Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) en R21ES025673 (AC), en door de beste/2015/043-subsidie (Consellería de Educació, cultura ik esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanje) (EO). Auteurs bedanken het team van de verzonden van de Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanje en Alberto Hernandez at Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanje voor hun hulp bij de video filmen en bewerken.

De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami goedgekeurd alle experimenten volgens IACUC richtlijnen.
1. isolatie en trimmen van pasgeboren Thymi
<ol><li>Bereiden alle reagentia en instrumenten door autoclaaf of andere methoden, steriele omstandigheden te waarborgen.</li>
	<li>Uitvoeren om te minimaliseren van verontreinigingen, alle chirurgische ingrepen onder de motorkap van een laminaire flow.</li>
	<li>Voorafgaand aan euthanizing donor muizen, vu...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Vanwege het belang van het rijpingsproces van de T-cel voor individuele immuun competentie4 en de vermoedelijke gevolgen van voorloper cel dynamiek op volwassen T-cellen geproduceerd door de thymus2,3, hebben uitgebreide inspanningen geïnvesteerd om alternatieven te ontwikkelen voor de aanpak van de momentopname klassieke vaste weefsel.
Hoewel weefsel segmenten en andere explantaten duidelijk superieur zijn op ...

Intrathymic differentiatie van de T-cel en T-cel populaties selectie vormen belangrijke processen voor de ontwikkeling en het onderhoud van cel-gemedieerde immuniteit in gewervelde dieren1. Dit proces omvat een complexe opeenvolging van strak georganiseerde evenementen, waaronder de aanwerving van progenitoren uit de bloedbaan, celproliferatie en migratie, differentiële expressie van membraaneiwitten en massale geprogrammeerde celdood voor subsets selectie. Het resultaat is de release van volwassen T-cellen reactieve tot een ruim spectrum van vreemde antigenen tijdens het weergeven van geminimaliseerde reacties op zelf-peptides, welke eind-up koloniseren de perifere lymfoïde organen van de afzonderlijke2,3. Afwijkende thymocyte selectie van het repertoire van de αβTCR leidt tot auto-immune ziekte of onbalans immuun4 die voornamelijk voortvloeien uit gebreken tijdens de processen van de voorloper van de negatieve of positieve selectie, respectievelijk.
Directionele migratie van thymocytes over de zwezerik is intrinsiek op alle stadia van T-cel rijping en het is bedoeld als een reeks van gelijktijdige of opeenvolgende meerdere stimuli, met inbegrip van chemokines, lijm, en de lijm extracellulaire matrix (ECM) eiwit interacties3,5. De studie van vaste weefsels heeft verricht kritische informatie over de patronen van meningsuiting voor de trekkende signalen van de thymocyte in de gedefinieerde serie microenvironments5,6, terwijl ex vivo studies is gebleken dat twee bekende trekkende gedrag van thymocytes in twee histologisch vlakken van het orgel: slow stochastic bewegingen in de cortex en snelle, beperkte beweeglijkheid in de medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. verhoogde trekkende tarieven correleren met serie positieve selectie13 en negatieve selectie wordt geassocieerd met kruipende gedrag ondersteunen de hypothese dat de kinetiek van de reis door de zwezerik juiste bepaalt rijping van de thymocytes. Ondanks hun relevantie blijven de topologie van thymocyte-stromale cellen interacties en de dynamiek van de beweeglijkheid van de thymocyte over orgel microenvironments tijdens de rijping van de T-cel vaag.
De meeste ex vivo studies tot dusver verrichte omvatten foetale of reaggregate serie orgel culturen14,15, weefsel segmenten of intact serie kwab explantaten waar thymocyte bewegingen worden gevisualiseerd door twee-foton laser scannen microscopie (TPLSM)8, een intravital beeldvormende techniek met een beperkte maximale afstand werken en imaging diepte van 1 mm overeenkomstig het weefsel onderzocht16. In tegenstelling tot de moeizame serie orgel-culturen die afhankelijk van uitgebreide incubatie keer aan formulier 3D-structuren zijn, zowel de serie segment techniek en de intact serie kwab aanpak vergunning gecontroleerd invoering van bepaalde deelverzamelingen van vooraf met het label thymocytes in een inheemse weefsel het platform omgeving. Echter, aangezien de doorbloeding is afwezig in deze modellen, ze zijn duidelijk beperkt voor het bestuderen van het recruitment proces van zwezerik afwikkeling progenitoren (TSPs) naar de thymus parenchym of de dynamiek van de serie egression van volwassen T-cellen.
In vivo modellen voor de studie van de serie T-rijping celfysiologie in muizen bevatten de transplantaties van fragmenten of gehele orgaan lobben geplaatst ofwel binnen de nier capsule17 of intradermaal18. Hoewel deze opties hun nut toonde te ondervragen systemische functionele engraftment van het weefsel, beperkt de positie van de serie transplantaten diep binnen het dier of gedekt door ondoorschijnend weefsellagen hun gebruik voor in vivo onderzoek van implantaten door TPLSM.
De voorste kamer van het oog voorziet in een gemakkelijk toegankelijke ruimte direct toezicht van een geënte weefsel op grond van de transparantie van de cornea lagen. Voordeel is de basis van de kamer gevormd door de iris rijk aan bloedvaten en autonome zenuwuiteinden, waardoor snelle revascularisatie en reinnervation van protheses19,20. Dr. Caicedo heeft deze anatomische ruimte met succes gebruikt voor het onderhoud en longitudinaal onderzoek naar alvleesklier eilandjes in de afgelopen21. Hier, laten we zien dat deze strategie vormt niet alleen een geldige benadering van thymocytes dynamiek binnen de structuur van de native orgel te studeren, maar ook uniek toelaat om uit te breiden de in vivo longitudinale opnamen naar de studie van voorlopercellen werving en rijpe T-cel egression stappen in muis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Het doel van de methode die wordt voorgesteld is om te laten zien, voor de eerste keer, van de transplantatie van pasgeboren thymi in de voorste oog kamer van isogene volwassen muizen voor in vivo longitudinale real-time bewaking van thymocytes´ dynamiek binnen een gevacuoliseerd Thymus segment. Na de transplantatie kan laser scanning microscopie (LSM) via het hoornvlies in vivo noninvasive herhaalde beeldvorming op het niveau van de cellulaire resolutie. Nog belangrijker is, de aanpak wordt toegevoegd aan eerdere intravital T-cel rijping imaging modellen de mogelijkheid voor continue progenitor cel werving en rijpe T-cel egress opnames in hetzelfde dier. Extra voordelen van het systeem zijn de transparantie van het geënte gebied, toelaat macroscopische snelle controle van de geïmplanteerde weefsels, en de toegankelijkheid van het implantaat waardoor gelokaliseerd naast systemische behandelingen. De belangrijkste beperking wordt het volume van het weefsel dat past in de beperkte ruimte van de kamer van de ogen die voor kwab trimmen eist. Integriteit van orgel wordt gemaximaliseerd door de ontrafeling van de thymus kwabben in patronen die eerder functioneel voor volwassen T-cel-productie te zien. De techniek is potentieel geschikt voor het ondervragen van een milieu van medisch relevante vragen met betrekking tot de functie van de thymus autoimmuniteit, immunodeficiëntie en centrale tolerantie; processen die mechanistically slecht gedefinieerde blijven. De fijne dissectie van mechanismen begeleiden thymocyte migratie, differentiatie en selectie moet leiden tot nieuwe therapeutische strategieën gericht op ontwikkeling T-cellen.

Thymus van pasgeboren muizen werden geïsoleerd uit B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas muizen zoals beschreven in dit protocol (stappen 1.1-1.9). In deze transgene muizen regisseert de kip bèta actine promotor de uitdrukking van de rode fluorescerende eiwit variant DsRed. MST onder invloed van de onmiddellijke vroege enhancer vergemakkelijken van het volgen van implantaten cytomegalovirus (CMV).
Om te voorkomen dat wee...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie over de mechanismen van auto-immuniteit, immunodeficiëntie, centrale tolerantie en thymus-involutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in vivo longitudinale opname van voorloper werving en volwassen T-cel uitgang binnen gevasculariseerde en geënte muis thymus segmenten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling en functie van de thymus, kan ook worden toegepast op andere weefsels zoals alvleesklier eilandjes of nierglomeruli.Om de thymus te isoleren, plaatst u de muis op steriele absorberende papieren handdoeken in de rechtopstaande rug in een laminaire stroomkap en spuit en veeg de muisbuik af met 70% ethanol. Maak een oppervlakkige V-vormige incisie in de onderbuik om de borstholte bloot te leggen en gebruik een paar rechte 10-centimeter ontleden schaar om een 0,5 tot een centimeter incisie in de borst langs de ventrale middellijn te maken. Vouw de huid over elke kant van de borst om de borstholte bloot te stellen en maak twee extra diepere 0,5 tot een centimeter laterale insnijdingen door het middenrif en de ribbenkast om toegang te krijgen tot het superieure mediastinum in de voorste borstholte.De thymus moet verschijnen als twee bleke lobben recht boven het hart. Plaats gebogen forcep-tips onder de thymus en trek verticaal om het volledige orgaan te extraheren, waardoor de vouw-back van de ribbenkast met een paar rechte tangen wordt voorkomen. Dompel vervolgens de geïsoleerde thymus onder in een steriele schaal van 60 milliliter met koude steriele PBS op ijs en gebruik een scalpel om de bindstergte te snijden om de thymische lobben te scheiden.Vóór transplantatie, tag en weeg elke ontvanger muis en plaats het eerste dier in een zijzijzij ligfiets positie met een oog direct blootgesteld aan de lens van een ontleden microscoop. Met behulp van Vannas schaar, accijns een van de geïsoleerde thymische kwabben tot een millimeter in de breedte volgens een zigzag patroon om ervoor te zorgen dat elk segment bevat een aantal thymische cortex en medulla weefsel. Het is van cruciaal belang om de thymus vlak voor de implantatie te trimmen, omdat grote stukken niet goed kunnen worden gegraveerd.Gebruik vervolgens, te beginnen bij de basis van het hoornvlies van het chirurgische gebied, het puntje van een 40-millimeter 18-meter naald om een kleine incisie in externe hoornvlieslagen te maken, zodat het puntje van een ontleedschaar kan worden geïntroduceerd. Gebruik de schaar om een vijf tot 10-millimeter flank incisie direct rond de basis van het hoornvlies te maken, terwijl het gebruik van platte tangen stevig houden het hoornvlies open om te voorkomen dat herslepen. Grijpen de gesneden hoornvlies epitheel met de flat-ended tangen, handhaven van de opening in het hoornvlies, terwijl het invoegen van een thymisch segment door de opening.Het is belangrijk om het thymusstuk snel door de hoornvliesopening te plaatsen om spontane hersluiting te voorkomen voordat het weefsel wordt geïntroduceerd. Wees voorzichtig met het behoud van weefsel integriteit bij deze stap. Druk zachtjes op het oogoppervlak om het geïntroduceerde weefselsegment naar een zijdelingse positie te schuiven ten opzichte van de pupil om de functie van het oog te behouden.En gebruik platte tangen om beide zijden van het hoornvlies stevig tegen elkaar te openen gedurende drie tot vijf seconden om zelfafdichting te bevorderen. Als de transplantatie moet worden uitgevoerd op beide ogen, zet de muis op de tegenovergestelde zijzijde voor een tweede implantatie zoals net aangetoond. Wanneer de operatie is voltooid, terug te keren naar een lege kooi voorverwarmd met een warmtelamp met monitoring tot volledige recumbency.Plaats op het juiste experimentele tijdstip een verdoofde ontvangermuis op een microscoopplatform met een vast stadium in een zijdelingse lighouding aan de zijkant op een warmtekussen met één oog naar boven gericht. En steek het hoofd van de muis in een stereotaxic hoofdhouder. Stel de knop aan om de muiskop in de zijdelingse zijpositie te beperken om directe toegang van de microscoopdoelstelling naar het oog te beperken die de thymustransplantatie vasthoudt en trek de oogleden terug terwijl u het oog op de hoornvliesmarge houdt met een paar pincet-tips die zijn bedekt met een polyethyleenbuis die is bevestigd aan een ust-2 massief gewricht.Voeg een paar druppels steriele zoute of kunstmatige tranen tussen het hoornvlies en de lens voor het plaatsen van de 5X microscoop doelstelling op de muis oog en lokaliseren van de thymus in de microscoop veld. Schakel vervolgens over naar een wateronderdompeldoelstelling met een lange werkafstand en selecteer de acquisitiemodus in de microscoopsoftware. Start de resonantiescannermodus en selecteer de XYZT-beeldmodus.Zet de argonlaser aan en pas het vermogen aan op 30% voor fluorescentie excitatie. Selecteer een geschikte excitatielaserlijn en stel de acousto-optische bundelspleetregeling in voor de juiste emissiegolflengten met behulp van reflectiedetectie om backscatter te detecteren en de weefselstructuur af te bakenen. Verzamel de emissie op de geselecteerde golflengte en stel een resolutie van 512 bij 512 pixels in.Klik vervolgens live om de beeldvorming te starten, waarbij de versterkingsniveaus zo nodig worden aangepast. Focus op de bovenkant van het thymische implantaat en selecteer beginnen om het begin van de Z stack te definiëren. Focus vervolgens op het laatste vlak in de geïmplanteerde thymus die kan worden gevisualiseerd en selecteer het einde om het einde van de Z-stack te definiëren met behulp van een Z-stap grootte van vijf micrometer.Stel het tijdsinterval voor de verwerving van elke Z-stack in voor 1,5 tot twee seconden en selecteer de optie acquire-until-stopped voor continue beeldvorming. Klik vervolgens op start om de opname te initialiseren. Hier worden heldere veld- en fluorescentiebeelden van hetzelfde gebied van het thymusimplantaat getoond die kunnen dienen voor een dubbele macroscopische follow-up van weefselgroei en involutie- en voortzettingsstudies.Het heldere veld beeld vergemakkelijkt ook visualisatie van de vascularisatie van het geïmplanteerde weefsel, waardoor de unieke studie van de afhankelijkheid van thymus fysiologie op de bloedtoevoer na verloop van tijd. Dit model maakt het mogelijk de visualisatie van celtransmigratie van de bloedstroom in de geïmplanteerde thymus, het bijhouden van de contacten tussen GFP-positieve voorlopercellen die het thymische implantaat binnenkomen met RFP-gelabelde ingezetene thymische epithealische en stromale cellen tijdens differentiatie- en selectieprocessen, evenals de monitoring van de egressieve immuuncellen van de thymus in perifere bloedvaten. Tijdens een poging deze procedure, het is belangrijk om te onthouden om weefsel blootstelling te minimaliseren voor een optimale engraftment en ook om incisie grootte in het oog te beperken ongedeerd fragment excisie door het hoornvlies, terwijl het verminderen van fibrose tijdens genezing.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals gelokaliseerde controlebehandelingen en incisie van andere weefsels in het contralaterale oog worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over immuundisfuncties in verband met infecties, involutiedeterminanten en transplantatietolerantiemechanismen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de ontwikkeling van T-cel te verkennen, inclusief de rekrutering van de voorloper, thymus-oogdynamiek en volwassen T-celuitgressiestappen in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...