Oppdagelse av lavt kopi nummer integrert virus-DNA dannet av In Vitro hepatitt B-smitte

Denne metoden kan brukes til å svare på viktige spørsmål i hepatitt B-virologi, for eksempel å finne cellulære eller virologiske faktorer som påvirker HPV DNA-integrering. Det er flere fordeler med denne teknikken. Det er relativt billig, og lett å utføre, analyse av resultatene er enkel, og det er veldig følsomt, ned til enkeltkopier.

Selv om denne metoden kan brukes til å gi innsikt i HBV-integrasjon, kan den også brukes til andre virus som integreres i vertscellegenomet, for eksempel HIV, HTLV-1 eller HPV. For å infisere cellene, frø 200, 000 celler per milliliter i en tolv brønnplate, med 1 milliliter D-mem. Neste dag bruker du Heparin-kolonnen renset su-per-na-din fra HEP-AD 38 som inokuler for å infisere cellene ved 1000 VGE per celle, i 500 mikroliter kulturmedium.

Deretter kultur cellene på 37 grader Celsius. Deretter, neste dag, vask cellene to ganger med en milliliter steril en gang PBS. Deretter erstatter du kulturmediet hver 2.

Ved dag 3 post infeksjon, behandle cellene med 5 mikromolar tenofovirdisoproksil og 10 mikromolar Lamivudin å begrense produksjonen av HBV repliktive mellomprodukter som er forsterket av inverse PCR. På dag 5, post infeksjon, trypsinize noen celler med 200 mikroliter trypsin EDTA og re suspendere dem i 2 milliliter D-mem som inneholder 5 mikromolar Tenofovir disoproxil og 10 mikromolar Lamivudine. Deretter overfører du cellesuspensjonene til en seksbrønnplate, for å indusere en runde mitose.

På dag 7 post infeksjon, trypsinize de utvidede cellene i 400 mikroliter av Trypsin EDTA og suspendere blandingen i 1 millileter D-mem. Deretter overfører du suspensjonen i et 1,5 milliliter rør. Pellet cellene ved sentrifugering ved 500 ganger G, i fem minutter.

Og fjern Su-per-na-din ved aspirasjon. Trekk ut DNA fra cellepellet ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett, i henhold til produsentens instruksjon. For DNA-inversjon, tildel 1,5 til 2,5 mikrogram av det totale DNA-ekstraktet til et 200 mikroliter PCR-rør.

Deretter legger du til riktig mengde begrensningsenzymmasterblanding for å resultere i en 40 mikroliter reaksjonsvolum, som inneholder 1 ganger fordøyelsesreaksjonsbuffer og 10 enheter NCO-1HF. Inkuber restriksjonen enzymreaksjonen i en PCR-maskin ved 37 grader Celsius i en time, for optimal fordøyelseseffektivitet. Deretter inaktiverer du restriksjonsenzymet ved å inkubere det 80 grader Celsius i 20 minutter.

Overfør hele begrensningen enzymreaksjonen til et 1,5 milliliter rør. Deretter legger du til 400 mikroliter av 1 ganger T4 DNA ligase buffer og 500 enheter T4 DNA ligase, og bland godt. Stort reaksjonsvolum oppmuntrer intramolekylær ligation av de fordøyde DNA-fragmentene.

Inkuber ligationreaksjonen ved romtemperatur i 2 timer for å sikre fullstendig ligation. Etter 2 timer, Inaktivere T4 DNA ligase på 70 grader Celsius i 20 minutter. Deretter legger du til 10 mikroliter med 10 natrium dodedekylsulfat for å sikre fullstendig inaktivering av T4 ligase.

Tilsett natriumklorid til en endelig konsentrasjon på 100 millimolar, og Dextran til en endelig konsentrasjon på 90 mikrogram per milliliter. Bland ved pulsvirvel, og spinn kort ned reaksjonsblandingen. Deretter legger du til 900 mikroliter på 100 etanol, og blander ved inversjon.

Utfell DNA ved negative 20 grader Celsius over natten. Og pellet det fremskyndede DNA ved sentrifugering ved 14000 ganger G i 15 minutter. Etterpå fjerner du Su-per-na-dine ved aspirasjon.

Vask pelleten med 500 mikroliter på 70 etanol. Og sentrifugering ved 14000 ganger G i 15 minutter. Fjern deretter etanol ved aspirasjon og lufttørk DNA-pelleten ved romtemperatur i 20 minutter.

Oppløs pelleten i 20 mikroliter vann og tilsett 20 mikroliter av begrensende enzym master mix for å resultere i en 40 mikroliter reaksjonsvolum, som inneholder 1 ganger fordøyelsereaksjonsbuffer, 5 enheter BSIHK-1 og 5 enheter av SPH-1HF. Nest, inkuber restriksjonen enzymreaksjonen i en varmeblokk ved 37 grader Celsius, i 1 time. Kort spinne ned reaksjonsblandingen, inkuber restriksjonen enzymreaksjonen i en varmeblokk ved 65 grader Celsius i 1 time.

I denne prosedyren fjerner du potensielle amplicons fra en gjenbrukbar silisiummatteforsegling ved hjelp av en DNA-nedbrytningsløsning. Skyll matten grundig med DNA-fritt vann og luft tørk den ved romtemperatur. Deretter forbereder du en millileter på 1 ganger PCR-blanding som inneholder de ytre forover og omvendte primere med en konsentrasjon på 0,5 mikromos.

Tilsett 170 mikroliter hvis 1 ganger PCR-blandingen til brønnene A-1 og E-1, i en 96-brønns PCR-plate. Deretter legger du til 120 mikroliter av 1 ganger PCR-blanding til brønnene B-1 og H-1. Etterpå legger du til 10 mikroliter av det inverterte DNA-et til brønnene A-1 og E-1.

Bland reaksjonen i hver brønn, ved å forsiktig pipettere hver, ca 10 ganger ved hjelp av en P-1000 satt til 100 mikroliter. Fortynne prøvene fra brønnene A-1 til D-1, i forholdet 1:3 ved å overføre 60 mikroliter på hvert trinn. Bland brønnene i hvert trinn ved å forsiktig pipettere dem ca 10 ganger ved hjelp av en P-1000 satt til 100 mikroliter.

Unngå å danne bobler, gjenta prosedyren for brønn E-1, fortynne ned til godt H-1. Deretter tildeler du 10 mikroliter av reaksjonsblandingen, ved hjelp av flerkanals pipette, fra Wells A-1, H-1, til brønner A-2, H2, A-3, H-3 og så videre, til de når brønnene A-12, H-12 av 96-brønnplaten. Dekk PCR-platen med en tørr silisiummatte, og trykk godt.

Deretter plasserer du platen i en PCR-maskin, og kjører det angitte programmet før du overfører platen til romtemperatur. Etterpå varmer du pinnene på en 96-pinners replikator til varm med en Bunsen-brenner, og deretter avkjøles i minst 5 minutter ved romtemperatur. Fyll brønnene til en annen PCR-plate med 10 mikroliter 1 ganger PCR-blanding, som inneholder en gelbelastningsklar buffer, og den indre forover og bakover ved 0,5 mikromos.

Fjern silikonmatten forsiktig fra PCR-platen på 96-brønnplaten fra første runde PCR, og unngå krysskontaminering mellom brønnene. Bruk den avkjølte replikatoren til å overføre PCR-produktene på 96-brønnplaten, fra første runde PCR, til den nylig tildelte 96-brønnplaten. Utfør den nestede PCR,ved hjelp av tilstanden som angitt.

For å isolere PCR-produktene, analyser dem ved gelelektroforese, ved hjelp av en 96 brønnplate, med 1,3 Agarose gel. For en 100 milliliter Agarose gel, kjør på 200 volt i 10 til 15 minutter. Etterpå forbruker DNA-båndene fra Agarose gelene, ved hjelp av engangsdrikkehaler.

For hvert PCR-produkt, legg halm og Agarose gelplugg i et 1,5 milliliter rør, trim halmen til størrelse med saks. Etterpå kaster du ut Agarose-pluggene inn i hvert rør, ved å klemme på enden av halmfragmentet. Tilsett deretter 300 mikroliter gelekstraksjonsbuffer og 5 mikroliter gelekstraksjonsglassperler til hvert rør.

Trekk ut PCR-produktene per produsentens instruksjoner for gelekstraksjonssettet, og fortynne DNA fra perlene med 30 mikroliter vann. Send inn det rensede DNA-et for Sanger-sekvensering, med den fremre primeren som brukes i den andre runden nestet PCR. Et eksempel Agarose gel elektroforese av vellykket inverse PCR, før og etter PCR produktisolasjon, vises her.

M representerer DNA-markør sistnevnte, hver rad på 12 representerer de tekniske replikere ved en enkelt fortynning på PCR-platen. I dette tilfellet bør enkelt PCR-produkter oppnås ved andre eller tredje 1:3 fortynning av hver prøve. Ved disse fortynningene vil ca. 50% av produktene representere sanne viruscelle-DNA-kryss.

Mens den andre halvparten representerer forsterkning av HBV DNA mellomprodukter. Denne teknikken har gjort det mulig for forskere å utforske HPV DNA-integrasjon i svært kontrollerte in-vitro infeksjonssystemer. Ytterligere metoder, for eksempel biotematikkanalyse, kan brukes til å svare på ytterligere spørsmål.

Hvis HPV DNA-integrering for eksempel forekommer i bestemte områder i det cellulære genomet. Ikke glem at arbeid med infeksjon Hepatitt B-virus, kan være farlige og passende infeksjonskontroller, som bio sikkerhetsskap og tidligere vaksinasjon, bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.