Name: detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

Alman merkezinden finansman enfeksiyon araştırma (DZIF), TTU hepatit projeleri 5.807 ve 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 için alınan bu eser (TP 15) ve HIV ve hepatit Viroloji araştırma Avustralya merkezi.
Biz Profesör William Mason için orijinal invPCR yöntemi geliştirmek ve bize gösteren onun parçası için borçlu bulunmaktadır. Drs. Yi Ni ve Florian A. Lempp kimyasalları (hücre satırları ve HBV inoculum) teşekkür etmek istiyorum. Teknik yardım için Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt ve Dr Katrin Schöneweis kabul edersiniz. Miriam için yazım denetleme Kleinig ve Profesör Nicholas Shackel ve Ralf Bartenschlager sürekli destek için minnettarız.

1. hücre enfeksiyon ve DNA ekstraksiyon
<ol><li>Kültürlü Huh7-NTCP hücreleri8,9 , Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takıma DMEM) korumak. Not: Bu daha önce ayrıntılı40rapor edildi.</li>
	<li>Tohum 2 x 105 hücre/mL Huh7-NTCP hücreleri ile DMEM 1 mL 12-şey plaka.</li>
	<li>Hücre tedavileri (Örneğin, HBV inhibitörleri) sınama olumlu sonuçlanırsa, onları kültür süpernatant 4 h (1 gün önceden HBV enfeksiyonu) tohum sonra uygulanır. Bir negatif kontrol için 200 uygulamak nM Myrcludex B (bir güçlü HBV giriş inhibitörü41).</li>
	<li>Heparin sütunlu saf42 süpernatant HepAD3843 üzerinden bir inoculum 1000 VGE/hücreye kültür ortamının (DMEM % 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin ve % 2.5 v/v ile takıma 500 µL hücreleri enfekte için kullanın DMSO), [1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x içinde çözünmüş] % 4 w/v Polietilen glikol 8000 içeren.</li>
	<li>Hücreleri (%5 CO2 ve % 90 nem ayarla) 37 ° C kuluçka kültür.</li>
	<li>1 mL steril 1 x PBS 16-24 h sonrası enfeksiyon, iki kez hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Kültür ortamı her 2 günde HBV enfeksiyonu hasat kadar takip değiştirin.</li>
	<li>3. gün sonrası enfeksiyon 5 µM Tenofovir disoproxil ve 10 µM hücrelerle tedavi lamivudin invPCR tarafından amplifiable HBV ikileştirici ara ürün imalatı sınırlamak için.</li>
	<li>5. gün sonrası enfeksiyon, tripsin-EDTA 200 µL hücrelerle trypsinize ve onları da 5 µM Tenofovir disoproxil ve 10 µM içeren (% 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takıma) DMEM 2 mL resuspend Lamivudin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar (hangi HBV cccDNA44 ve amplifiable diğer HBV DNA ara ürün kaybı ikna etmek için invPCR tarafından bildirilmiştir) mitoz bir tur ikna etmek için 6-şey plaka aktarın.</li>
	<li>7. gün sonrası enfeksiyon, tripsin-EDTA 400 µL genişletilmiş hücrelerde trypsinize ve karışımı 1 mL DMEM resuspend. Süspansiyon bir 1,5 mL tüp içinde yer, hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de cips ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Kadar DNA ekstraksiyon için hazır hücre granül-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>DNA üreticinin talimatlarına göre bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak hücre Pelet ayıklayın. Optik Dansitometresi kullanarak son DNA toplama tahmin ediyoruz. Not: DNA 100 μL elüsyon birimindeki genellikle ~ 250-400 verimidir ng/μL.</li>
</ol>2. DNA'ın ters çevirme
<ol><li>Aliquot ~1.5–2.5 μg toplam DNA'ın özü adım 1 200 μL PCR tüp içine. Restriksiyon enzimi master-mix 1 x Özet tepki arabellek içeren 40 μL tepki birimini neden uygun miktarda ekleyin (Örn., CutSmart arabellek) ve 10 U Ncoben-HF.</li>
	<li>Tepkiler iyice karıştırın ve bir küçük tüp santrifüje spin aşağı. Restriksiyon enzimi tepki olarak 37 ° C'de bir PCR makinesi en iyi sindirim verimlilik için 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Restriksiyon enzimi 20 dk 80 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>1.5 mL tüp için tüm Restriksiyon enzimi tepki aktarın. 1 x T4 DNA ligaz arabellek ve 500 U T4 DNA ligaz 400 μL ekleyip iyice karıştırın. Büyük tepki birim sindirilir DNA parçalarının içi (aksine arası moleküler) moleküler ligasyonu teşvik eder.</li>
	<li>Tüp ligasyonu tepki tam birleştirmesini sağlamak 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>T4 DNA ligaz 70 ° c 20 dk için devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>% 10 w/v Sodyum Lauryl Sülfat T4 ligaz tam inactivation emin olmak için 10 μL ekleyin.</li>
	<li>Tüpler nabız vortexing tarafından mix ve kısa bir süre tepki karışımı spin. NaCl 100 mM ve dextran (35-45 kDa) son bir konsantrasyon 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Tüpler nabız vortexing tarafından mix ve kısa bir süre tepki karışımı spin.</li>
	<li>INVERSION tarafından 900 μL % 100 etanol ve karışımı ekleyin. -20 ° C'de DNA gecede çökelti.</li>
	<li>Pelet zarlarını DNA tarafından Santrifüjü 14.000 x g 15 dakika süreyle de kaldırmak süpernatant aspirasyon P200 pipet ile tarafından. 14.000 x g 15dk için de % 70 v/v etanol ve Santrifüjü 500 μL ile Pelet yıkayın.</li>
	<li>Etanol aspirasyon P200 pipet ile çıkarın. DNA Pelet, oda sıcaklığında 20 dakika kuruması.</li>
	<li>H2O. Ekle 20 μL bir Restriksiyon enzimi master için Özet tepki arabellek x 1, 5 BSIHKAI U ve 5 Sph-HF. Incubate U içeren bir 40 μL tepki hacmindeki neden mix-20 μL Pelet Restriksiyon enzimi tepki olarak dağıtılması bir ısı-blok 37 ° c ( Sphben-HF için en uygun sıcaklık) 1 h için.</li>
	<li>Kısa bir süre tepki karışımı spin. Restriksiyon enzimi tepki 65 ° c ( BSIHKAI için en uygun sıcaklık) 1 h için bir ısı bloğundaki kuluçkaya.</li>
	<li>Kısa bir süre tepki karışımı spin.</li>
	<li>-20 ° C'de ters DNA sonraki adım kadar saklayın.</li>
</ol>3. iç içe PCR
<ol><li>Potansiyel amplicons bir yeniden kullanılabilir silikon mat mühür bir DNA bozulması çözümünü kullanarak kaldırmak, mat DNA ücretsiz su ile iyice durulayın ve oda sıcaklığında PCR karışımı hazırlarken kuruması.</li>
	<li>1 mL 1 x PCR Mix dış ileri içeren hazırlamak (5'-TTC GCT TCA SKK CTG CAC G-3') ve ters (5'-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3') 0.5 µM bir konsantrasyon, astar.</li>
	<li>1 x PCR Mix 170 μL wells A1 ve E1 bir 96-şey PCR plaka ekleyin.</li>
	<li>1 x PCR karışımı 120 μL wells B1 H1 için ekleyin.</li>
	<li>Ters DNA'ın 10 μL--dan adım 2 A1 ve E1 wells için Ekle (2 farklı ters örnekleri analiz aynı PCR plaka üzerinde). Hamuru hafifçe her biri hakkında 10 kez pipetting tarafından her şey tepki için 100 μL ayarla P1000 kullanılarak.</li>
	<li>Seri olarak seyreltik örnekleri oranı 1:3 her adımda 60 μL aktararak A1 D1 için Kuyu yapımı. Her adımda wells yavaşça onları 10 kat için 100 μL ayarla P1000 kullanma hakkında pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının. Aşağı iyi H1 sulandrarak 3.6 iyi E1 için adımları yineleyin.</li>
	<li>Aliquot 10 μL bir çok kanallı pipet içine kuyu A2-H2, A3-H3, A1-H1 kuyulardan wells A12-H12 96-şey plaka erişene dek filtreler tepki karışımı. PCR plaka ile sıkıca basarak adım 3.1, Kuru silikon mat kapak.</li>
	<li>Plaka PCR makinesinde yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştır: 10 min 95 ° c; 15 35 döngüleri s 95 ° c, 15 s 54 ° C ve 3 dak 72 ° c; 7 dk. 72 ° c; ardından, plaka oda sıcaklığında tutun.</li>
	<li>96-pin Çoğalıcı eliydi Bunsen burner ile için iğne ısı ve oda sıcaklığında en az 5 min için serin.</li>
	<li>İkinci PCR plaka kuyu ile 1 x PCR mix (jel yük hazır arabellek içeren) ve iç ileri 10 μL doldurun (5'-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3') ve ters (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3'), 0,5 µM.</li>
	<li>Dikkatle ilk turda PCR 96-şey plaka PCR tabak silikon mat kaldırmak ve çapraz bulaşma kuyular arasında kaçının.</li>
	<li>Soğutmalı Çoğalıcı 96-şey plaka PCR ürünlerinin ilk turda PCR yeni bölünmemeli 96-şey plakasına aktarmak için kullanın. İlk denatürasyon adım 95 ° C'de 10 dakika için 2 dk değiştirme dışında adım 3,8, olduğu gibi aynı koşullar kullanarak iç içe geçmiş PCR yerine getirir.</li>
</ol>4. PCR ürünü yalıtım ve jel çıkarma
<ol><li>PCR ürünlerinin % 1.3 w/v özel jel ile 96-iyi kullanarak jel elektroforez tarafından analiz. 100 mL özel jel için 200 V 10-15 dk için çalıştırın.</li>
	<li>Tek kullanımlık içme kamış kullanarak özel jelleri DNA grup tüketim. Her PCR ürününün saman yerleştirin ve özel jel 1,5 mL tüp içine takın ve boyuta saman makasla kesme. Not: Sadece tek PCR ürünleri çözülebilir dilutions grup izole etmek yeterlidir.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Tüpler daha sonra çıkarılması için-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Özel prizler her tüpün içine saman parçası ucunda sıkarak dışarı atmak. 300 μL jel ayıklama arabelleği ve jel ayıklama cam boncuk Bulamaç 5 μL her tüp için ekleyin.</li>
	<li>PCR ürünleri (hariç yarım-birimleri adımları yıkama için kullanma) jel ekstraksiyon kiti için üreticinin yönergelerine göre ayıklamak ve boncuk ile su 30 μL DNA'dan elute.</li>
	<li>Saf DNA Sanger için gönderin (üreticinin yönergeleri göre) sıralama ikinci turda kullanılan ileri astar ile iç içe PCR.</li>
</ol>5. dizi analizi
<ol><li>Virüs-hücre DNA kavşak (tüm nükleotid koleksiyonuna hizalama varsayılan ayarları kullanarak) nükleotit patlama analizi gerçekleştirerek onaylayın. Not: Temsilcisi sonuçları Şekil 3 ' te aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.<ol>
<li>Dizinin kısmi hizalama gözlenen yalnızca, trim 5' HBV DNA dizisi bir patlama analiz yeniden çalıştırmadan önce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Belirli bir sıra gerçek entegrasyon kavşak aşağıdaki gibi ifade ediyorsa belirlemek için sıkı seçim ölçütleri uygulayın:<ol>
<li>Sadece içeren dizileri içerir > 20 bp emin eşlemek için hücresel genom hücresel dizisi.</li>
		<li>Kısıtlama siteleri 10 sözde virüs-hücre tümleştirme Kavşağı, onlar büyük olasılıkla temsil vitro ligasyonu olaylar olarak bp yerine içinde gerçek entegrasyon kavşak kullanılan herhangi bir enzim içerir herhangi bir sıraları dikkate almayın.</li>
		<li>Bu büyük olasılıkla eserler sıralama reaksiyonu sırasında çapraz bulaşma tarafından üretilen olarak herhangi bir sıralarıyla bariz birbirine benzemeyen en yüksek floresans seviyeleri sözde tümleştirme Kavşağı'nda sıralama Kromatograflar, her iki tarafında göz ardı veya kapiller Kromatografi.</li>
		<li>Bu tam HBV ve virüs hücreli kavşağında hücresel dizileri ile benzersiz tümleştirme olayları tanımlamak. Not: Benzersiz tümleştirme olaylar tekrarı (ki negatif kontrol reaksiyonlar, daha fazla temsilcisi sonuçlarında detaylı kullanarak test PCR sırasında bu entegrasyonlar ve çapraz bulaşma içeren hücre klonal genişlemesi neden olabilir aşağıda). Homolog olmayan yollar son katılma kullanılan15olarak tekrarlanan entegrasyonlar belirli hücresel dizileri içine her tümleştirme olay için farklı HBV terminal siteleri görüntülemek için bekleniyor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entegrasyon frekans seyreltme faktörü ters DNA şablonları virüs hücreli kavşaklar, normalleştirme tarafından toplam DNA giriş miktarı ters tepki izleyen bu seyreltme algılanan sayısıyla çarparak hesaplar. Genel olarak, entegrasyon sıklığıdır 1:10 sırasına4 hücreleri.</li>
</ol>

S.Ü bir eş başvuran ve Co-Myrcludex B bir HBV/HDV giriş inhibitörü olarak koruma patent mucidi olduğunu. T.T. hiçbir çıkar çatışmaları bildirir.

Protokol gerçekleştirmeden önce bu invPCR tahlil son derece hassas bir teknik, tek DNA şablonu kopyalarını yükseltecek yeteneğine sahip olduğunu unutmamak gerekir. Bu nedenle, PCR ürünleri kirlenme sınırlama son derece önemlidir. PCR ürün kontaminasyon sınırlamak için genel stratejiler aşağıda belirtilmiştir. (i) yöntem farklı adımlar için fiziksel olarak ayrı alanda kurmak. Her alan ayrı laboratuvar mont olmalı ve bu alanları arasında hareket ederken eldiven değiştirilmelidir. Biz bu gibi yerlerde aşağıda sipariş için en büyük olasılıkla az kirlenmiş için listeledik: PCR ürün çıkarma ve sıralamanın tepki kurulum alanı (post-PCR); PCR şablonu ek ve alevli-pin (biz iyi sonuçlar ile decontaminating bir UV lamba PCR davlumbaz kullanmış) alan transfer; DNA ekstraksiyon ve inversiyon alan (pre-PCR); ve bir "DNA ücretsiz şablon" alan yalnızca stok ve PCR çözümleri hazırlamak için kullanılır. (ii) olmak hava akımı çapraz bulaşma potansiyel bir faktörü olarak laboratuarda farkında. Özellikle, çapraz bulaşma PCR reaksiyonların durumda PIN transfer adım sırasında oluşur ve -ecek büyük olasılıkla hatalı miktar tümleştirme frekans için kurşun. PCR davlumbaz bu çapraz akıntılar sınırlandırmak için kullanılabilir. PCR negatif kontrol wells (Örneğin, Myrcludex B tedavi örnekleri veya denetim şablonu yok), çapraz bulaşma için test etmek için de kullanılabilir. (III) potansiyel PCR kirletici pipetler üzerinde limit ve yüzeyler düzenli olarak onları silerek bir DNA bozulması çözüm çalışır.
Burada belirtilen iletişim kuralı HepAD38 hücre satırı42oluşturulan bilinen bulaşıcı HBV klon entegrasyonunu algılamak için ayarlandı. Kullanılan inoculum farklı HBV DNA dizisi (Örneğin, gelen hasta serumu) ise, o zaman HBV genomu ilk PCR astar ve inversiyon tasarım uyumluluğunu onaylamak için sıralı. Önceden yayınlanmış çalışmaları19HBV DNA tümleştirme kavşak beklenen sitenin kanat korunmuş HBV DNA dizileri bind astar 3 set kullanmış. Diğer astar dizileri ve protokolleri HBV44,45,46,47,48 genomik sırasını belirlemek için açıklanan ve başarılı bir şekilde çalışabilir.
Ayrıca, farklı HBV-duyarlı hücreleri (Örneğin, birincil insan tetkikine, farklılaşmış HepaRG, HepG2-NTCP)-ebilmek var olmak kullanılmış; Ancak, Huh7-NTCP hücreleri virüs-hücre sayısı güçlendirilmiş13yaşında virüs ara DNA için karşılaştırıldığında güçlendirilmiş DNA kavşak göz önünde bulundurarak en iyi sinyal-gürültü oranı sağlar bulduk. Özellikle, birincil insan tetkikine veya farklı HepaRG gibi ölümcül farklılaşmış hücreler verimli bir şekilde amplifiable HBV DNA ikileştirici ara ürün hücrelerin içinde kalan yüksek düzeyde sonuçlanan mitoz, tabi olmayan. ~ %90 güçlendirilmiş sıralarının HBV DNA düzenlemeler (ve değil entegrasyon olaylar) ölümcül Ayrıştırılan hücrelerde, hepatoma hücre hatları13' te % 70 – 50'ye göre temsil bulduk. Bu ürünler genellikle yüzey ve çekirdek çerçeveler okuma açık büyük silme işlemlerini içeren HBV DNA genleri vardır veya HBV yarı türler önceden Sphı site için site ek bir Astsubayile temsil edebilir. Amplifikasyon (Şematik diyagramı dahil) bu HBV türlerin açıklanan ayrıntılı olarak daha önce13.
Bu yöntem birçok dezavantajları vardır. Bu iletişim kuralı zahmetli ve çok günlük doğası nedeniyle, invPCR örnekleri, çok sayıda yüksek üretilen iş analizleri için uygun değildir. Ayrıca, seyreltme titrasyon sınırlama dayanıyor gibi bizim Yöntem miktar içinde son derece kesin değildir; Her ne kadar kolayca tümleştirme frekans günlük düzeyi değişiklikleri ölçmek gerekir,.
Ayrıca, bizim inversiyon Protokolü sadece HBV entegrasyonlar çoğunluğu içinde bu bölge49oluşurken HBV genomu DR2 ve DR1 bölge arasında meydana gelen entegrasyonlar algılamak için uygundur. NGS analiz HBV hasta dokuların büyük bir azınlık bu göstermiştir (~ 50 %'e kadar) bu bölge49dışında da oluşabilir. Yeni invPCR tasarımlar bunlar diğer tümleştirme siteleri algılamaya teorik olarak mümkün olsa da onlar değil (bizim bilgi için) olmuştur henüz yürütülmektedir. Relatedly, aşağı ters tepki için virüs hücreli kavşak serisinden gerekli gerekli Restriksiyon enzimi siteler nedeniyle invPCR HBV genomu DR2 ve DR1 bölgeler içinde meydana gelen bütün entegrasyonlar algılamaz (Yani, biz Bütün entegrasyonlar ~ %10 silico simülasyonlar13kullanarak algılanabilir olduğu tahmin). Ancak, farklı tedaviler az sayıda örnekleriyle odaklı bir dizi uygulandığında, invPCR entegre HBV DNA tek baz çifti çözünürlükte algılamak için sadece pratik yöntemleri biridir.
Biz bu nedenle uygulamaları cep (nakavt veya belirli hücresel genlerin overexpression, ya da üzerinden uygulama çeşitli ilaçların) ve çevre ( (mutasyonlar HBV inoculum), viral bulma konusunda önemli bir rol hizmet veren bu yöntemin öngörülüyor Örneğin, oksidatif stres maruz) HBV DNA entegrasyonu teşvik faktörler. Böylece iyi izole ve daha iyi karakterize olabilir bu yöntemi ve yeni geliştirilen HBV enfeksiyonu sistemleri ile bu faktörlerin benzersiz kontrol sağlar. Biz de bu HBV DNA tümleştirme, ne ölçüde viral antijenler (Örneğin, HBx veya HBsAg50) ne bu ifade denetleyen tümleşik formdan ifade edilir için de dahil olmak üzere hücresel sonuçlarını temel bir anlayış sağlayacaktır bekliyoruz, ve olup olmadığı HBV entegrasyon önemli ölçüde daha pro oncogenic bir duruma doğru hücresel fenotip değiştirir. Bu gelecekteki çalışmaların sonuçları kronik hepatit B tedavisinde kullanılan tedavi stratejileri ve virüs kendisi temel anlayış derin bir etkiye sahip olacaktır.

HBV yaşam boyu süren kronik enfeksiyon neden olabilir bir çift iplikçikli DNA virüs karaciğer siroz ve hepatosellüler karsinom (HCC)1,2,3' e en önemli biri. Orada iken sürüş HBV sebat4 (Örneğin, epigenetik viral transkripsiyon şablonunun yüksek kararlılık), kaçırma immün gözetim ve düşük ciro hepatosit karaciğer ve onun ilişkili birden çok moleküler mekanizmaları risk HCC başlatma5,6 (Örneğin, kronik inflamasyon ve hücresel yolları stres aktivasyonu), konak hücre genomu (her ikisi de bu olgu için bildirilen bir mekanizma) entegrasyon HBV DNA kötü çalışılmıştır . HBV tümleştirme olayların güvenilir algılama izin uygun vitro enfeksiyon sistemlerde eksikliği önemli bir nedendir. Burada, biz son zamanlarda geliştirilen iletişim kuralı vitro üretimi ve temel moleküler mekanizmaları ve bunların sonuçları aydınlatmak için kullanılan HBV DNA entegrasyonlar tespiti için açıklamak.
HBV çoğaltma ve HBV DNA tümleştirme oluşumu önceden gözden ayrıntı7' de. Kısaca, HBV enfeksiyonu8,9için ana hücresel reseptör sodyum Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) kullanarak tetkikine girer. HBV rahat dairesel DNA (rcDNA) içeren HBV nucleocapsids genom çekirdeği, rcDNA episomal kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA) nerede dönüştürülür girer. Nükleer cccDNA viral mRNA'ların ve önceden genomik RNA (pgRNA)10için transkripsiyon şablon gibi davranır. HBV polimeraz ve pgRNA yeni kurulan nucleocapsids (HBV çekirdek protein dimer oluşan) hazırlanmıştır. HBV pgRNA ters bir rcDNA genom ya da bir çift iplikçikli lineer DNA (dslDNA) genom11,12kaynaklanan nükleokapsid içinde transkripsiyonu var. HBV DNA genleri içeren bu olgun nucleocapsids sonunda saran ve virions verilebilir.
Hepatositlerin saran parçacıklar dslDNA molekülleri içeren tarafından enfeksiyon viral entegrasyon HBV DNA7,14,15çoğaltma-beceriksiz formlar için önde gelen ana hücre genomu13, içine neden olabilir. HBV DNA ile tümleştirme kromozom çift iplikçikli DNA sonları15sitesinde oluşur. Kanıt biriken her tümleştirme olayı konak hücre genomu16,17içinde temelde rasgele bir pozisyonda oluşur öneriyor. Buna ek olarak, HBV DNA ile tümleştirme, biraz oluşur nadiren, 1-104 hücreleri13,18,19,20oranında. HBV DNA entegrasyonu ile ilgili önemli sorular cevapsız, özellikle tam moleküler yollar dahil, viral bağımlılığını ve ana faktörler, entegre formları ve olası katkılarından ifade viral antijenler ile ilgili olarak kalır viral sebat7' ye. Biz bu sorulardan bazıları ışık tutacak bir vitro modelini belirledik.
HBV DNA tümleştirme olaylarda (entegrasyon oranı hücre başına ve her benzersiz tümleştirme kopya sayısı açısından hem de) vitro HBV enfeksiyonu nadir yapmak onları tespit etmek zor modelleri. Sayesinde bunun bölünen hücreler verimli enfeksiyon desteklemeyen gibi hücre mitoz vitro sistemimizde sınırlıdır. Böylece, aksine tetkikine önemli klonal genişleme18,19,oluştuğu hastanın karaciğer dokularda20, kaç (1-2) kopya her entegrasyon hücreleri belirli bir havuzda mevcuttur çok vitro enfekte . Entegrasyon özellikle sırasında ilk enfeksiyon tetkikine (ve değil sürekli kronik olarak enfekte tetkikine)13oluşur de bulduk. Buna göre HBV DNA tümleştirme için daha uzun bir süre sadece hücre kültür tarafından yükseltilemez.
Genel olarak, daha önce Güney de dahil olmak üzere entegre HBV DNA algılamak için kullanılan bir yöntem blot hibridizasyon21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kaset-aracılı ligasyonu PCR28ve29,30,31,32,33, sıralama tüm genom algılamak için duyarlılık zorunda değilsiniz tek-entegrasyonlar kopyaları. Biz ve diğer araştırmacılar kullanmış ters iç içe ördek, dağ sıçanı ve insan enfekte karaciğerleri13,14,18,19, hepadnaviral DNA tümleştirme algılamak için PCR (invPCR) 34,35,36. Diğerleri invPCR teknik yanlış sinyalleri nesil alter ve miktar37için iznini kısıtlamak yordam değişiklikler girmiştik. Tahlil bu protokol için açıklandığı gibi yapılır, invPCR tanımlar ve (mutlak kopya numaraları) birden fazla HBV DNA entegrasyonlar quantifies özel ve hassas tahlil temsil eder. HBV-hücre DNA kavşak viral çalışmaların bioinformatical sağlayan bir tek-baz çifti çözünürlükte sıralı ve entegrasyon13siteler ana bilgisayar DNA dizileri.
Biz daha önce çok sayıda karaciğer doku ek donmuş, karaciğer bölümleri parafin gömülü ve son derece küçük doku örnekleri tarafından izole kaynaktan çıkarılan HBV DNA enfekte dokular invPCR sonuçlarından38 tarif var Lazer-mikrodiseksiyon19. Bu iletişim kuralı bir invPCR tahlil hücre kültürü elde edilen dokulardan Entegrasyonlar (entegrasyon başına 1-2 kopya) sayıda düşük kopya oluşturulduğu vitro enfeksiyon sonra çıkarılan DNA'yı kullanarak güncelleştirilmiş bir sürümünü özetliyor. HBV DNA oluşan entegrasyonlar vitro bu hücresel genom ve entegre13,16, viral dizisi içinde kavşak üzerinde kendi dağıtım ile ilgili hasta dokularda bulunan benzer düşündüren bir içinde virüslü bir karaciğer için karşılaştırılabilir yol.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td>Heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1&#215;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td>Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO for spectroscopy</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenofovir disoproxil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS021622</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamivudine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1295</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>433209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (35 -45 kDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1662-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32205-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiHKAI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0570L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitaq Gold Taq kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331816</td>
			<td>Use for first nest PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>2239442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS6509 SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin replicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi PCR kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8295</td>
			<td>Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biozym LE Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of low copy number integrated viral dna formed by in vitro hepatitis b infection

Hepatit B virüsü (HBV) karaciğer kanseri ve karaciğer sirozu kronik enfeksiyon sonucu neden ortak bir kan kaynaklı patojen var. Virüs genellikle bir episomal DNA ara çoğaltır; Bu formu viral çoğaltma için gerekli olmadığı halde ancak, ana bilgisayar genom HBV DNA parçalarının entegrasyonu gözlenmiştir. Tam olarak amacı, zamanlaması ve hangi HBV DNA tarafından tümleştirme oluşur mechanism(s) olduğunu henüz net ama son veri değil göstermek çok erken enfeksiyon sonra oluşur. Burada, vitro üretimi ve HBV DNA entegrasyonlar tespiti ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bizim iletişim kuralı özellikle tek bol-in virüs-hücre DNA entegrasyonlar güçlendirir ve mutlak miktar ve kavşak sıra tek-baz çifti çözümü sağlar. Bu teknik (birincil insan tetkikine de dahil olmak üzere), çeşitli HBV-duyarlı hücre tipleri için çeşitli HBV mutantlar için ve çeşitli uyuşturucu Etkilenmeler ile birlikte uygulanmıştır. Biz bu klinik olgusunun temel moleküler mekanizmaları belirlemek için anahtar bir tahlil olma Bu teknik öngörüyoruz.

İnvPCR tekniği şematik gösterimi Şekil 1' de gösterilen. Bir örnek özel jel elektroforez başarılı bir invPCR, öncesi ve sonrası PCR ürünü yalıtım Şekil 2 ' de gösterilmiştir. Şekil 3 adım HBV DNA ikileştirici orta 5.1 (i) virüs-hücre DNA kavşak amplifikasyon ve (ii) amplifikasyon vakalarında patlama analiz çıktısını gösterir.
Beklenen olumlu denetimlerinden Sonuç: Huh7-NTCP hücreleri (Şekil 1) açıklandığı gibi heparin saf HBV stokları ile enfekte olumlu bir denetim olarak hizmet verebilir. Bu durumda, tek PCR ürünleri (~ 104 hücre eşdeğerlerine seyreltme, Şekil 2başına karşılık gelen) her örneğinin ikinci veya üçüncü 1:3 seyreltme tarafından elde edilmelidir. Diğer yarısı HBV DNA ara ürün (Şekil 3) amplifikasyon temsil ederken bu dilutions gerçek virüs-hücre DNA kavşaklar, ürünlerin yaklaşık % 50 temsil edecek.
Önceki çalışmalar13' te, biz birkaç tekrarlanan virüs-hücre kavşaklar, tercihli HBV DNA entegrasyon hücresel hiç genomik site önerme örneklerini bulduk. Biz de >%80-in virüs-hücre kavşak nukleotid ve 1732 (göre nükleotit HBV genotip D, GenBank katılım #U95551.1 numaralandırma), 1832 arasında burada ikinci HBV dslDNA formunun sağ terminus gösterir gerçekleşmemesini bulmak. Bizim yöntemle vitro deneyler bulundu gerçek virüs-hücre kavşak dizisi genel olarak GenBank (katılım sayıları MH057851 MH058006 için) kullanılabilir.
Beklenen negatif denetimlerinden Sonuç: bulaşmamış Huh7-NTCP hücreleri ya da Huh7-NTCP aşı Myrcludex B ile önceden tedavi hücre negatif denetimler olarak hareket edebilir. InvPCR çıkarılan bu hücrelerden DNA analizini PCR ürün üretmek gerekir. Bu negatif kontrol örnekleri aynı PCR plaka olumlu örnekler olarak çalışan iç içe-PCR işlemi sırasında çapraz bulaşma test etmek için izin verir. En sıkı çapraz bulaşma için çalışan bir negatif-denetimi örneğini Wells A-D ve Wells E-H bir 96-şey plaka üzerinde olumlu örnek testidir. Bu durumda, olumlu örnek en yoğun seyreltme üst üste olumsuz örnek az konsantre seyreltme için bitişik çalıştırılır. Amplifikasyon ürünleri negatif kontrol örnekleri gözlenir, çapraz bulaşma olaylar en aza indirmek için tartışmada önerilen önlemler Enstitüsü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg"> Şekil 1: HBV DNA entegrasyonlar algılamaya invPCR işleminin şematik şekil. HBV enfeksiyonu, sadece bir azınlık Huh7 NTCP hücre içeren sonra konak hücre genomu (kırmızı) entegre HBV dslDNA (kırmızı), üst kısmında tasvir. Toplam DNA sonra çıkarılan hücrelerden (adım 1), (adım 2) ters ve iç içe geçmiş PCR (adım 3) tarafından güçlendirilmiş. Restriksiyon enzimi sitelerin göreli konumları gösterilmiştir (Astsubayben ve BSIHKAI) eksize virüs-hücre DNA Junction. Bir önceki yayın13adapte bir rakamdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg"> Şekil 2: özel Jel Elektroforez ve sonraki jel çıkarma başarılı bir invPCR. "M" DNA işaretleyicisi merdiven temsil eder. Her satır 12 Teknik çoğaltır, PCR plaka üzerinde tek bir seyreltme temsil eder. PCR plaka/özel jel iki ters DNA örneği çalıştırabilirsiniz. PCR ürünleri her seyreltme için dışarı bir ~ 1 titre: 3 oranı. HBV DNA tümleştirme oranı son nokta titrasyon tarafından belirlenen ürün çıkarma nereye tek bantları-ebilmek var olmak kolayca izole iki az konsantre dilutions genellikle yeterlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg"> Şekil 3: invPCR ürün serileri analizini patlama. Sıra uzun yolları sıralama, kaynağı Sanger oluşturulan DNA dizileri genellikle kesin. HBV ve hücresel genleri güçlü hizalama Sanger oluşturulan FASTA sıra dosyasının farklı alanlarda gözlenen bir gerçek virüs-hücre DNA kavşak düşündüren üst paneldeki sıralama. Alt panelinde yeniden düzenlenmiştir HBV DNA genom amplifikasyon tarafından üretilen bir ürün düşündüren HBV genomu parçaları için yalnızca sıra hizalar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection at JoVE.com

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Biz burada HBV DNA vitro nesil bir Hepatit B virüs enfeksiyonu sistemi üzerinden tarif ve tersini kullanarak (1-2 kopya) entegrasyonu son derece hassas tespiti PCR iç içe.

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Bu yöntem, HPV DNA entegrasyonunu etkileyen hücresel veya virolojik faktörlerin bulunması gibi Hepatit B virolojisinde anahtar soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin birden çok avantajı vardır. Nispeten ucuz ve gerçekleştirmek kolay, sonuçların analizi basit, ve çok hassas, aşağı tek kopya.Bu yöntem HBV entegrasyonu hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, hiv, HTLV-1 veya HPV gibi konak hücre genomuna entegre olan diğer virüsler için de kullanılabilir. Hücreleri enfekte etmek için, tohum 200,000 mililitre başına mililitre başına on iki kuyu plaka, D-mem 1 mililitre ile. Ertesi gün, HEparin sütunu, 500 mikrolitre kültür ortamında hücre başına 1,000 VGE'deki hücrelere bulaşmasını inokülant olarak HEP-AD 38'den saflaştırılmış su-per-na-din kullanın.Sonra, 37 santigrat derecedeki hücreleri kültüre. Sonra, ertesi gün, steril bir mililitre ile iki kez hücreleri yıkayın bir kez PBS. Daha sonra, hasat kadar, her 2 günde bir kültür ortamı değiştirin.Gün 3 sonrası enfeksiyon, hücreleri tedavi 5 mikromolar tenofovir disoproxil ve 10 mikromolar Lamivudine ters PCR ile yükseltmek mümkün HBV çoğaltıcı ara üretimini sınırlamak için. Gün 5, post enfeksiyon, Tripsin EDTA 200 mikrolitre ile bazı hücreleri trypsinize ve 5 mikromolar Tenofovir disoproxil ve 10 mikromolar Lamivudin içeren D-mem 2 mililitre onları askıya. Daha sonra, mitoz bir tur neden olmak için, altı iyi plaka hücre süspansiyonlar aktarın.7. gün enfeksiyon sonrası, 400 mikrolitre Trypsin EDTA'da genişletilmiş hücreleri deneyin ve karışımı 1 milileter D-mem'de askıya alın. Daha sonra süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 500 kez G santrifüj ile hücreleri pelet, beş dakika.Ve aspirasyon ile Su-per-na-din kaldırın. Üreticinin talimatına göre, dna çıkarma kiti kullanarak hücre peletinden DNA ayıklayın. DNA inversiyon için, 200 mikrolitrelik BIR PCR tüpüne toplam DNA ekstresinin 1,5 ila 2,5 mikrogramını ayırın.Daha sonra, 1 kez sindirim reaksiyonu tamponu ve 10 birim NCO-1HF içeren 40 mikrolitre reaksiyon hacmine neden olmak için uygun miktarda restriksiyon enzimi ana karışımı ekleyin. Optimum sindirim verimliliği için 37 santigrat derecede bir PCR makinesinde restriksiyon enzim reaksiyonu inkübül. Daha sonra, 20 dakika boyunca 80 santigrat derece kuluçka ya da restriksiyon enzimini inaktive edin.Tüm restriksiyon enzim reaksiyonu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, 1 kez T4 DNA ligaz tampon ve T4 DNA ligaz 500 birimleri 400 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın. Büyük reaksiyon hacmi sindirilmiş DNA parçalarının intramoleküler ligasyonteşvik eder.Tam ligasyon sağlamak için 2 saat oda sıcaklığında ligasyon reaksiyonu kuluçka. 2 saat sonra, T4 DNA ligazını 70 derecede 20 dakika süreyle inaktive edin. Daha sonra, T4 ligase tam inaktivasyonu sağlamak için 10 Sodyum Dodedecyl Sülfat 10 mikrolitre ekleyin.Sodyum Klorür'ü 100 milimolar son konsantrasyonuna ve Dextran'ı mililitre başına 90 mikrogramlık son konsantrasyona ekleyin. Darbe girdap tarafından karıştırın ve kısaca reaksiyon karışımı aşağı spin. Sonra, 100 etanol 900 mikrolitre ekleyin ve inversion tarafından karıştırın.DNA'yı bir gecede negatif 20 derecede çökeltin. Ve 15 dakika boyunca 14000 kez G'de santrifüj ile çökelmiş DNA'yı pelet. Daha sonra, aspirasyon ile Su-per-na-dine kaldırın.Peleti 500 mikrolitre 70 etanolile yıkayın. Ve 15 dakika için 14000 kez G santrifüj. Daha sonra, aspirasyon ile Etanol çıkarın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında DNA pelet hava kuru.Peleti 20 mikrolitre suda çözün ve 1 kez sindirim reaksiyonu tamponu, 5 ünite BSIHK-1 ve 5 ünite SPH-1HF içeren 40 mikrolitrelik reaksiyon hacmine yol açacak şekilde 20 mikrolitre kısıtlayıcı enzim ana karışımı ekleyin. Yuva, 37 santigrat derecede bir ısı bloğunda restriksiyon enzim reaksiyonu kuluçka, 1 saat. Kısaca reaksiyon karışımı aşağı spin, 1 saat boyunca 65 santigrat derece bir ısı bloğu nda kısıtlama enzim reaksiyonu kuluçka.Bu işlemde, DNA bozunma çözeltisi kullanarak yeniden kullanılabilir silikon paspas contasından potansiyel amlikonları çıkarın. Paspası DNA'sız su yla iyice durulayın ve oda sıcaklığında kurulayın. Daha sonra, 0,5 mikromolar konsantrasyonda dış ileri ve ters astariçeren 1 kez PCR karışımı bir milileter hazırlayın.96 iyi PCR plakalı wells A-1 ve E-1'e 1 kez PCR karışımı varsa 170 mikrolitre ekleyin. Daha sonra B-1 ve H-1 kuyularına 1 kez PCR karışımının 120 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra, A-1 ve E-1 kuyularına ters DNA'dan 10 mikrolitre ekleyin.Her kuyudaki reaksiyonu, her bir kuyuda, 100 mikrolitreye kadar bir P-1000 seti kullanarak yaklaşık 10 kez borulama yaparak karıştırın. Her adımda 60 mikrolitre aktararak 1:3 oranında, A-1'den D-1'e kadar olan kuyulardan alınan numuneleri seri olarak seyreltin. 100 mikrolitreye ayarlanmış bir P-1000'i kullanarak her adımda kuyuları yaklaşık 10 kez borulandırarak karıştırın.Kabarcıklar şekillendirme kaçının, iyi E-1 için prosedürü tekrarlayın, iyi H-1 aşağı seyreltme. Daha sonra, wells A-1, H-1, wells A-2, H2, A-3, H-3 ve benzeri içine çok kanallı pipet kullanarak reaksiyon karışımı 10 mikrolitre ayırın, kuyua ulaşana kadar A-12, H-12 96 kuyu plaka. PCR plakasını kuru silikon paspasile kaplayın ve sıkıca bastırın.Daha sonra, plakayı bir PCR makinesine yerleştirin ve plakayı oda sıcaklığına aktarmadan önce belirtilen programı çalıştırın. Daha sonra, bir Bunsen brülör ile kırmızı-sıcak bir 96 pin çoğaltıcı pimleri ısı, sonra oda sıcaklığında en az 5 dakika serin. İkinci bir PCR plakasının kuyularını 1 kat PCR karışımının 10 mikrolitresi ile doldurun, jel yük hazır tampon içeren, ve 0,5 mikromolar iç ileri ve geri.İlk yuvarlak PCR'den 96 kuyu plakasının PCR plakasından silikon paspası dikkatlice çıkarın ve kuyular arasında çapraz kontaminasyonu önleyin. İlk tur PCR'den yeni ayrılan 96 kuyu plakasına 96 kuyu plakasının PCR ürünlerini aktarmak için soğutulmuş çoğaltıcıyı kullanın. Belirtildiği gibi koşulu kullanarak iç içe pcr gerçekleştirin.PCR ürünleri izole etmek için, jel elektroforez ile analiz, bir kullanarak 96 iyi plaka, ile 1.3 Agarose jel. 100 mililitrelik Agarose jel için, 10 ila 15 dakika 200 volt çalıştırın. Daha sonra, tek kullanımlık içme pipetleri kullanarak Agarose jellerinden DNA bantlarını çıkarın.Her PCR ürünü için, saman ve Agarose jel fişini 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin, samanları makasla boyuta küçültün. Daha sonra, saman parçasının ucunda sıkıştırarak, her tüp içine Agarose fişleri çıkarmak. Sonra jel ekstraksiyon tampon 300 mikrolitre ekleyin ve her tüp jel ekstraksiyon cam boncuk 5 mikrolitre.Jel ekstraksiyon kiti için üreticinin talimatları başına PCR ürünleri ayıklayın ve su 30 mikrolitre ile boncuk DNA seyreltmek. Sanger dizilimi için saflaştırılmış DNA'yı gönderin, ikinci turda iç içe pcr'de kullanılan ileri astarı ile. Başarılı ters PCR'nin Agarose jel elektroforezi, PCR ürün izolasyonundan önce ve sonra burada gösterilmiştir.M DNA işaretçisi ikinci temsil eder, 12 her satır PCR plaka üzerinde tek bir seyreltme teknik çoğalır temsil eder. Bu durumda, tek PCR ürünleri her numunenin ikinci veya üçüncü 1:3 seyreltilmesi ile elde edilmelidir. Bu seyreltmelerde, ürünlerin yaklaşık %50'si gerçek virüs hücresi DNA bağlantılarını temsil edecektir.Diğer yarısı HBV DNA ara larının amplifikasyon temsil ederken. Bu teknik, araştırmacıların yüksek kontrollü in-vitro enfeksiyon sistemlerinde HPV DNA entegrasyonunu keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Diğer soruları yanıtlamak için biyotematik analizi gibi ek yöntemler kullanılabilir.Örneğin, HPV DNA entegrasyonu hücresel genomun belirli bölgelerinde gerçekleşirse. Enfeksiyon Hepatit B virüsü ile çalışan, tehlikeli olabilir ve uygun enfeksiyon kontrolleri olabilir unutmayın, biyo güvenlik dolapları ve ön aşılama gibi, her zaman bu prosedürü gerçekleştirirken alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...