Name: preparing a 68ga-labeled arginine glycine aspartate (rgd)-peptide for angiogenesis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por um programa de desenvolvimento da pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF) subvenção financiada pelo governo coreano (n º 2017M2A2A6A02019904) e pesquisa Nuclear.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de pesquisa em protocolos aprovados pelo Instituto de Coreia de radiológica e Comitê de estudos médico Ciências Animal. Todos os reagentes e solventes foram comprados e utilizados sem mais purificação. NOTA-RGD-peptídeos foram preparadas de acordo com a literatura métodos15.
Cuidado: 68Ga emite tanto pósitrons e raios gama. Todos ...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+functional+evaluation+of+RGD-modified+proteins+as+&#945;v&#946;3+integrin+directed+therapeutics.">Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as &#945;v&#946;3 integrin directed therapeutics.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).</li><li>Garanger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+multifunctional+molecular+conjugate+vector+for+targeting,+imaging,+and+therapy+of+tumors.">New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors.</a> Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).</li><li>Dijkgraaf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+imaging+of+&#945;v&#946;3+integrin+expression+in+tumours+with+68Ga-labelled+mono-,+di-+and+tetrameric+RGD+peptides.">PET imaging of &#945;v&#946;3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=68Ga-labeled+cyclic+RGD+dimers+with+Gly3and+PEG4linkers:+Promising+agents+for+tumor+integrin+&#945;v&#946;3+PET+imaging.">68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin &#945;v&#946;3 PET imaging.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).</li><li>Li, Z. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+metastatic+melanoma+utilising+a+technetium-99m+labelled+RGD-containing+synthetic+peptide.">Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide.</a> Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).</li><li>Haubner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+of+&#945;v&#946;3+Integrin+Expression+Using+18+F-labeled+RGD-containing+Glycopeptide+and+Positron+Emission+Tomography.">Noninvasive Imaging of &#945;v&#946;3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography.</a> Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).</li><li>Clarke, E. T., Martell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilities+of+trivalent+metal+ion+complexes+of+the+tetraacetate+derivatives+of+12-,+13-+and+14-membered+tetraazamacrocycles.">Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles.</a> Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).</li><li>Clarke, E. T., Martell, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilities+of+the+Fe(III),+Ga(III)+and+In(III)+chelates+of+N,N&#8242;,N&#8243;-triazacyclononanetriacetic+acid.">Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N&#8242;,N&#8243;-triazacyclononanetriacetic acid.</a> Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).</li><li>Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. 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No presente estudo, apresentamos um protocolo para preparar um radiopeptide visando αvβ3 integrina e sua avaliação biológica. Desenvolvimento de drogas tradicional envolve um procedimento complicado. Requer uma grande quantidade de material de referência e um tempo relativamente longo de avaliação. Embora a metodologia sugerida não pode substituir o processo de avaliação delicado, este sistema pode ser usado para fins de triagem. Esta proposta sistema reduziria consideravelmente o tempo e...

Angiogênese é um processo biológico que é caracterizado pelo desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Entre muitos fatores angiogenetic, αvβ3 integrina está associada a invasividade, porque a integrina é altamente expressa em vasos de tumor angiogênico mas está ausente no tecido normal1.
Radiolabeled peptídeos de ligação ao receptor, com domínio de aspartato (RGD) glicina de arginina, que tem uma elevada afinidade para os receptores integrinas αvβ3 , são considerados promissores angiogênese agentes2,3 de imagem , 4 , 5 , 6 , 7. foram criados vários radiofármacos para PET e suas propriedades biológicas foram validadas em vários modelos animais8,9,10,11. Em termos de um radionuclídeo, 68Ga tem várias vantagens sobre outros radioisótopos. Em primeiro lugar, tem uma elevada acessibilidade para utilizadores e é economicamente vantajoso porque um ciclotron não é necessária. Em segundo lugar, 68Ga-baseado os medicamentos radiofarmacêuticos produzem alta resolução espacial comparada com a tomografia por emissão de fóton único computadorizada (SPECT), permitindo a quantificação mais precisa. Por último, o Half-Life 67,71 minutos de 68Ga pode ser suficiente para a preparação de pequenos peptídeos ou proteínas.
Para produzir um complexo estável com 68Ga, foram desenvolvidos muitos quelantes. Quelantes representativas são o ácido 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (Roberta), ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-etilenodiaminotetracético (DOTA), ácido 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic ácido (DTPA) e N, N'-di(2-hydroxybenzyl) etilenodiamina-N, N'-ácido diacetic (HBED). NOTA tem sido relatado para formar um complexo altamente estável com 68Ga (log estabilidade constante 30.98)12,13,14.
O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo conciso para o desenvolvimento de um novo radiopeptide (Figura 1). Por exemplo, preparamos 68Ga-rotulado RGD-peptídeos e presentes métodos de avaliação biológica destes análogos em um modelo de transplante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:231px;">68Ga/68Ge generator</td>
			<td style="width:187px;">ITG Company</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:239px;">10 mCi&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hydrogen chloride solution</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>84429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">C18 reverse-phase cartridge</td>
			<td style="width:187px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT020515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">0.22-&#956;m sterile filter</td>
			<td style="width:187px;">Milllipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Radio-TLC scanner</td>
			<td style="width:187px;">Bioscan</td>
			<td style="width:119px;">AR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">ITLC paper</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">SGI001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Citric acid</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">HPLC</td>
			<td style="width:187px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:239px;">Waters 1525 system containing binary pump, photo diode array (Waters 2998), radioactivity detector (Raytest, Gabi)</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:231px;">C-18 colunm</td>
			<td style="width:187px;">Develosil</td>
			<td style="width:119px;">HG31546150W</td>
			<td>ODS-HG-5, 150 &#8569; 4.6 mm, 5&#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">14-650-359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle media&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">T175 flasks&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td>CLS431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">15240112</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">&#947;-counter</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:239px;">1480 Wizard 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Insunlin syringe</td>
			<td style="width:187px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">326105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Synringe pump</td>
			<td style="width:187px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">micro-PET/CT</td>
			<td style="width:187px;">Siemens Inveon</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing a 68ga-labeled arginine glycine aspartate (rgd)-peptide for angiogenesis

Avα β3 integrina é uma molécula de adesão heterodimérica envolvidos na angiogênese e migração de células do tumor. A integrina é overexpressed em células endoteliais tumor angiogênico, onde normalmente tem uma baixa concentração. Esta expressão específica de αvβ3 torna um biomarcador válido para antiangiogênica e drogas de imagem. Como uma modalidade de imagem funcional, tomografia por emissão de pósitrons (PET) fornece informações sobre bioquímicos e fisiológicos muda na vivo, devido a sua alta sensibilidade única na escala nanomolar. Daí, baseada em radiometal radiofármacos de PET recebeu grande atenção para a quantificação não-invasivo de angiogênese do tumor. Este artigo fornece um protocolo sistêmico para preparar um novo peptídeo radiometal-etiquetados para a avaliação da angiogênese. Este protocolo contém informações sobre confiabilidade radioquímica, Lipofilicidade, absorção celular, estabilidade de soro e propriedades farmacocinéticas. A 68Ga-RGD-peptídeo é um dos ligantes PET representativas em direção αvβ3 integrina. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar um 68Ga-RGD-peptídeo e a avaliação da sua eficácia biológica.

A quelação de 68GaCl3 com o NOTA-RGD-peptide era simples, sendo o rendimento radiolabeling 99%. Impurezas de reação foram removidas com êxito como mostrado na Figura 2. A pureza radioquímica de 68Ga-RGD-peptídeo era superior a 99%, sendo atividade específica ao final da síntese 90-130 MBq/nmol (Figura 3).
A absorção de célula...

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Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate RGD-peptide for Angiogenesis

Avα β3 integrina é um tipo de proteína de adesão que é altamente expressa em células endoteliais ativadas submetidos a angiogênese. Assim, avaliar a integridade da integrina é de grande interesse em Oncologia. Aqui, apresentamos um método para preparar radiopeptides Ga-rotulado de 68e um método para avaliar sua eficácia biológica.

Preparando um 68Ga-rotulado arginina glicina aspartato (RGD)-peptídeo para angiogênese

The &#945;v&#946;3 integrin is a heterodimeric adhesion molecule involved in tumor cell migration and angiogenesis. The integrin is overexpressed in ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na preparação do Gálio 68 rotulado RGD-Peptídeo e o método para a avaliação biológica de seus análogos. A principal vantagem dessa técnica é que é um protocolo sistêmico simples para o desenvolvimento de um novo peptídeo rotulado por radiometal. Demonstrando o procedimento será Ki-Hye Jung, um pós-doutor do nosso instituto.Comece usando ácido clorídrico molar de 0,5 molar para elute radiolabeled gálio triloreto de um gerador de gálio radiolabeled. Purgue o composto em frasco de reação de cinco mililitros com gás nitrogênio a 80 graus Celsius. Seguido pela adição de 100 microgramas de acetato de glicina de arginina ou peptídeo RGD em um acetato de sódio molar ao composto seco.Aqueça a mistura de reação a 80 graus Celsius durante cinco minutos antes de permitir que a mistura esfrie à temperatura ambiente. Para purificar o produto bruto com cromatografia líquida de alto desempenho, adicione a solução a uma coluna C18 e passe a solução através de um cartucho em faseversa C18. Lave o cartucho com dois mililitros de soro fisiológico e elute o peptídeo radiolabeled com 0,7 mililitros de 95% de etanol seguido pela remoção do solvente a 80 graus Celsius sob gás nitrogênio por 20 minutos.Reconstitua o peptídeo purificado em PBS e filtre o produto radiolabeled através de um coador estéril estéril de 0,22 mícrons. Formule o peptídeo em um mililitro de solução salina estéril e localmente um microliter de solução de peptídeo em uma placa de cromatografia de camada fina instantânea. Em seguida, desenvolva a placa na câmara contendo ácido cítrico molar aquoso 0,1 até nove centímetros de distância do local para determinar o rendimento químico de rádio.Para avaliar a absorção celular in vivo do peptídeo, trate uma vez 10 a sexta células de glioblastoma humano por poço em seis placas de poço com 111 kilobecquerel de RGD-peptídeo radiolabeled por poço a 37 graus Celsius por 30, 60, 90 ou 120 minutos em triplicado. Ao final da incubação, lave os poços duas vezes com dois mililitros de PBS por lavagem, e colme as células com 0,25% Trypsin e 0,02% EDTA em PBS a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, transfira as células de cada poço em tubos cônicos de 15 mililitros para medir a absorção de peptídeos radiolabeled em um contador gama.Para avaliar a estabilidade sárida do peptídeo RGD radiola rotulado, adicione 500 microliters de soro de rato recém-preparado, 500 microliters de soro humano e 500 microliters de PBS a 50 microliters de cada amostra e incubar as misturas a 37 graus Celsius por até duas horas. Em seguida, localize de um a dois microlitadores de cada amostra em uma placa de cromatografia de camada fina instantânea após 30, 60, 90 e 120 minutos de incubação e desenvolva as placas como demonstrado. Para determinar a lipoficidade do peptídeo, adicione 10 microliters do peptídeo RGD radiola rotulado a um sistema pbs octanal e misture os frascos generosamente por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, colete o peptídeo por centrifugação e colide 100 microliters de amostra de cada camada para medir com um contador gama. Para gerar modelos tumorais radiolabeled, carregue cinco vezes 10 a sexta células humanas de glioblastoma em 100 microliters de PBS em uma seringa de insulina de meia polegada equipada com uma agulha de 28 bitola por rato nu BALB/c a ser injetada, e entregue as células tumorais subcutâneamente no flanco esquerdo de cada destinatário. Para quantificação in vivo do peptídeo por tomografia de emissão de pósitrons, ou PET, coloque a cabeça um rato com rolamento de tumor, anestesiado no pórtico PET e administre intravenosamente 7,4 megabecquerels de solução de RGD-peptídeo radiolabeled em 200 microliters de PBS em cada modelo de rato de xenoenxerto através da veia traseira ao longo de um minuto enquanto realiza uma varredura PET no modo de lista.Para análise de biodistribução ex vivo, injete 0,37 megabecquerels de RGD-peptídeo radiolabeled em 200 microliters de PBS na veia traseira de um animal xenergrafado, portador de tumor, e colher os tecidos de interesse aos 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção. Em seguida, pese os tecidos e meça sua radioatividade com um contador gama. Após a quelação, as impurezas de reação podem ser removidas com sucesso por cromatografia líquida de alto desempenho, como demonstrado.Uma pureza radioquímica superior a 99% do peptídeo RGD radiolabeled pode ser alcançada com uma atividade específica no final da síntese entre 90 e 130 megabecquerels por nanômetro. A análise pet demonstra uma alta absorção inicial nos órgãos principais, incluindo fígado, rim, coração, músculo, bem como dentro do tumor. Durante os estágios posteriores de análise, a região tumoral pode ser claramente visualizada com a relação tumoral/músculo permanecendo inalterada, indicando a estabilidade cinética do peptídeo.A análise de biodistribução ex vivo revela que a radioatividade acumulada no tumor diminui ao longo do tempo, como esperado dos achados in vivo PET. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, embora nossa metodologia não possa substituir o delicado processo de avaliação biológica, ele pode ser usado para ser consideravelmente utilizado o tempo e o custo de uma prática tradicional de desenvolvimento de medicamentos. Não se esqueça que trabalhar com os materiais radioativos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso do equipamento de proteção adequado, como um dosímetro pessoal e dosímetro termoluminescente, deve ser sempre tomado durante a realização desses procedimentos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate (RGD)-peptide for Angiogenesis

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Medicina

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Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema

IV infusão contínua é a Rota escolha no tratamento da arginina-vasopressina Receptor Blocker conivaptan em camundongos para Estudar evocadas por acidente vascular cerebral Edema

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Angiogênese cirúrgica em suínos Allotransplantation Tibial: um novo grande osso Animal vascularizado composto Allotransplantation modelo

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...