Name: visualizing axonal growth cone collapse and early amyloid &#946; effects in cultured mouse neurons
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Detta arbete var delvis stöds av forskningsanslag från JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan och Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan.

Alla experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur vid universitetet i Toyama Sugitani Campus och godkändes av kommittén för djur vård och användning av försöksdjur på Sugitani Campus den Universitetet i Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. kollaps Assay
<ol><li>Poly-D-lysin beläggning<ol>
<li>Kappa 8-väl kultur bilder med 400 μL av 5 μg/mL poly-D-lysin (PDL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera vid 37 ° C dem över nat...

Protokollet beskrivs i denna studie aktiverat observationen av tidig fenomen i axonal tillväxt koner efter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 inducerad endocytos i axonal tillväxt kottar inom 20 min och tillväxt kon kollaps observerades inom 1 h av behandling. Detta endocytos var troligen medierad av clathrin. Med hjälp av detta protokoll, bekräftades hämning av clathrin-medierad endocytos för att förhindra Aβ1-42-inducerad tillväxt kon kollaps och axonal degeneration i odlade nervceller27. Des...

Amyloid-β (Aβ) insättningar finns i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom (AD) och anses vara en viktig orsak till AD1 som stör neuronala nätverk, leder till minne nedskrivningar2,3,4. Många kliniska läkemedelskandidater har visat sig effektivt förhindra amyloid-β (Aβ) produktion eller ta bort Aβ insättningar. Dock har ingen lyckats förbättra minnesfunktion i AD patienter5. Aβ är redan deponerat i hjärnan före uppkomsten av minne nedskrivningar6; Därför kan minskar Aβ nivåer i hjärnan hos patienter uppvisar minne nedskrivningar vara ineffektiva. Aβ nedfall är närvarande i preklinisk AD patienter; dessa patienter närvarande dock sällan med neuronal degeneration och minne underskott6. I området i närheten finns det en tidsfördröjning mellan Aβ nedfall och minne nedskrivningar. Därför blockerar en viktig strategi för förebyggande av AD Aβ toxicitet signalering under de tidiga stadierna av AD, före utvecklingen av minne underskott. Aβ nedfall inducerar axon degeneration7,8,9,10,11,12,13, vilket kan leda till en rubbning av neurala nätverk och permanent nedsatt minne. Många studier har undersökt mekanismerna av Aβ toxicitet. till exempel har den degenererade axoner av hjärnor med AD möss visat sig ökat autofagi14. Kalcineurinhämmare aktiveringen har rapporterats som en möjlig mekanism av Aβ-inducerad axonal degeneration15; den direkt utlösande av axonal degeneration är dock fortfarande okänd.
Denna studie fokuserar på kollapsen av axonal ändelser kallas tillväxt kottar. Kollapsen av axonal tillväxt kottar kan orsakas av axonal tillväxt avskräckningsmedel, såsom semaphorin-3A och efrinreceptorkinaser-A516,17,18,19,20. Kollaps-liknande dystrofa axonal ändelser har observerats i hjärnan hos AD patienter21,22. Dessutom kan bristande tillväxt kon fungerar provocera axonal degeneration23. Det är dock okänt om Aβ inducerar tillväxt kon kollaps. Därför presenterar denna studie en roman protokoll för att observera tidiga effekterna av Aβ i odlade nervceller och undersöka Aβ-inducerad tillväxt kon kollaps.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1119">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">ddY mice</td>
			<td style="width:133px;">SLC</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:539px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eight-well culture slide</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">poly D lysine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-19041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Culture medium, Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">house serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>074-00522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Filter with 70 &#181;m mesh size, cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CO2 incubator</td>
			<td>Astec</td>
			<td>SCA-165DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amyloid &#946;1-42</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope A</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z1&#160;</td>
			<td>Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Plan-Apochromat 20x</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420650-9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective Plan-Apochromat 63x</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>440762-9904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2 IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-tau-1 IgG</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-amyloid &#946; antibody</td>
			<td>IBL</td>
			<td>10379</td>
			<td>clone 11A1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Wako</td>
			<td>143-06561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>010-25783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">t-octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-21105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">hot plate</td>
			<td>NISSIN</td>
			<td>NHP-M30N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">35 mm dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>1000-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone RTV</td>
			<td>Shin-Etsu</td>
			<td>KE42T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">hand punch</td>
			<td style="width:133px;">Roper Whitney</td>
			<td style="width:109px;">No. XX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorescence membrane probe, FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ca2+- and Mg2+-free Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Transfection solution, Nucleofector solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator, Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope B</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:339px;">Image software, ImageJ</td>
			<td style="width:133px;">NIH</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:539px;">https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing axonal growth cone collapse and early amyloid &#946; effects in cultured mouse neurons

Amyloid-β (Aβ) orsakar minne nedskrivningar i Alzheimers sjukdom (AD). Även om therapeutics har visat sig minska Aβ nivåer i hjärnan hos AD patienter, förbättrar dessa inte minnesfunktioner. Sedan Aβ aggregerar i hjärnan före uppkomsten av minne nedskrivningar, kan inriktning Aβ vara ineffektiv för behandling av AD patienter som redan uppvisar minne underskott. Därför bör nedströms signalering på grund av Aβ nedfall blockeras innan AD utveckling. Aβ inducerar axonal degeneration, vilket leder till störningar av neuronala nätverk och minne nedskrivningar. Det finns många studier på mekanismer för Aβ toxicitet, förblir källan av Aβ toxicitet okänd. För att identifiera källan, föreslår vi ett nytt protokoll som använder mikroskopi, gen transfection och levande cell imaging för att undersöka tidiga förändringar orsakade av Aβ i axonal tillväxt kottar av odlade nervceller. Detta protokoll avslöjade att Aβ inducerad clathrin-medierad endocytos i axonal tillväxt kottar följt av tillväxt kon kollaps, visar att hämning av endocytos förhindrar Aβ toxicitet. Detta protokoll kommer att vara användbart i studera tidiga effekter av Aβ och kan leda till effektivare och förebyggande AD behandling.

I detta protokoll, var Aβ1-42 inkuberas vid 37 ° C i 7 dagar före användning, eftersom inkubering av Aβ1-42 behövdes för att producera giftiga former27,28,30,35. Efter denna inkubation observerades aggregerade former av Aβ (figur 1A). Det har rapporterats att liknande inkubering av Aβ1-42 producerade fibrill form av Aβ<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Här presenteras ett protokoll att undersöka de tidiga effekterna av amyloid-β (Aβ) i hjärnan. Detta visar att Aβ inducerar clathrin-medierad endocytos och kollapsen av axonal tillväxt kottar. Protokollet är användbart för att studera tidiga effekter av Aβ på axonal tillväxt kottar och kan underlätta förebyggande av Alzheimers sjukdom.

Visualisera Axonal tillväxt Cone kollaps och tidiga Amyloid β effekter i odlade mus nervceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området för Alzheimer sjukdom forskning, särskilt de tidiga händelser som är inblandade i tillväxt kon kollaps. Den största fördelen med denna teknik är att göra det möjligt att visualisera och analysera axonal tillväxtkoner omedelbart efter amyloid betabehandling. Börja med att använda mikrosax för att färsa nyligen isolerade cerebrala cortices från embryonala dag-14 möss i neuron kultur medium utan antibiotika.Samla ihop vävnaderna och centrifugera vävnaderna vid 87G i tre minuter. Efter centrifugeringen tar du bort supernatanten och lägger till två milliliter på 0,05%trypsin i pelleten. Inkubera i 15 minuter vid 37 grader Celsius och blanda genom att knacka var femte minut.Efter 15 minuter, tillsätt fyra milliliter medium A för att neutralisera trypsin, och blanda genom att knacka. Sedan centrifugera vävnaderna vid 178 gånger G i tre minuter. När du har tagit bort supernatanten, tillsätt DNAse och sojaböns trypsinhämmarlösning och inkubera i 15 minuter vid 37 grader Celsius med blandning var femte minut som tidigare.När inkubationstiden förflutit, tillsätt fyra milliliter medium A.Mix och centrifug som tidigare. Efter att du har tagit bort supernatanten, tillsätt fyra milliliter medium A och triturtera vävnaderna med en polerad Pasteurpipett tills inget skräp observerats. Därefter filtrera triturated vävnader med 70-micron por-storlek mesh.Efter filtrering, räkna cellerna med en hemocytometer och beräkna celltätheten. Pipett 0,8 gånger 10 till de fjärde cellerna i medium A i varje brunn av en åtta-väl kultur bild. Sedan inkubera i en fuktad atmosfär på 10%CO2 vid 37 grader Celsius.Efter fyra timmars odling, ändra odlingsmedium till medium B.Renheten hos nervceller med denna metod är ungefär 75%Påbörja denna analys minst en vecka i förväg genom att öppna en färsk flaska av kommersiellt erhållen fullängds A beta 42 och upplösa innehållet i sterilt, destillerat vatten till en koncentration av 0,5 millimolar. Inkubera vid 37 grader Celsius i sju dagar för att framkalla aggregering och toxicitet. Förbered alikvoter av aggregerade A beta 1-42 och förvara på minus 80 grader Celsius tills användning.På dag fyra av den neuronala kulturen, behandla brunnarna med 100 mikroliter av 0,5 mikromolar aggregerade A beta 1-42 eller fordonslösning i medium B i en timme som tidigare visat. När timmen har gått, ta bort odlingsmediet och åtgärda omedelbart nervcellerna med 4%paraformaldehyd som innehåller 4%sackaros i PBS i en timme vid 37 grader Celsius på en värmeplatta. Fixering är viktigast som att upprätthålla formen av tillväxt koner är avgörande för detta protokoll.Efter fixering, tvätta nervcellerna tre gånger med PBS. Sedan efter att ha tagit bort kammaren, montera nervceller med en vattenhaltig montering medium. Torka monteringsmediet vid fyra grader Celsius i två till fyra dagar.Fånga hela området för varje brunn med en 20X torr objektiv på ett inverterat mikroskop. Att fånga och analysera hela området i varje brunn är viktigt för att undvika subjektivitet. Klassificera de längsta neuriter av varje neuron i steg tre eller fyra som axoner.Axonal tillväxt kottar saknar lamellipodia eller som har färre än tre filopodia anses kollapsade tillväxt kottar. En beta 1-42 oligomerer, visas här före inkubation, aggregera efter sju dagars inkubation vid 37 grader Celsius. Efter behandling med aggregerad A beta 1-42, visar immunfärgning med en antikropp för den toxiska oligomer av A beta positiv färgning i rött på A beta 1-42 behandlade nervceller, men inte fordonsbehandlade nervceller.De tidiga fenomen som framkallas av A beta 1-42 behandling analyserades efter fyra dagar i kultur. Identifierade axons bekräftades som sådan av positiva immunostaining för axonal markör tau-1 visas i rött och negativt immunostaining för dendritic markören, MAP-2, visas i grönt. Efter en timmes fordonsbehandling hade tillväxtkoner spridit lamellipodia och flera filopodia.Dessa identifierades som friska tillväxtkottar. Omvänt ledde en timme av A beta 1-42 behandling till krympta tillväxt kottar, som utvecklade inga lamellipodia eller filopodia. Dessa identifierades som kollapsade tillväxtkottar.Medan du försöker detta förfarande, det är viktigt att komma ihåg att fixa cellerna med 4%PFA och 4%sackaros vid 37 grader Celsius till min-nor-idge detta fixeringsprotokoll i bästa. Efter detta protokoll, andra metod som live-cell imaging och gentransfektion kan utföras för att svara på ytterligare frågor som när och hur axon tillväxt kottar kollapsar och hur den kollapsade tillväxt kottar återvinns.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Mekanisk Manipulation av nervceller till Control axonal utveckling

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Analys av Dendritiska Spine Morfologi i odlade CNS Neuroner

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Inspelningar från mus Retina: Stång och Photoresponses Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induktion Dendritic Tillväxten i Odlade sympatiska nervceller

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-märkta receptor Insättning till plasmamembranet i primärt odlade mus Nervceller

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Visualisering av effekterna av en positiv tidig erfarenhet, Taktil Stimulering, på Dendritiska morfologi och Synaptic Connectivity med Golgi-Cox färgning

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Realtid avbildning av axonal transport av Quantum Dot-märkta BDNF i primära neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell för att studera axonal tillväxt Mönster och morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion av oligomera amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Kvantifiering av endosom och lysosommotiliteter i odlade neuroner med användning av fluorescerande probar

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...