Name: preparing a 68ga-labeled arginine glycine aspartate (rgd)-peptide for angiogenesis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate RGD-peptide for Angiogenesis at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una ricerca nucleare e programma di sviluppo della National Research Foundation di Corea (NRF) sovvenzione finanziata dal governo coreano (n. 2017M2A2A6A02019904).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di ricerca animali sotto protocolli approvati dalla Korea Institute di radiologica e Comitato di studi degli animali scienze mediche. Tutti i reagenti e solventi sono stati acquistati e utilizzati senza ulteriore purificazione. NOTA-RGD-peptidi sono stati redatti secondo letteratura metodi15.
Attenzione: 68Ga emette raggi gamma e positroni. Tutti gli ...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+&#945;v&#946;3+integrin+directed+therapeutics.">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as &#945;v&#946;3 integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).</li><li>Garanger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+multifunctional+molecular+conjugate+vector+for+targeting,+imaging,+and+therapy+of+tumors.">New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors.</a> Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).</li><li>Dijkgraaf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+&#945;v&#946;3+integrin+expression+in+tumours+with+68Ga-labelled+mono-,+di-+and+tetrameric+RGD+peptides.">PET imaging of &#945;v&#946;3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=68Ga-labeled+cyclic+RGD+dimers+with+Gly3and+PEG4linkers:+Promising+agents+for+tumor+integrin+&#945;v&#946;3+PET+imaging.">68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin &#945;v&#946;3 PET imaging.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).</li><li>Li, Z. 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Nello studio presente, abbiamo introdotto un protocollo per preparare un radiopeptide αvβ3 integrina e sua valutazione biologica di targeting. Lo sviluppo di farmaci tradizionali comporta una procedura complicata. Richiede una grande quantità di materiale di riferimento e una durata relativamente lunga. Anche se la metodologia suggerita non può sostituire il processo di valutazione delicato, questo sistema può essere utilizzato ai fini dello screening. Questa proposta di sistema ridurrebbe cons...

L'angiogenesi è un processo biologico che è caratterizzato dallo sviluppo di nuovi vasi sanguigni. Tra i molti fattori angiogenetici, αvβ3 integrina è associato con l'invasività, perché l'integrina è altamente espresso nei vasi sanguigni del tumore angiogenica ma è assente nel tessuto normale1.
Peptidi radioattivi di grippaggio del ricevitore con il dominio di aspartato (RGD) arginina glicina, che ha un'alta affinità nei confronti dei recettori con integrina αv3 β, sono considerati promettente angiogenesi imaging agenti2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. diversi radiofarmaci sono stati creati per PET e sue proprietà biologiche sono state convalidate in vari modelli animali8,9,10,11. In termini di un radionuclide, 68Ga presenta parecchi vantaggi sopra altri radioisotopi. In primo luogo, ha un'elevata accessibilità per gli utenti ed è economicamente vantaggioso perché non è necessario un ciclotrone. In secondo luogo, 68Ga-based radiofarmaci producono alta risoluzione spaziale rispetto con tomografia computata dell'emissione del singolo-fotone (SPECT), consentendo più accurata quantificazione. Infine, l'emivita di 67,71 minuti di 68Ga può essere sufficiente per la preparazione di piccoli peptidi o proteine.
Per produrre un complesso stabile con 68Ga, sono stati sviluppati molti chelanti. Chelatori rappresentativi sono l'acido 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (TETA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-bioconjugate (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic acido (DTPA) e N, n' '-di(2-hydroxybenzyl) etilendiammina-N, n' '-diacetic acido (O3333). NOTA è stato segnalato per formare un complesso altamente stabile con 68Ga (registro stabilità costante 30.98)12,13,14.
Lo scopo del presente studio è quello di fornire un protocollo conciso per lo sviluppo di un nuovo radiopeptide (Figura 1). Ad esempio, prepariamo 68Ga-labeled RGD-peptidi e metodi attuali per la valutazione biologica di questi analoghi in un modello dello xenotrapianto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:231px;">68Ga/68Ge generator</td>
			<td style="width:187px;">ITG Company</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:239px;">10 mCi&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hydrogen chloride solution</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>84429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">C18 reverse-phase cartridge</td>
			<td style="width:187px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT020515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">0.22-&#956;m sterile filter</td>
			<td style="width:187px;">Milllipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Radio-TLC scanner</td>
			<td style="width:187px;">Bioscan</td>
			<td style="width:119px;">AR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">ITLC paper</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">SGI001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Citric acid</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">HPLC</td>
			<td style="width:187px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:239px;">Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi)</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">C-18 colunm</td>
			<td style="width:187px;">Develosil</td>
			<td style="width:119px;">HG31546150W</td>
			<td>ODS-HG-5, 150 &#8569; 4.6 mm, 5&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">14-650-359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle media&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">T175 flasks&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td>CLS431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">15240112</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">&#947;-counter</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:239px;">1480 Wizard 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Insunlin syringe</td>
			<td style="width:187px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">326105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Synringe pump</td>
			<td style="width:187px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">micro-PET/CT</td>
			<td style="width:187px;">Siemens Inveon</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing a 68ga-labeled arginine glycine aspartate (rgd)-peptide for angiogenesis

L'integrina di3 α βvè una molecola di adesione heterodimeric coinvolti nell'angiogenesi e migrazione delle cellule tumorali. L'integrina è overexpressed in cellule endoteliali angiogenici tumorali, dove in genere ha una bassa concentrazione. Questa espressione specifica di αvβ3 lo rende un valido biomarcatore per antiangiogenico e imaging droga. Come una modalità di imaging funzionale, tomografia a emissione di positroni (PET) fornisce informazioni su biochimici e fisiologici cambiano in vivo, dovuto la relativa sensibilità alta unico alla scala nanomolari. Quindi, basati su radiometal radiofarmaci PET hanno ricevuto grande attenzione per la quantificazione non invasiva dell'angiogenesi del tumore. Questo documento fornisce un protocollo sistemico per preparare un nuovo peptide radiometal-etichettati per la valutazione dell'angiogenesi. Questo protocollo contiene informazioni sull'affidabilità radiochimica, liposolubilità, uptake cellulare, stabilità del siero e proprietà farmacocinetiche. Il 68Ga-RGD-peptide è uno dei ligandi PET rappresentante verso αvβ3 integrina. Qui, presentiamo un protocollo per preparare un 68Ga-RGD-peptide e la valutazione della sua efficacia biologica.

La chelazione di 68GaCl3 con NOTA-RGD-peptide è stato semplice, e la resa radiolabeling era 99%. Impurità di reazione sono stati rimossi con successo come mostrato nella Figura 2. La purezza radiochimica di 68Ga-RGD-peptide era supera al 99%, e specifiche attività alla fine della sintesi era 90-130 MBq/nmol (Figura 3).
L'uptake cellul...

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Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate RGD-peptide for Angiogenesis

L'integrina di3 α βvè un tipo di proteina di adesione che è altamente espresso sulle cellule endoteliali attivate che subiscono l'angiogenesi. Quindi, valutando l'integrità dell'integrina è di grande interesse in oncologia. Qui, presentiamo un metodo per preparare 68Ga-etichetta radiopeptides e un metodo per valutarne l'efficacia biologica.

Preparare un 68Ga-etichettato arginina glicina aspartato (RGD)-peptide per l'angiogenesi

The &#945;v&#946;3 integrin is a heterodimeric adhesion molecule involved in tumor cell migration and angiogenesis. The integrin is overexpressed in ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella preparazione del Gallio 68 etichettato RGD-Peptide e il metodo per la valutazione biologica dei suoi analoghi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un semplice protocollo sistemico per lo sviluppo di un nuovo peptide con etichetta radiometale. A dimostrare la procedura sarà Ki-Hye Jung, un post-doc del nostro istituto.Iniziare utilizzando acido cloridrico molare 0,5 per elusare il tricloruro di gallio radioetichettato da un generatore di germanio di gallio radioetichettato. Eliminare il composto in cinque flaconcino di reazione millilitro con gas azoto a 80 gradi Celsius. Seguito dall'aggiunta di 100 microgrammi di acetato di glicina arginina o peptide RGD in un acetato di sodio molare al composto essiccato.Riscaldare la miscela di reazione a 80 gradi Celsius per cinque minuti prima di lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente. Per purificare il prodotto grezzo con cromatografia liquida ad alte prestazioni, aggiungere la soluzione a una colonna C18 e passare la soluzione attraverso una cartuccia a fasi inversa C18. Lavare la cartuccia con due millilitri di soluzione salina ed elutare il peptide radioetichettato con 0,7 millilitri di etanolo 95%, seguito dalla rimozione del solvente a 80 gradi Celsius sotto gas azoto per 20 minuti.Ricostituire il peptide purificato in PBS e filtrare il prodotto radioetichettato attraverso un colino sterile sterile sterile da 0,22 micron. Formulare il peptide in un millilitro di soluzione salina sterile e individuare un microlitro di soluzione peptidica su una piastra cromatografica istantanea a strato sottile. Quindi, sviluppare la piastra nella camera contenente acido citrico molare 0.1 acquoso fino a nove centimetri di distanza dal punto per determinare la resa radiochimrica.Per valutare l'assorbimento cellulare in vivo del peptide, trattare una volta 10 alla sesta cellule di glioblastoma umano per pozzo in sei piastre di pozzo con 111 kilobecquerel di peptide RGD radioetichettato per pozzo a 37 gradi Celsius per 30, 60, 90 o 120 minuti in triplice copia. Al termine dell'incubazione, lavare i pozzi due volte con due millilitri di PBS per lavaggio e raccogliere le cellule con 0,25% tripside e 0,02%EDTA in PBS a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti. Quindi, trasferire le cellule da ogni pozzo in tubi conici da 15 millilitri per misurare l'assorbimento di peptidi radioetichettato su un contatore gamma.Per valutare la stabilità siere del peptide RGD radioetichettato, aggiungere 500 microlitri di siero di topo preparato al momento, 500 microlitri di siero umano e 500 microlitri di PBS a 50 microlitri di ciascun campione e incubare le miscele a 37 gradi Celsius per un massimo di due ore. Quindi individuare uno o due microlitri di ogni campione su una lastra di cromatografia istantanea a strato sottile dopo 30, 60, 90 e 120 minuti di incubazione e sviluppare le piastre come dimostrato. Per determinare la lipofilia del peptide, aggiungere 10 microlitri del peptide RGD radioetichettato a un sistema PBS ottanale e mescolare generosamente le fiale per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi raccogliere il peptide per centrifugazione e raccogliere 100 microlitri di campione da ogni strato per misurare con un contatore gamma. Per generare modelli di tumore radioetichettati, caricare cinque volte 10 alla sesta cellule di glioblastoma umano in 100 microlitri di PBS in una siringa di insulina da mezzo pollice dotata di un ago calibro 28 per topo nudo BALB / c da iniettare e consegnare le cellule tumorali per via sottocutanea nel fianco sinistro di ogni ricevente. Per la quantificazione in vivo del peptide mediante tomografia ad emissione di positroni, o PET, posizionare la testa un topo anestetizzato con cuscinetti tumorali nel portale PET e somministrare per via endovenosa 7,4 megabecquerel di soluzione RGD-peptidica radioetichettata in 200 microlitri di PBS in ogni modello di topo xenografto attraverso la vena della coda per oltre un minuto durante l'esecuzione di una scansione PET in modalità elenco.Per l'analisi di biodistribuzione ex vivo, iniettare 0,37 megabecquerel di peptide RGD radiomarcato in 200 microlitri di PBS nella vena di coda di un animale xenofobo e portante di tumore e raccogliere i tessuti di interesse a 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'iniezione. Quindi pesare i tessuti e misurare la loro radioattività con un contatore gamma. Dopo la chelazione, le impurità di reazione possono essere rimosse con successo mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni come dimostrato.Una purezza radiochimica superiore al 99% del peptide RGD radioetichettato può essere ottenuta con un'attività specifica alla fine della sintesi tra 90 e 130 megabecquerel per nanometro. L'analisi pet dimostra un assorbimento iniziale elevato nei principali organi, tra cui fegato, rene, cuore, muscoli e all'interno del tumore. Durante le fasi successive dell'analisi, la regione tumorale può essere chiaramente visualizzato con il rapporto tumore/muscolo rimasto invariato, indicando la stabilità cinetica del peptide.L'analisi di biodistribuzione ex vivo rivela che la radioattività accumulata nel tumore diminuisce nel tempo come previsto dai risultati in vivo del PET. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, sebbene la nostra metodologia non possa sostituire il delicato processo di valutazione biologica, può essere utilizzata per utilizzare considerevolmente il tempo e il costo di una pratica tradizionale di sviluppo di farmaci. Non dimenticare che lavorare con i materiali radioattivi può essere estremamente pericoloso e le precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione adeguati come un dosimetro personale e un dosimetro termoluminescente, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di queste procedure.

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Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema

Continua infusione endovenosa è la Strada del trattamento scelta per arginina-vasopressina bloccante dei recettori conivaptan nei topi per studiare Stroke-evocato Cervello Edema

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Chirurgica dell'angiogenesi in porcina Allotransplantation Tibial: un nuovo grande osso animale vascolarizzato Allotransplantation composito modello

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...