Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) og R21ES025673 (AC), og den bedste/2015/043 grant (Consellería de Educació, cultura jeg esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Forfattere takke sendte holdet på Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien og Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien for deres hjælp med video filme og redigere.

Institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Miami godkendt alle eksperimenter ifølge IACUC retningslinjer.
1. isolering og trimning af nyfødte Thymi
<ol><li>Forberede alle reagenser og instrumenter ved autoklavering eller andre metoder, sikrer sterile forhold.</li>
	<li>For at minimere kontaminering, udføre alle kirurgiske procedurer under en laminar flow hætte.</li>
	<li>Forud for euthanizing donor mus, udfylde en 60 mm sterile parabol med steril prechilled 1 x ...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

På grund af betydningen af T-celle modning processen for individuel immun kompetencevurdering4 og den formodede virkning af forløber celle dynamics på modne T-celler produceret af thymus2,3, er omfattende indsats blevet investeret at udvikle alternativer til den klassiske faste væv snapshot tilgang.
Selvom væv skiver og andre explants er klart overlegen i at gengive væv arkitektur end encellelag eller saml...

Intrathymic T-celle differentiering og T-celle delpopulation udvalg udgør centrale processer til udvikling og vedligeholdelse af celle-medieret immunitet i hvirveldyr1. Denne proces indebærer en kompleks sekvens af stramt organiserede begivenheder, herunder ansættelse af stamfaderen fra blodbanen, celleproliferation og migration, differentierede udtryk af membranproteiner, og massive programmeret celledød for delmængder udvalg. Resultatet er udgivelsen af modne T-celler reaktiv til en rigelig spektrum af udenlandske antigener mens der vises minimeret svar til self-peptider, som ender op koloniserer de perifere lymfoide organer af individuelle2,3. Afvigende thymocyte udvalg af αβTCR repertoire fører til autoimmun sygdom eller immun ubalance4 der hovedsageligt stammer fra defekter under processerne af negative eller positive forløber udvalg, henholdsvis.
Retningsbestemt migration af thymocytter i thymus er iboende til alle faser af T-celle modning og det er planlagt som en serie af samtidige eller sekventiel flere stimuli, herunder kemokiner, selvklæbende, og de selvklæbende ekstracellulære matrix (ECM) protein interaktioner3,5. Studiet af faste væv har gjort vigtige oplysninger vedrørende mønstre af udtrykket for thymocyte vandrende stikord i definerede thymic microenvironments5,6, mens ex vivo undersøgelser har afsløret to fremherskende vandrende opførsel af thymocytter i to histologisk særskilte områder af orglet: langsom stokastiske bevægelser i cortex og hurtig, begrænset motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. øget vandrende satser korrelerer med thymic positive valg13 og negative valg er forbundet med kravlende adfærd støtter den hypotese, at kinetik af rejsen gennem thymus bestemmer korrekt modning af thymocytter. Trods deres relevans fortsat topologi af thymocyte-stromale celle interaktioner og dynamikken i thymocyte motilitet på tværs af orgel microenvironments under T-celle modning er uklare.
De fleste ex vivo undersøgelser udført til dato inkluderer føtal eller reaggregate thymic orgel kulturer14,15, væv skiver eller intakt thymic lobe explants hvor thymocyte bevægelser er visualiseret ved to-foton laser scanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital imaging teknik med begrænset maksimalt arbejde afstand og imaging dybde af 1 mm i overensstemmelse med vævet undersøges16. I modsætning til de besværlige thymic orgel kulturer, som afhænger af udvidede inkuberingstider til at danne 3D-strukturer, både thymic skive teknik og intakt thymic lap tilgang tillader kontrolleres indførelsen af særlige delmængder af forud mærket thymocytter i en native væv arkitektur miljø. Men, da blod flow er fraværende i disse modeller, de er klart begrænset til at studere rekrutteringsprocessen af thymus afregning stamfaderen (TSPs) til thymus parenkym eller dynamikken i thymic egression af modne T-celler.
In vivo modeller for studiet af thymic T-celle modning fysiologi i mus omfatter grafts fragmenter eller hele orgel lapper placeret enten inde i nyre kapsel17 eller intradermalt18. Selv om disse muligheder viste deres nytte at afhøre systemisk funktionel engraftment af væv, begrænser placeringen af thymic grafts dybt i dyret eller dækket af lag af uigennemsigtige væv deres brug i vivo undersøgelse af implantater af TPLSM.
Den forreste kammer i øjet giver en let tilgængelig plads til direkte overvågning af podede væv i kraft af gennemsigtighed af cornea lag. Fordel er bunden af salen dannet af iris rig på blodkar og autonome nerveender, muliggør hurtig revaskularisering og reinnervation grafts19,20. Dr. Caicedo har med held brugt denne anatomiske plads til vedligeholdelse og langsgående undersøgelse af pancreas Holme i de sidste21. Her, vi viser, at denne strategi udgør ikke kun en gyldig tilgang for at studere thymocytter dynamikken i native organ strukturen, men også unikt tillader for at udvide i vivo langsgående indspilninger i studiet af stamfader rekruttering og modne T-celle egression trin i musen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Formålet med metoden fremlægges er at vise, for første gang, transplantation af nyfødte thymi i forreste øjet kammer af isogene voksne mus i vivo langsgående real-time overvågning af thymocytes´ dynamik inden for en vaskulariserede thymus segment. Efter transplantation giver laser scanning mikroskopi (LSM) gennem hornhinden i vivo noninvasive gentagne imaging på cellulære resolution niveau. Vigtigere, føjer fremgangsmåde til tidligere intravital T-celle modning imaging modeller mulighed for kontinuerlig stamfader celle rekruttering og modne T-celle egress optagelser i samme dyr. Yderligere fordele ved systemet er gennemsigtigheden af de podede område, tillader det makroskopiske hurtig overvågning af det implanterede væv, og adgangen til implantatet giver mulighed for lokaliseret ud over systemiske behandlinger. Den største begrænsning er volumen af væv, der passer i de reduceret plads øjet kammerets, som kræver for lap trimning. Orgel integritet er maksimeret ved at dissekere thymus lapper i mønstre tidligere vist sig at være funktionelle for modne T-celle produktion. Teknikken er potentielt velegnet til at afhøre en milieu af lægeligt relevante spørgsmål relateret til thymus funktion, der omfatter autoimmunitet, immundefekt og central tolerance; processer, som fortsat er mekanisk dårligt defineret. Den fine dissektion af mekanismer vejledende thymocyte migration, differentiering og udvalg bør føre til nye terapeutiske strategier rettet mod udviklingslandene T celler.

Thymus fra nyfødte mus blev isoleret fra B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas mus som beskrevet i denne protokol (trin 1.1-1.9). I disse Transgene mus dirigerer kylling beta actin promotor udtryk for rødt fluorescerende proteiner variant DsRed. MST under indflydelse af de cytomegalovirus (CMV) øjeblikkelig tidlige enhancer lette sporingen af implantater.
At forhindre væv afvisning, isogene individer med genotype: ...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking af thymocytter i det forreste kammer i øjet ved Laser Scanning mikroskopi

Målet med protokollen er at vise langsgående intravital real-time tracking af thymocytter ved laser scanning mikroskopi i thymic implantater i mus øjet forkammeret. Gennemsigtigheden af hornhinden og vascularization af graften giver mulighed for uafbrudt optagelse stamfader celle rekruttering og modne T-celle udgang.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i immunologi område om mekanismerne i autoimmunitet, immundefekt, central tolerance, og thymus involution. Den største fordel ved denne teknik er, at det tillader in vivo langsgående registrering af stamfader rekruttering og modne T-celle udgangsion inden vaskulære og podet mus thymus segmenter. Selv om denne metode kan give indsigt i udviklingen og funktionen af thymus, kan også anvendes på andre væv såsom pancreas øer eller nyre glomeruli.For at isolere thymus, placere musen på sterile absorberende papirhåndklæder i dorsal oprejst position i en laminar flow hætte og spray og tør musen maven med 70% ethanol. Lav en overfladisk V-formet snit i underlivet til at udsætte brysthulen og bruge et par lige 10-centimeter dissekere saks til at gøre en 0,5 til en centimeter snit i brystet langs ventrale midterlinjen. Fold huden over hver side af brystet for at udsætte brysthulen og gøre to yderligere dybere 0,5 til en centimeter laterale indsnit gennem mellemgulvet og brystkassen for at få adgang til den overlegne mediastinum i den forreste thorax hulrum.Thymus skal fremstå som to blege lapper lige over hjertet. Placer buede kraftp-spidser under thymus og træk lodret for at udtrække hele organet, forhindrer fold-bagsiden af brystkassen med et par lige snævring. Derefter nedsænkes den isolerede thymus i en steril 60-milliliter fad indeholdende kold steril PBS på is og bruge en skalpel til at skære bindevæv for at adskille thymic lapper.Før transplantation, tag og vejer hver modtager mus og placere det første dyr i en side lateral liggende position med det ene øje direkte udsat for linsen af en dissekere mikroskop. Ved hjælp af Vannas saks, punktafgifter en af de isolerede thymic lapper op til en millimeter i bredden efter en zigzag mønster for at sikre, at hvert segment indeholder nogle thymic cortex og medulla væv. Det er afgørende at trimme thymus lige før implantationen som store stykker kan ikke indkapsle ordentligt.Dernæst starter i bunden af hornhinden i det kirurgiske område, skal du bruge spidsen af en 40-millimeter 18-gauge nål til at foretage et lille snit i eksterne hornhinde lag, således at spidsen af et par dissekere saks kan indføres. Brug saksen til at lave en fem til 10-millimeter flanke snit direkte omkring bunden af hornhinden, mens du bruger flade kraftbefæstet for at holde hornhinden åben for at forhindre genforsegling. Gribe den afskårne hornhinde epitel med flade-ended snævler, opretholde åbningen i hornhinden, mens du indsætter en thymic segment gennem åbningen.Det er vigtigt at indsætte thymus stykke hurtigt gennem hornhinden åbning for at forhindre spontan genseænning før vævets indført. Vær omhyggelig med at bevare vævintegritet på dette trin. Tryk blødt på øjets overflade for at skubbe det indførte vævssegment til en lateral position med hensyn til eleven for at bevare øjets funktion.Og brug flade kraftbefædre til at trykke begge sider af hornhinden åbning fast mod hinanden i tre til fem sekunder for at fremme selv-forsegling. Hvis transplantationen skal udføres på begge øjne, drej musen på den modsatte laterale side for en anden implantation som netop påvist. Når operationen er færdig, returnere musen til et tomt bur forvarmet med en varmelampe med overvågning, indtil fuld recumbency.På det relevante eksperimentelle tidspunkt skal du placere en bedøvet modtagermus på en fast fase mikroskopplatform i en side lateral liggende position på en varmepude med det ene øje vendt opad. Og sæt hovedet af musen i en stereotaxic hovedholder. Juster knappen for at fastholde musehovedet i sidestillingen side, så mikroskopets mål kan få direkte adgang til det øje, der holder thymustransplantatet, og træk øjenlågene tilbage, mens du holder øjet ved hornhindensmarginen med et par pincetspidser, der er dækket af et polyethylenrør, der er fastgjort til et UST-2 fast universalled.Tilføj et par dråber sterilt saltvand eller kunstige tårer mellem hornhinden og linsen, før du placerer 5X mikroskop mål på museøjet og finde thymus i mikroskop feltet. Skift derefter til en vandnedsænkningsgradering i højere opløsning med en lang arbejdsafstand, og vælg anskaffelsestilstanden i mikroskopsoftwaren. Start resonansscannertilstanden, og vælg XYZT-billedbehandlingstilstanden.Tænd argon laser på og justere strømmen til 30% for fluorescens excitation. Vælg en passende excitation laser linje og indstille acousto-optisk stråle splitter kontrol for de relevante emission bølgelængder ved hjælp af refleksion detektion samtidigt at opdage backscatter og til at afgrænse væv struktur. Opsaml emissionen ved den valgte bølgelængde, og angiv en opløsning på 512 gange 512 pixel.Klik derefter live for at starte billeddannelsen og justere forstærkningsniveauerne efter behov. Fokuser på toppen af det thymiske implantat, og vælg begynd at definere begyndelsen på Z-stakken. Fokuser derefter på det sidste plan i den implanterede thymus, der kan visualiseres, og vælg ende for at definere enden på Z-stakken ved hjælp af en Z-trins størrelse på fem mikrometer.Angiv tidsintervallet for anskaffelsen af hver Z-stak i 1,5 til to sekunder, og vælg indstillingen hent indtil stoppet for kontinuerlig billedbehandling. Klik derefter på Start for at initialisere optagelsen. Her, lyse felt og fluorescens billeder af det samme område af thymus implantat, der kan tjene til en dobbelt makroskopisk opfølgning af væv vækst og involution og fortsættelse undersøgelser er vist.Den lyse-felt billede letter også visualisering af vaskularisering af det implanterede væv, så den unikke undersøgelse af afhængigheden af thymus fysiologi på blodforsyning over tid. Denne model gør det muligt at visualisere celletransmigration fra blodtransmigrationen i den implanterede thymus, sporing af kontakterne mellem GFP-positive progenitorceller, der kommer ind i thymisk implantat med RFP-mærket hjemmehørende thymisk epitel og stromale celler under differentierings- og udvælgelsesprocesser, samt overvågning af de udgående immunceller fra thymusen i perifere blodkar. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at minimere væv eksponering for optimal indskrivning og også at begrænse snitstørrelse i øjet for at tillade uskadt fragment excision gennem hornhinden og samtidig reducere fibrose under heling.Efter denne procedure, andre metoder som lokaliseret kontrol behandlinger og indsnit af andre væv i det kontralaterale øje kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om immun dysfunktioner forbundet med infektioner, involution determinanter, og transplantation tolerance mekanismer. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for immunologi til at udforske T-celle udvikling, herunder stamfader rekruttering, thymus-eye dynamik, og modne T-celle udgangstrin in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time Analyser af Retinol Transport af membranen Receptor af Plasma retinolbindingsprotein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og progenitorceller Præget af Fem fluorescerende proteiner ved hjælp af konfokal og multiphoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baseret real-time PCR metoder til kvantitativ måling af microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging af Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måling stivheden af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aortas Brug Atomic force mikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...