Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

هذا العمل كان يؤيد منح المعاهد الوطنية للصحة R56DK084321 (ميلان)، R01DK084321 (ميلان)، R01DK111538 (ميلان)، R01DK113093 (AC)، و R21ES025673 (AC)، ومنحة أفضل/2015/043 (Consellería de Educació، والثقافة وأنا اسبورت، محافظة فالنسيا، فالنسيا، إسبانيا) (EO). يشكر المؤلفون الفريق المرسلة في الجامعة الكاثوليكية فالنسيا دي سان فيسنتي مارتير، فالنسيا، إسبانيا وألبرتو هيرنانديز في مركز بحوث وبرنشيبيه فيليبي، فالنسيا، إسبانيا لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها.

رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميامي وافق جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.
1-العزلة والتشذيب لحديثي الولادة تيمي
<ol><li>تحضير جميع المواد الكاشفة والصكوك بالتعقيم أو بطرق أخرى، ضمان ظروف معقمة.</li>
	<li>للتقليل من التلوث، إجراء جميع العمليا...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

نظراً لأهمية عملية نضج تي خلية للكفاءات الفردية المناعي4 وأثر المفترضة لديناميات السلائف الخلية في الخلايا التائية الناضجة التي تنتجها الغدة الصعترية2،3، وقد استثمرت جهودا مكثفة تطوير بدائل للنهج اللقطة الأنسجة الثابتة الكلاسيكية.
<p class="jove...

إينتراثيميك تي خلية المفاضلة والانتقاء يتدنى تي خلية تشكل العمليات الرئيسية لتطوير وصيانة الخلية بوساطة الحصانة في الفقاريات1. تنطوي هذه العملية على تسلسل معقد من أحكام تنظيم الأحداث بما في ذلك تعيين موروث من مجرى الدم، وتكاثر الخلايا، والهجرة، والتعبير التفاضلية من بروتينات الغشاء، وموت الخلايا المبرمج واسعة النطاق لمجموعات فرعية التحديد. النتيجة هو الإفراج عن ناضجة خلايا تي رد الفعل طائفة وافرة من المستضدات الخارجية أثناء عرض استجابات مصغر للنفس-الببتيدات، هي في نهاية المطاف استعمار الأجهزة الطرفية اللمفاوية الفردية2،3. اختيار ثيموسيتي الشاذة مرجع αβTCR يؤدي إلى أمراض المناعة الذاتية أو الاختلال المناعي4 التي تنشأ أساسا من العيوب خلال عمليات التحديد السلائف سلبية أو إيجابية، على التوالي.
اتجاهات هجرة الثيموسيه عبر الغدة الصعترية الجوهرية في جميع مراحل النضج تي خلية ويتوخى كسلسلة متزامنة أو متتابعة المحفزات متعددة، بما في ذلك المستقطبات، لاصقة، ولاصق إزالة الألغام المصفوفة خارج الخلية (ECM) بروتين تفاعلات3،5. دراسة الأنسجة الثابتة قدمت معلومات هامة فيما يتعلق بأنماط التعبير بالنسبة للرموز ثيموسيتي المهاجرة في ميكرونفيرونمينتس الغدة الصعترية المعرفة5،6، بينما كشفت دراسات السابقين فيفو اثنين انتشارا السلوكيات المهاجرة من الثيموسيه في مجالين الأشيع متميزة للجهاز: بطء الحركات العشوائية في القشرة وحركية سريعة، محصورة في لب7،،من89،10 , 11 , 12 , 13-زيادة معدلات الهجرة ترتبط بالتحديد الإيجابي الغدة الصعترية13 والانتقاء السلبي ويرتبط مع سلوك الزحف دعم الفرضية القائلة بأن حركية الرحلة عن طريق الغدة الصعترية يحدد السليم نضوج الثيموسيه. على الرغم من أهميتها، لا تزال طبولوجيا تفاعلات الخلية ثيموسيتي stromal وديناميات حركية ثيموسيتي عبر ميكرونفيرونمينتس الجهاز أثناء نضج تي خلية غير محددة.
معظم السابقين فيفو دراسات أجريت حتى الآن تشمل الجنين أو ريجريجاتي الجهاز الغدة الصعترية الثقافات14،15، شرائح الأنسجة أو explants الفص الغدة الصعترية سليمة حيث يتم تصور حركات ثيموسيتي قبل يومين-فوتون ليزر المسح الفحص المجهري (تبلسم)8، درست أسلوب تصوير إينترافيتال مع حد أقصى مقيدة تعمل عن بعد والتصوير عمق 1 مم وفقا للأنسجة16. على النقيض من ثقافات الجهاز الغدة الصعترية الشاقة التي تعتمد على أوقات الاحتضان الموسعة لنموذج 3D-الهياكل، على حد سواء، تقنية شريحة الغدة الصعترية ونهج سليمة فص الغدة الصعترية إدخال تصريح الخاضعة لسيطرة مجموعات فرعية معينة من قبل المسمى الثيموسيه إلى بيئة هندسة أنسجة أصلية. ومع ذلك، نظراً لتدفق الدم غائبة في هذه النماذج، فمحدودة ومن الواضح لدراسة عملية التوظيف للغدة الصعترية تسوية موروث (TSPs) حمة الغدة الصعترية أو ديناميات اجريسيون الغدة الصعترية من الخلايا التائية الناضجة.
وتشمل في فيفو نماذج لدراسة فسيولوجيا نضوج تي خلية الغدة الصعترية في الفئران الطعوم من الشظايا أو الفصوص الجهاز كامل وضعها أما داخل كبسولة الكلي17 أو18إينتراديرمالي. على الرغم من أن هذه الخيارات قد أظهرت فائدتها استجواب engraftment الوظيفية النظامية للأنسجة، موقف الطعوم الغدة الصعترية العميق داخل الحيوان أو مغطاة بطبقات من الأنسجة المعتمة يقيد استعمالها للفحص في فيفو يزرع بها تبلسم.
الغرفة الأمامية للعين يوفر مساحة يمكن الوصول بسهولة للرصد المباشر لأي الأنسجة المطعمة بحكم شفافية طبقات القرنية. ميزة، قاعدة الدائرة التي شكلتها قزحية العين الغنية بالأوعية الدموية ونهايات الأعصاب اللاإرادي، تمكين عودة التوعي السريع ورينيرفيشن ل ترقيع19،20. الدكتور كايسيدو قد استخدمت بنجاح هذه المساحة التشريحية للصيانة ودراسة طولية من جزيرات البنكرياس في الماضي21. هنا، نحن تبين أن هذه الاستراتيجية لا يشكل نهجاً سليما لدراسة ديناميات نمو داخل هيكل الجهاز الأصلي، ولكن أيضا شكل فريد يسمح تمديد في فيفو تسجيلات طولية لدراسة التوظيف السلف و الخطوات اجريسيون تي خلية ناضجة في الماوس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

وغرض الأسلوب الذي تعرض لإظهار زرع ثيمي حديثي الولادة إلى غرفة العين الأمامي من الفئران الكبار اسوي في فيفو طولية في الوقت الحقيقي رصد لديناميات thymocytes´ داخل فاسكولاريزيد، للمرة الأولى، الجزء المتعلق بالغدة الصعترية. وبعد زرع الأعضاء، يسمح الليزر الفحص المجهري (LSM) من خلال القرنية في فيفو موسع التصوير المتكرر على المستوى الخلوي القرار. الأهم من ذلك، يضيف النهج السابق نضج تي خلية إينترافيتال التصوير نماذج إمكانية تجنيد خلية السلف المستمرة وتسجيلات متدفقة تي خلية ناضجة في الحيوان نفسه. مزايا إضافية للنظام شفافية مجال المطعمة، يتيح الرصد السريع العيانية مزروع الأنسجة، وإمكانية الوصول إلى زرع السماح للمترجمة بالإضافة إلى العلاجات الجهازية. القيد الرئيسي يجري حجم الأنسجة التي تناسبها في الفضاء انخفاض الدائرة العين التي تطالب للتشذيب فلقة. سلامة الجهاز مكبراً بتشريح الفصوص الغدة الصعترية في أنماط المبين سابقا يكون جاهزاً للإنتاج تي خلية ناضجة. هذا الأسلوب يحتمل أن تكون مناسبة لاستجواب بيئة ذات الصلة طبيا المسائل المتصلة بوظيفة الغدة الصعترية التي تشمل المناعة الذاتية، ونقص المناعة المكتسب، والتسامح المركزية؛ العمليات التي تظل ميتشانيستيكالي غير المحددة بوضوح. تشريح غرامة آليات توجيه الهجرة ثيموسيتي، والتمايز والتحديد ينبغي أن يؤدي إلى استراتيجيات علاجية رواية استهداف خلايا تي النامية.

الغدة الصعترية من الفئران حديثي الولادة كانت معزولة من B6. الفريق الاستشاري--Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/جاس الفئران كما هو موضح في هذا البروتوكول (خطوات 1.1-1.9). في هذه الفئران المعدلة وراثيا، يوجه المروج أكتين بيتا دجاج التعبير عن المتغير البروتين الفلورسنت الأحمر دسريد. MST تحت تأثي?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

وهدف البروتوكول لإظهار تتبع في الوقت الحقيقي إينترافيتال طولية من الثيموسيه بالليزر الفحص المجهري في الغدة الصعترية يزرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس. شفافية القرنية والأوعية الدموية للفساد يسمح باستمرار تسجيل السلف خلية التجنيد وخروج تي خلية ناضجة.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة حول آليات المناعة الذاتية، نقص المناعة، والتسامح المركزي، وthymus involution. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح في تسجيل طولي الجسم من تجنيد السلف وناضجة T-خلية الخروج داخل شرائح الغدة الصعترية الماوس المطعمة الوعائية والمطعّمة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تطوير ووظيفة الغدة الصعترية، ويمكن أيضا أن تطبق على الأنسجة الأخرى مثل الجزر البنكرياسية أو كبيبات الكلى.لعزل الغدة الصعترية، ضع الماوس على مناشف ورقية ممتصة معقمة في وضع الظهر المستقيم في غطاء تدفق لاريم، ورش ومسح البطن الماوس مع 70٪ الإيثانول. إجراء شق سطحي على شكل حرف V في أسفل البطن لفضح تجويف الصدر واستخدام مقص تشريح مستقيم بطول 10 سنتيمترات لإجراء شق من 0.5 إلى سنتيمتر واحد في الصدر على طول خط الوسط البطني. أضعاف الجلد على كل جانب من الصدر لفضح تجويف الصدر وجعل اثنين إضافية أعمق 0.5 إلى شقوق جانبية سنتيمتر واحد من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري للوصول إلى توستينوم متفوقة في تجويف الصدر الأمامي.يجب أن تظهر الغدة الصعترية كفصين شاحبين فوق القلب مباشرة. ضع منحنية النصائح الزلاجة تحت الغدة الصعترية وسحب عموديا لاستخراج الجهاز الكامل، ومنع أضعاف الظهر من القفص الصدري مع زوج من ملقط مستقيم. ثم غمر الغدة الصعترية المعزولة في طبق عقيم 60 ملليلتر يحتوي على PBS معقمة الباردة على الجليد واستخدام مشرط لقطع البرزخ الضامة لفصل الفصوص الغدة الصعترية.قبل زرع, الوسم ووزنها كل الماوس المتلقي ووضع أول في موقف الجانبي recumbent الجانبية مع عين واحدة تتعرض مباشرة لعدسة المجهر تشريح. باستخدام مقص Vannas ، يُزيل أحد الفصوص الزعتية المعزولة التي يصل عرضها إلى ملليمتر واحد بعد نمط متعرج لضمان أن يحتوي كل جزء على بعض القشرة الزعتية وأنسجة النخاع. من الأهمية بمكان تقليم الغدة الصعترية الحق قبل زرع كما قد لا تنقّر قطع كبيرة بشكل صحيح.بعد ذلك ، بدءًا من قاعدة القرنية في المنطقة الجراحية ، استخدم طرف إبرة قياس 40 ملليمترًا من 18 إلى إجراء شق صغير في طبقات القرنية الخارجية بحيث يمكن إدخال طرف مقص تشريحي. استخدم المقص لإجراء شق جناح من 5 إلى 10 ملليمترات حول قاعدة القرنية مباشرة أثناء استخدام ملقط مسطح النهاية لعقد القرنية مفتوحة لمنع إعادة المسك. استيعاب ظهارة القرنية المقطوعة مع ملقط مسطحة، والحفاظ على الفتحة في القرنية مع إدخال جزء من الزعتر من خلال الفتحة.من المهم إدخال قطعة الغدة الصعترية بسرعة من خلال فتحة القرنية لمنع إعادة الراسل التلقائي قبل إدخال الأنسجة. كن حذرا للحفاظ على سلامة الأنسجة في هذه الخطوة. اضغط بهدوء على سطح العين لشريحة الجزء المقدم من الأنسجة إلى موقف جانبي فيما يتعلق بالتلميذ للحفاظ على وظيفة العين.واستخدام ملقط شقة للضغط على جانبي فتحة القرنية بحزم ضد بعضها البعض لمدة ثلاث إلى خمس ثوان لتعزيز الختم الذاتي. إذا كان لعملية الزرع أن يتم إجراؤها على كلتا العينين، قم بتشغيل الماوس على الجانب الجانبي المقابل من أجل عملية زرع ثانية كما هو موضح للتو. عند اكتمال الجراحة، ارجع الماوس إلى قفص فارغ تم تدفئته مسبقًا بمصباح حراري مع مراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل.عند نقطة الوقت التجريبية المناسبة، ضع فأرة مستلم مُجلّد على منصة مجهر ثابتة المراحل في موضع جانبي جانبي على لوحة حرارية مع عين واحدة مواجه لأعلى. وأدخل رأس الماوس في حامل رأس مجسم. ضبط مقبض الباب لكبح جماح رأس الماوس في موقف الجانب الجانبي للسماح بالوصول المباشر لهدف المجهر إلى العين عقد الكسب غير المشروع الغدة الصعترية وسحب الجفون في حين عقد العين في هامش القرنية مع زوج من النصائح الملقطة التي تغطيها أنبوب البولي ايثيلين تعلق على مشترك يو إس تي-2 الصلبة العالمية.إضافة بضع قطرات من الدموع المالحة العقيمة أو الاصطناعية بين القرنية والعدسة قبل وضع الهدف 5X المجهر على العين الماوس وتحديد موقع الغدة الصعترية في مجال المجهر. ثم التبديل إلى أعلى القرار المياه غمر الهدف مع مسافة عمل طويلة وحدد وضع الاستحواذ في برنامج المجهر. ابدأ وضع الماسح الضوئي الرنين وحدد وضع التصوير XYZT.بدوره على الليزر الأرجون وضبط الطاقة إلى 30٪ لالإثارة الفلورانس. حدد خط ليزر الإثارة المناسبة وتعيين التحكم في تقسيم شعاع acousto البصرية لأطوال موجية الانبعاثات المناسبة باستخدام الكشف عن الانعكاس في وقت واحد للكشف عن backscatter وتحديد هيكل الأنسجة. جمع الانبعاثات في الطول الموجي المحدد وتعيين دقة 512-by-512 بكسل.ثم انقر مباشرة لبدء التصوير ، وضبط مستويات كسب حسب الضرورة. التركيز على الجزء العلوي من زرع الزعتر وحدد تبدأ في تحديد بداية المكدس Z. ثم التركيز على الطائرة الأخيرة في الغدة الصعترية المزروعة التي يمكن تصورها وتحديد نهاية لتحديد نهاية المكدس Z باستخدام حجم Z-الخطوة من خمسة ميكرومتر.تعيين الفاصل الزمني للحصول على كل مكدس Z لمدة 1.5 إلى ثانيتين وحدد خيار الحصول حتى إيقاف للتصوير المستمر. ثم انقر فوق بدء تهيئة التسجيل. هنا، تظهر صور الحقل الساطع وفلوريسنس لنفس المنطقة من زرع الغدة الصعترية التي قد تعمل لمتابعة مزدوجة العيانية لنمو الأنسجة والدراسات التثاؤب والاستمرار.كما تسهل الصورة ذات المجال الساطع تصور الأوعية الدموية للأنسجة المزروعة ، مما يسمح بإجراء دراسة فريدة لاعتماد فسيولوجيا الغدة الصعترية على إمدادات الدم بمرور الوقت. يسمح هذا النموذج بالتصور من الهجرة عبر الخلايا من سيل الدم إلى الغدة الصعترية المزروعة، وتتبع الاتصالات بين الخلايا السلفة إيجابية GFP دخول زرع الغدة ثعرية مع RFP المسمى المقيمين ظهارية والخلايا السترومية خلال عمليات التمايز والاختيار، فضلا عن رصد الخلايا المناعية الخارجة من الغدة الصعترية إلى الأوعية الدموية الطرفية. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر تقليل تعرض الأنسجة للحصول على أفضل الengraftment وكذلك للحد من حجم الشق في العين للسماح بالاستئصال لأجزاء سالمة من خلال القرنية مع الحد من التليف أثناء الشفاء.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل علاجات التحكم الموضعية وشق الأنسجة الأخرى في العين المقابلة بحيث يمكن الإجابة على أسئلة إضافية حول الخلل المناعي المرتبط بالالتهابات، ومحددات الإنفاض، وآليات تحمل الزرع. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف تطوير الخلايا التى ، بما في ذلك تجنيد السلف ، وديناميات عين الغدة الصعترية ، وخطوات الخروج الناضجة من الخلايا التى في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...