक स्पष्ट नहीं है, लेकिन हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि यह संक्रमण के बाद बहुत जल्दी होता है । यहां, इन विट्रो पीढ़ी और एचबीवी डीएनए एकीकरण का पता लगाने में विस्तार से वर्णित हैं । हमारे प्रोटोकॉल विशेष रूप से वायरस सेल डीएनए एकीकरण की एकल प्रतियां परिलक्षित करता है और दोनों निरपेक्ष ठहराव और जंक्शन अनुक्रम के एकल आधार जोड़ी संकल्प की अनुमति देता है । विभिंन एचबीवी म्यूटेंट के लिए विभिंन एचबीवी-अतिसंवेदनशील सेल प्रकारों (प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स सहित), और विभिंन दवा जोखिम के साथ संयोजन के रूप में इस तकनीक को लागू किया गया है । हम इस तकनीक की उंमीद एक चाबी परख बनने के लिए इस नैदानिक प्रासंगिक घटना के अंतर्निहित आणविक तंत्र का निर्धारण ।

invPCR तकनीक का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1में दिखाया गया है । एक सफल invPCR का एक उदाहरण agarose जेल ट्रो से पहले और बाद में पीसीआर उत्पाद अलगाव चित्रा 2 में दिखाया गया है । चित्रा 3 के मामलों में ५.१ कदम से विस्फोट विश्लेषण उत्पादन से पता चलता है (i) वायरस के प्रवर्धन-सेल डीएनए जंक्शन और (द्वितीय) एक एचबीवी डीएनए नकल मध्यस्थ के प्रवर्धन.
सकारात्मक नियंत्रण से अपेक्षित परिणाम: Huh7-NTCP ऊपर वर्णित के रूप में हेपरिन-शुद्ध एचबीवी शेयरों से संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 1) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं । इस उदाहरण में, एकल पीसीआर उत्पादों प्रत्येक नमूने के दूसरे या तीसरे 1:3 कमजोर पड़ने से प्राप्त किया जाना चाहिए (इसी के लिए ~ 104 कमजोर पड़ने प्रति सेल समकक्ष, चित्रा 2) । इन कमजोर पड़ने पर, उत्पादों के लगभग ५०% सच वायरस-सेल डीएनए जंक्शनों का प्रतिनिधित्व करेंगे, जबकि अंय आधा एचबीवी डीएनए मध्यवर्ती (चित्रा 3) के प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है ।
पिछले अध्ययन13में, हम दोहराया वायरस सेल जंक्शनों के कुछ उदाहरणों पाया है, कोई सेलुलर जीनोमिक साइटों अधिमानी एचबीवी डीएनए एकीकरण का सुझाव । हम यह भी पाते है कि >वायरस के ८०%-सेल जंक्शनों न्यूक्लियोटाइड १७३२ और १८३२ के बीच होते है (एचबीवी जीनोटाइप डी के न्यूक्लियोटाइड क्रमांकन के अनुसार, GenBank प्रवेश #U95551 .1), जहां उत्तरार्द्ध एचबीवी dslDNA फार्म का सही हाथ टर्मिनस का प्रतिनिधित्व करता है । सच वायरस के जुगाड़-सेल जंक्शनों में हमारी विधि के माध्यम से मिला इन विट्रो प्रयोगों पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है GenBank (प्रवेश संख्या MH057851 करने के लिए MH058006).
ऋणात्मक नियंत्रणों से अपेक्षित परिणाम: या तो संक्रमित Huh7-NTCP कक्ष या inoculated Huh7-NTCP कक्षों Myrcludex B के साथ पूर्व-इलाज नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं । इन कोशिकाओं से निकाले गए डीएनए का InvPCR विश्लेषण कोई पीसीआर उत्पादों का उत्पादन करना चाहिए । सकारात्मक नमूने के रूप में एक ही पीसीआर प्लेट पर इन नकारात्मक नियंत्रण नमूने चल रहे नेस्टेड-पीसीआर प्रक्रिया के दौरान पार संदूषण के परीक्षण के लिए अनुमति देता है । क्रॉस-संदूषण के लिए सबसे कड़े परीक्षण कुओं में एक नकारात्मक नियंत्रण के नमूने ए डी और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट पर कुओं ई एच में सकारात्मक नमूना के चल रहा है । इस मामले में, सकारात्मक नमूने के सबसे केंद्रित कमजोर पड़ने के नकारात्मक नमूना के कम केंद्रित कमजोर पड़ने के लिए सीधे आसंन एक पंक्ति में चलाया जाता है । यदि प्रवर्धन उत्पादों नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में मनाया जाता है, इस चर्चा में सुझाव दिया उपायों को पार करने के लिए संदूषण घटनाओं को कम ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> चित्रा 1: एचबीवी डीएनए एकीकरण का पता लगाने के लिए invPCR प्रक्रिया का योजनाबद्ध आंकड़ा. एचबीवी संक्रमण के बाद, केवल Huh7-NTCP कोशिकाओं के एक अल्पसंख्यक एचबीवी dslDNA (लाल) मेजबान सेल जीनोम (लाल), शीर्ष अनुभाग में चित्रित में एकीकृत होते हैं । कुल डीएनए तो कोशिकाओं से निकाला जाता है (चरण 1), औंधा (चरण 2), और नेस्टेड पीसीआर द्वारा परिवर्धित (चरण 3). दिखाया गया है कि उत्पाद वायरस-सेल डीएनए जंक्शन में प्रतिबंध एंजाइम साइटों (Ncoमैं और बीएसआईHKAI) के सापेक्ष पदों रहे हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से अनुकूलित है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> चित्रा 2: Agarose जेल ट्रो और एक सफल invPCR के बाद जेल निष्कर्षण । "एम" डीएनए मार्कर सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है । 12 की प्रत्येक पंक्ति पीसीआर प्लेट पर एक एकल कमजोर पड़ने पर तकनीकी प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है । प्रति पीसीआर प्लेट/agarose जेल में दो उल्टे डीएनए नमूने चलाए जा सकते हैं । प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए पीसीआर उत्पादों ~ 1:3 अनुपात में बाहर अनुमापन चाहिए । एचबीवी डीएनए एकीकरण दर अंत बिंदु अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाता है के रूप में एक बैंड आसानी से अलग हो सकता है, जहां दो से कम ध्यान केंद्रित कमजोर पड़ने से उत्पादों की निष्कर्षण । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> चित्रा 3: invPCR उत्पाद दृश्यों का विस्फोट विश्लेषण । अनुक्रम के लंबे समय तक के रूप में सैंज sequencing से उत्पन्न होते हैं, डीएनए दृश्यों का स्रोत आम तौर पर अस्पष्ट है. एचबीवी और सेलुलर जीनोम के लिए मजबूत संरेखण एक सच्चे वायरस सेल डीएनए जंक्शन का सुझाव है, शीर्ष पैनल में सैंज अनुक्रमण से उत्पन्न फसता अनुक्रम फ़ाइल के विभिन्न क्षेत्रों में मनाया जाता है । नीचे पैनल में, अनुक्रम केवल एचबीवी जीनोम के टुकड़े करने के लिए संरेखित करता है, एक पुनर्व्यवस्थित एचबीवी डीएनए जीनोम के प्रवर्धन द्वारा उत्पंन उत्पाद का सुझाव । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

हम यहां का वर्णन इन विट्रो पीढ़ी में एक हेपेटाइटिस बी वायरस संक्रमण प्रणाली के माध्यम से एचबीवी डीएनए और इसके (1-2 प्रतियां) का अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने व्युत्क्रम नेस्टेड पीसीआर का उपयोग कर एकीकरण ।

कम कॉपी नंबर का पता लगाने एकीकृत वायरल डीएनए में द्वारा गठित इन विट्रो हेपेटाइटिस बी संक्रमण

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

वायरल डीएनए के Nucleocapsids से तैयार

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

सच का पता लगाने के लिए माउस बी वंश प्रकोष्ठों आईजीई व्यक्त

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

की जांच के लिए Lyophilized लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन अभिकर्मकों का विकास<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

मापने एंजाइम से जुड़ी Lectin परख द्वारा इन्फ्लुएंजा neuraminidase निषेध एंटीबॉडी titers

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

एक हेपेटाइटिस बी वायरस संवाददाता प्रणाली का विकास प्रतिकृति चक्र के प्रारंभिक दौर नजर रखने के लिए

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

पर सतहों मानव Norovirus की जांच के लिए स्वाब नमूने विधि

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

एसोसिएटेड वायरल और सेलुलर प्रोटीन की पहचान के लिए वायरल डीएनए का शुद्धिकरण

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"जिगर पर एक चिप" हेपेटाइटिस बी वायरस के संक्रमण के लिए प्राथमिक हेपैटोसाइट्स और Kupffer कोशिकाओं की संस्कृतियों

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...