कम कॉपी नंबर का पता लगाने एकीकृत वायरल डीएनए में द्वारा गठित इन विट्रो हेपेटाइटिस बी संक्रमण

इस विधि का उपयोग हेपेटाइटिस बी वायरोलॉजी में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एचपीवी डीएनए एकीकरण को प्रभावित करने वाले सेलुलर या वायरलॉजिकल कारकों को ढूंढना। इस तकनीक के कई फायदे हैं। यह अपेक्षाकृत सस्ता है, और बाहर ले जाने के लिए आसान है, परिणामों का विश्लेषण सरल है, और यह बहुत संवेदनशील है, एक प्रतियां नीचे ।

हालांकि इस विधि का उपयोग एचबीवी एकीकरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन इसका उपयोग अन्य वायरसों के लिए भी किया जा सकता है जो मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत होते हैं, जैसे एचआईवी, एचटीएलवी-1, या एचपीवी। कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, बीज 200, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर एक बारह अच्छी तरह से थाली में, डी मेम के 1 मिलीलीटर के साथ। अगले दिन, संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोलीटर में, कोशिकाओं को 1, 000 वीजीई प्रति सेल पर संक्रमित करने के लिए अनुमेय के रूप में हेपरिन कॉलम का उपयोग करें हेपरिन कॉलम शुद्ध एस-प्रति-ना-दीन एचईपी-एडी 38 से।

फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं संस्कृति । फिर, अगले दिन, कोशिकाओं को दो बार बाँझ एक बार PBS के एक मिलीलीटर के साथ धोएं। फिर, फसल तक, हर 2 दिनों में संस्कृति माध्यम को बदलें।

संक्रमण के बाद के दिन में, एचबीवी प्रतिकृति मध्यवर्ती के उत्पादन को सीमित करने के लिए 5 माइक्रोमोलर टेनोफोविर डिसोप्रोक्सिल और 10 माइक्रोमोलर लामिवुडीन के साथ कोशिकाओं का इलाज करें जो इनवर्स पीसीआर द्वारा सक्षम हैं। संक्रमण के बाद 5 दिन, ट्राइप्सिन ईडीटीए के 200 माइक्रोलीटर के साथ कुछ कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और उन्हें डी-मेम के 2 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें जिसमें 5 माइक्रोमोलर टेनोफोवीर डिसोप्रोक्सिल और 10 माइक्रोमोलर लैमिवुडीन होते हैं। इसके बाद, माइटोसिस के एक दौर को प्रेरित करने के लिए सेल निलंबन को छह अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।

संक्रमण के बाद के दिन 7, ट्रिप्सिन ईडीटीए के 400 माइक्रोलीटर में विस्तारित कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और डी-मेम के 1 मिलीलीटर में मिश्रण को निलंबित करें। फिर, निलंबन को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए, 500 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें।

और आकांक्षा द्वारा सु-प्रति-ना-दीन को हटा दें । निर्माता के निर्देश के अनुसार, डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके सेल पेलेट से डीएनए निकालें। डीएनए उलटा के लिए, कुल डीएनए निकालने के १.५ से २.५ माइक्रोग्राम एक २०० माइक्रोलीटर पीसीआर ट्यूब में आवंटित करें ।

इसके बाद, 40 माइक्रोलीटर की प्रतिक्रिया मात्रा में परिणामस्वरूप प्रतिबंध एंजाइम मास्टर मिश्रण की उचित मात्रा जोड़ें, जिसमें 1 गुना पाचन प्रतिक्रिया बफर और 10 इकाइयां एनसीओ-1HF शामिल हैं। इष्टतम पाचन दक्षता के लिए, एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर मशीन में प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। फिर, प्रतिबंध एंजाइम को 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटिंग करके निष्क्रिय करें।

पूरे प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। इसके बाद, 1 गुना T4 डीएनए लिगाज़ बफर के 400 माइक्रोलीटर और टी 4 डीएनए लिगाज़ की 500 इकाइयों को जोड़ें, और अच्छी तरह से मिलाएं। बड़ी प्रतिक्रिया मात्रा पचा डीएनए टुकड़ों के इंट्रामॉलिक्यूलर लिगेशन को प्रोत्साहित करती है।

पूर्ण लिगेशन सुनिश्चित करने के लिए 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर लिगेशन प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। 2 घंटे के बाद, टी 4 डीएनए लिगाज़ को 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय करें। फिर, T4 ligase की पूरी निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए 10 सोडियम डोडेडेडिल सल्फेट के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।

100 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में सोडियम क्लोराइड जोड़ें, और डेक्सट्रान को 90 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। पल्स भंवर से मिलाएं, और प्रतिक्रिया मिश्रण को संक्षेप में स्पिन करें। इसके बाद, 100 इथेनॉल के 900 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उलटा करके मिलाएं।

डीएनए को रातोंरात नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर उपजी । और 15 मिनट के लिए 14000 बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा उपजी डीएनए गोली। इसके बाद आकांक्षा द्वारा सु-प्रति-ना-डाइन को हटा दें ।

70 इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर से गोली धोएं। और 15 मिनट के लिए 14000 बार जी पर अपकेंद्रित्र। फिर, आकांक्षा द्वारा इथेनॉल को हटा दें और हवा से 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए गोली को सुखा दें।

पानी के 20 माइक्रोलीटर में गोली को भंग करें और 40 माइक्रोलीटर रिएक्शन वॉल्यूम के परिणामस्वरूप प्रतिबंधित एंजाइम मास्टर मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, जिसमें 1 गुना पाचन प्रतिक्रिया बफर, 5 इकाइयां BSIHK-1, और SPH-1HF की 5 इकाइयां शामिल हैं। घोंसला, 1 घंटे के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक में प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। संक्षेप में प्रतिक्रिया मिश्रण नीचे स्पिन, 1 घंटे के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक में प्रतिबंध एंजाइम प्रतिक्रिया इनक्यूबेट ।

इस प्रक्रिया में, डीएनए क्षरण समाधान का उपयोग करके, पुन: प्रयोज्य सिलिकॉन मैट सील से संभावित एम्प्लिकोन्स को हटा दें। चटाई को डीएनए मुक्त पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें और हवा इसे कमरे के तापमान पर सुखा लें। इसके बाद, 0.5 माइक्रोमोलर की एकाग्रता पर बाहरी फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर युक्त 1 बार पीसीआर मिश्रण का एक मिलीलीटर तैयार करें।

96 कुआं पीसीआर प्लेट में अगर 1 बार पीसीआर मिक्स कर वेल्स ए-1 और ई-1 में 170 माइक्रोलीटर डालें। इसके बाद 1 बार पीसीआर मिक्स के 120 माइक्रोलीटर को वेल्स बी-1 और एच-1 में डालें। इसके बाद, कुओं ए-1 और ई-1 में उल्टे डीएनए के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।

प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिलाएं, धीरे-धीरे प्रत्येक को पाइपिंग करके, पी-1000 सेट का उपयोग करके 100 माइक्रोलीटर तक लगभग 10 बार। प्रत्येक चरण में 60 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करके 1:3 के अनुपात में कुओं ए-1 से डी-1 तक नमूनों को क्रमिक रूप से पतला करें। 100 माइक्रोलीटर के लिए एक पी-1000 सेट का उपयोग करके धीरे-धीरे उन्हें 10 बार पाइपिंग करके प्रत्येक चरण में कुओं को मिलाएं।

बुलबुले बनाने से बचें, अच्छी तरह से ई-1 के लिए प्रक्रिया दोहराएं, अच्छी तरह से एच-1 को कमजोर करें। इसके बाद, 96 वेल प्लेट के वेल्स ए-12, एच-1 और एसओ-ऑन तक कुओं ए-12, एच-12 तक, कुओं ए-12, एच-12 तक पहुंचने तक, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर आवंटित करें। पीसीआर प्लेट को सूखे सिलिकॉन मैट से ढक कर मजबूती से दबाएं।

फिर, प्लेट को पीसीआर मशीन में रखें, और प्लेट को कमरे के तापमान में स्थानांतरित करने से पहले, इंगित कार्यक्रम चलाएं। इसके बाद, एक 96 पिन प्रतिकृति के पिन को बुनसेन बर्नर के साथ लाल-गर्म करने के लिए गर्म करें, फिर कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए ठंडा करें। 1 बार पीसीआर मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर के साथ एक दूसरी पीसीआर प्लेट के कुओं को भरें, जिसमें जेल लोड तैयार बफर होता है, और आंतरिक आगे और रिवर्स 0.5 माइक्रोमोलर पर।

ध्यान से पहले दौर पीसीआर से 96 अच्छी तरह से प्लेट की पीसीआर प्लेट से सिलिकॉन चटाई को हटा दें, और कुओं के बीच क्रॉस-संदूषण से बचें। 96 अच्छी तरह से प्लेट के पीसीआर उत्पादों को स्थानांतरित करने के लिए ठंडा प्रतिकृति का उपयोग करें, पहले दौर पीसीआर से, नए आवंटित 96 अच्छी तरह से प्लेट के लिए। नेस्टेड पीसीआर को बाहर निकालें, संकेत के रूप में स्थिति का उपयोग करें।

पीसीआर उत्पादों को अलग करने के लिए, 1.3 एगर उठे जेल के साथ 96 अच्छी प्लेट का उपयोग करके, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा उनका विश्लेषण करें। 100 मिलीलीटर एगर उठे जेल के लिए, 10 से 15 मिनट के लिए 200 वोल्ट पर चलाएं। इसके बाद, डिस्पोजेबल पीने के तिनके का उपयोग करके, एगर उठे जैल से डीएनए बैंड को उत्पादित करें।

प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के लिए, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्ट्रॉ और एगर उठे जेल प्लग रखें, कैंची के साथ आकार के लिए भूसे को ट्रिम करें। इसके बाद, भूसे के टुकड़े के अंत पर फैलाएंगे, प्रत्येक ट्यूब में एगर उठे प्लग को बाहर निकालें। फिर जेल निष्कर्षण बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्रत्येक ट्यूब में जेल निष्कर्षण ग्लास मोतियों के 5 माइक्रोलीटर जोड़ें।

जेल निकालने किट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर उत्पादों को निकालें, और पानी के 30 माइक्रोलीटर के साथ मोतियों से डीएनए को पतला करें। दूसरे दौर नेस्टेड पीसीआर में इस्तेमाल किए जाने वाले फॉरवर्ड प्राइमर के साथ, सेंगर अनुक्रमण के लिए शुद्ध डीएनए प्रस्तुत करें। पीसीआर उत्पाद अलगाव से पहले और बाद में सफल व्युत्क्रम पीसीआर का एक उदाहरण एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस को यहां दिखाया गया है।

एम डीएनए मार्कर बाद का प्रतिनिधित्व करता है, 12 की प्रत्येक पंक्ति पीसीआर प्लेट पर एक ही कमजोर पड़ने पर तकनीकी प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करती है । इस उदाहरण में, प्रत्येक नमूने के दूसरे या तीसरे 1:3 कमजोर पड़ने से एकल पीसीआर उत्पादों को प्राप्त किया जाना चाहिए। इन कमजोर पड़ने पर, लगभग 50% उत्पाद सच्चे वायरस सेल डीएनए जंक्शनों का प्रतिनिधित्व करेंगे।

जबकि दूसरा आधा एचबीवी डीएनए इंटरमीडिएट के प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है । इस तकनीक ने शोधकर्ताओं को अत्यधिक नियंत्रित इन-विट्रो संक्रमण प्रणालियों में एचपीवी डीएनए एकीकरण का पता लगाने की अनुमति दी है । बायोथेमेटिक्स विश्लेषण जैसे अतिरिक्त तरीकों का उपयोग आगे के सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

उदाहरण के लिए, यदि एचपीवी डीएनए एकीकरण सेलुलर जीनोम में विशिष्ट क्षेत्रों में होता है। यह न भूलें कि संक्रमण हेपेटाइटिस बी वायरस के साथ काम करना, खतरनाक और उपयुक्त संक्रमण नियंत्रण हो सकता है, जैसे जैव सुरक्षा अलमारियाँ और पूर्व टीकाकरण, इन प्रक्रियाओं को करते समय हमेशा लिया जाना चाहिए।