Identifiering av låg exemplar nummer integrerat virus-DNA bildas av In Vitro hepatit B-infektion

Denna metod kan användas för att besvara viktiga frågor i hepatit B virologi, såsom att hitta cellulära eller virologiska faktorer som påverkar HPV DNA-integration. Det finns flera fördelar med denna teknik. Det är relativt billigt, och lätt att utföra, analys av resultaten är enkel, och det är mycket känslig, ner till enstaka kopior.

Även om denna metod kan användas för att ge insikt i HBV-integration, kan den också användas för andra virus som integreras i värdcellsgenomet, såsom HIV, HTLV-1 eller HPV. För att infektera cellerna, utsäde 200, 000 celler per milliliter i en tolv brunnsplatta, med 1 milliliter av D-mem. På nästa dag, använd Heparin kolumn renas su-per-na-din från HEP-AD 38 som inokulat för att infektera cellerna vid 1, 000 VGE per cell, i 500 mikroliter av odlingsmedium.

Sedan, kultur cellerna vid 37 grader Celsius. Sedan, nästa dag, tvätta cellerna två gånger med en milliliter steril en gånger PBS. Sedan, ersätta odlingsmediet var 2 dagar, tills skörd.

Vid dag 3 post infektion, behandla cellerna med 5 micromolar tenofovir disoproxil och 10 micromolar Lamivudine att begränsa produktionen av HBV replikiva mellanprodukter som är förstärka kunna genom invers PCR. Vid dag 5, post infektion, trypsinize vissa celler med 200 mikroliter av Trypsin EDTA och re avbryta dem i 2 milliliter av D-mem som innehåller 5 micromolar Tenofovir disoproxil och 10 micromolar Lamivudine. Därefter överför cellen suspensioner till en sex väl platta, att inducera en runda av mitos.

Vid dag 7 post infektion, trypsinize de expanderade cellerna i 400 mikroliter av Trypsin EDTA och avbryta blandningen i 1 millileter av D-mem. Överför sedan suspensionen i ett 1,5 milliliterrör. Pellet cellerna genom centrifugering vid 500 gånger G, i fem minuter.

Och ta bort Su-per-na-din genom aspiration. Extrahera DNA:t från cellpelleten med hjälp av en DNA-extraktionssats, enligt tillverkarens instruktion. För DNA-inversion, fördela 1,5 till 2,5 mikrogram av det totala DNA-extraktet i ett 200 mikroliter PCR-rör.

Därefter lägger till lämplig mängd restriktionsenzym master mix för att resultera i en 40 mikroliter reaktionsvolym, som innehåller 1 gånger matsmältningsreaktion buffert och 10 enheter NCO-1HF. Inkubera restriktionsenzymreaktionen i en PCR-maskin vid 37 grader Celsius i en timme, för optimal matsmältningseffektivitet. Sedan inaktiverar begränsningsenzymet genom att inkubera det 80 grader Celsius i 20 minuter.

Överför hela restriktionsenzymreaktionen till ett 1,5 milliliterrör. Därefter, tillsätt 400 mikroliter av 1 gånger T4 DNA ligase buffert och 500 enheter av T4 DNA ligase, och blanda noggrant. Stor reaktionsvolym uppmuntrar intramolekylär ligatur av de smälta DNA-fragmenten.

Inkubera ligeringsreaktionen i rumstemperatur i 2 timmar för att säkerställa fullständig ligering. Efter 2 timmar inaktiverar du T4 DNA-ligasen vid 70 grader Celsius i 20 minuter. Lägg sedan till 10 mikroliter av 10 Sodium Dodedecyl Sulfate för att säkerställa fullständig inaktivering av T4-ligasen.

Tillsätt Natriumklorid till en slutlig koncentration på 100 millimolar, och Dextran till en slutlig koncentration av 90 mikrogram per milliliter. Blanda genom pulsvirveling, och snurra kort ner reaktionsmixen. Därefter lägger du till 900 mikroliter av 100 etanol, och blanda genom inversion.

Fäll ut DNA vid negativa 20 grader Celsius över natten. Och pelleten det utfällda DNA genom centrifugering vid 14000 gånger G i 15 minuter. Efteråt, ta bort Su-per-na-dine genom aspiration.

Tvätta pelleten med 500 mikroliter av 70 etanol. Och centrifugeringen vid 14000 gånger G i 15 minuter. Ta sedan bort etanolen genom aspiration och lufttorka DNA-pelleten i rumstemperatur i 20 minuter.

Lös pelleten i 20 mikroliter vatten och tillsätt 20 mikroliter av begränsa enzym master mix för att resultera i en 40 mikroliter reaktionsvolym, som innehåller 1 gånger matsmältningsreaktion buffert, 5 enheter BSIHK-1, och 5 enheter av SPH-1HF. Bo, inkubera restriktionsenzymreaktionen i ett värmeblock vid 37 grader Celsius, i 1 timme. Kort spinn ner reaktionsmixen, inkubera begränsningsenzymreaktionen i ett värmeblock vid 65 grader Celsius i 1 timme.

I detta förfarande, ta bort potentiella amplikoner från en återanvändbar kisel matta tätning, med hjälp av en DNA-nedbrytningslösning. Skölj mattan noggrant med DNA fritt vatten och lufttorka den i rumstemperatur. Därefter förbereda en millileter av 1 gånger PCR mix som innehåller den yttre framåt och omvänd primers vid en koncentration av 0,5 mikromolar.

Lägg till 170 mikroliter om 1 gånger PCR mix till brunnarna A-1 och E-1, i en 96 väl PCR-platta. Sedan, tillsätt 120 mikroliter av de 1 gånger PCR mix till brunnar B-1 och H-1. Efteråt, tillsätt 10 mikroliter av inverterade DNA till brunnarna A-1 och E-1.

Blanda reaktionen i varje brunn, genom att försiktigt pipettera vardera, ca 10 gånger med hjälp av en P-1000 inställd på 100 mikroliter. Seriebespäna proverna från brunnarna A-1 till D-1, vid förhållandet 1:3 genom att överföra 60 mikroliter vid varje steg. Blanda brunnarna vid varje steg genom att försiktigt pipettera dem ca 10 gånger med hjälp av en P-1000 inställd på 100 mikroliter.

Undvik att bilda bubblor, upprepa proceduren för väl E-1, späda ner till väl H-1. Därefter fördela 10 mikroliter av reaktionsblandningen, med hjälp av flerkanalig pipett, från Wells A-1, H-1, i brunnarna A-2, H2, A-3, H-3 och så-on, tills de når brunnarna A-12, H-12 av 96 väl plattan. Täck PCR-plattan med en torr kiselmatta, och tryck ordentligt.

Placera sedan plattan i en PCR-maskin, och kör det program som anges, innan du överför plattan till rumstemperatur. Efteråt, värm stiften på en 96 pin replikator till glödhet med en Bunsen brännare, sedan svalna i minst 5 minuter vid rumstemperatur. Fyll brunnarna i en andra PCR-platta med 10 mikroliter av 1 gånger PCR mix, som innehåller en gel last redo buffert, och den inre framåt och omvänd vid 0,5 mikromolar.

Ta försiktigt bort kiselmattan från PCR-plattan på 96 brunnsplattan från den första rundan PCR, och undvik korskontaminering mellan brunnarna. Använd den kylda replikatorn för att överföra PCR-produkterna av 96 brunnsplattan, från första omgången PCR, till den nyligen tilldelade 96 brunnsplattan. Utför den kapslade PCR, med villkoret som anges.

För att isolera PCR-produkterna, analysera dem genom gelelektrofores, med hjälp av en 96 brunnsplatta, med 1,3 Agarose-gel. För en 100 milliliter Agarose gel, kör på 200 volt i 10 till 15 minuter. Efteråt, punktskatt DNA-banden från Agarose geler, med hjälp av disponibel dricka sugrör.

För varje PCR-produkt, placera sugröret och Agarose gel kontakten i en 1,5 milliliter rör, trimma sugröret till storlek med sax. Efteråt, mata ut Agarose pluggar i varje rör, genom att klämma på slutet av halmfragmentet. Tillsätt sedan 300 mikroliter av gelutsugbuffert, och 5 mikroliter av gelutsug glaspärlor till varje rör.

Extrahera PCR-produkterna per tillverkarens instruktioner för gelextraktionssatsen, och späd DNA:t från pärlorna med 30 mikroliter vatten. Skicka in den renade DNA för Sanger sekvensering, med den främre primer som används i den andra omgången kapslade PCR. Ett exempel Agarose gelelektrofores av lyckad inverse PCR, för och efter PCR-produktisolering, visas här.

M representerar DNA-markören senare, varje rad av 12 representerar de tekniska replikat vid en enda utspädning på PCR-plattan. I detta fall bör enstaka PCR-produkter uppnås genom den andra eller tredje 1:3-utspädningen av varje prov. Vid dessa utspädningar kommer cirka 50% av produkterna representerar sanna viruscell DNA-korsningar.

Medan den andra hälften representerar förstärkning av HBV DNA mellanprodukter. Denna teknik har gjort det möjligt för forskare att utforska HPV DNA-integration i mycket kontrollerade in vitro-infektionssystem. Ytterligare metoder, såsom biotematisk analys, kan användas för att besvara ytterligare frågor.

Till exempel, om HPV DNA-integration sker i specifika regioner i det cellulära genomet. Glöm inte att arbeta med infektion Hepatit B-virus, kan vara farligt och lämpliga infektion kontroller, såsom bio säkerhetsskåp och tidigare vaccination, bör alltid tas när du utför dessa förfarande.