Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) et R21ES025673 (AC) et par l’octroi de meilleurs/2015/043 (Consellería de Educació, cultura j’ai esport, Generalitat valenciana, Valencia, Espagne) (EO). Auteurs tiennent à remercier l’équipe envoyés à l’Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valence, en Espagne et Alberto Hernandez au Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valence, Espagne, pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage.

L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et d’institutionnels animalier a approuvé toutes les expériences conformément aux lignes directrices IACUC.
1. isolement et rasage de nouveau-né barigoule
<ol><li>Préparer tous les réactifs et les instruments par autoclavage ou d’autres méthodes, en s’assurant des conditions stériles.</li>
	<li>Pour minimiser les contaminations, effectuer toutes les interventions chirurgicales sous une hotte à flux laminaire.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

En raison de l’importance du processus de maturation des lymphocytes pour chaque compétence immunitaire4 et de l’impact présumé de dynamique cellule précurseur sur les T-cellules matures produites par le thymus2,3, des efforts considérables ont été investis pour développer des solutions de rechange à l’approche ponctuelle classique tissu fixe.
Bien que les tranches de tissus et autres explants son...

Intrathymique différenciation des lymphocytes T et sélection de sous-populations de lymphocytes T constituent des processus clés pour le développement et le maintien de l’immunité à médiation cellulaire dans les vertébrés1. Ce processus implique une séquence complexe d’événements étroitement organisés y compris le recrutement des progéniteurs de circulation sanguine, la prolifération cellulaire et migration, expression différentielle des protéines membranaires et la mort cellulaire programmée massives pour des sous-ensembles sélection. Le résultat est la libération des lymphocytes T matures réactives à un ample spectre d’antigènes étrangers tout en affichant les réponses réduites aux auto-peptides, dont fin-up coloniser les organes lymphoïdes périphériques des individuels2,3. Sélection de thymocytes aberrante du répertoire αβTCR mène à une maladie auto-immune ou de déséquilibre immunitaire4 qui dérivent principalement de défauts au cours du processus de sélection positive ou négative précurseur, respectivement.
Migration directionnelle des thymocytes dans le thymus est inhérente à tous les stades de la maturation des lymphocytes T et il est envisagé comme une série de simultanée ou séquentielle des stimuli multiples, y compris les chimiokines, adhésif, et colle la matrice extracellulaire (ECM) interactions de protéine3,5. L’étude des tissus fixés a rendu les informations essentielles concernant les modes d’expression pour les piles migrateurs thymocyte microenvironnements thymique défini5,6, tandis que des études ex vivo a révélé deux répandu les comportements migratoires des thymocytes dans deux zones distinctes sur le plan histologique de l’organe : ralentir les mouvements stochastiques dans le cortex et la motilité rapide, confinée dans le bulbe rachidien7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. augmentation taux migratoires sont en corrélation avec la sélection positive du thymus13 et une sélection négative est associé au comportement rampant supporte l’hypothèse que la cinétique du voyage à travers le thymus détermine propre maturation des thymocytes. Malgré leur importance, la topologie des interactions entre les cellules stromales-thymocyte et la dynamique de la motilité des thymocytes travers microenvironnements orgue durant la maturation des lymphocytes reste mal définie.
La plupart ex vivo études réalisées à ce jour incluent foetales ou regroupement d’organe thymique cultures14,15, tranches de tissu ou des explants de lobe thymique intacte où les mouvements de thymocytes sont visualisées par deux photons laser à balayage microscopie (TPLSM)8, une technique d’imagerie intravitale restreint maximum distance de travail et d’imagerie profondeur de 1 mm selon le tissu examiné16. Par contraste avec les cultures d’organe thymique laborieux qui dépendent du temps d’incubation prolongée pour former des structures 3D-, fois, la technique de la tranche du thymus et l’introduction de permis contrôlé approche lobe thymique intact des sous-ensembles spécifiques du pré étiquetés thymocytes dans un environnement d’architecture native de tissu. Toutefois, étant donné que le débit sanguin est absent dans ces modèles, ils sont clairement limitées pour l’étude du processus de recrutement du thymus décantation progéniteurs (FST), le parenchyme du thymus ou la dynamique de l’égression thymique des lymphocytes T matures.
In vivo modèles pour l’étude de la physiologie de la maturation lymphocytes thymique chez les souris comprennent les greffons de fragments ou lobes organe entier placés soit à l’intérieur de la capsule rénale17 ou par voie intradermique18. Bien que ces options ont montré leur utilité pour interroger systémique fonctionnelle greffe des tissus, la position des greffes thymiques profonds au sein de l’animal ou recouverts par des couches de tissu opaque limite leur utilisation pour l’examen in vivo des implants par TPLSM.
La chambre antérieure de le œil offre un espace facilement accessible pour un contrôle direct de n’importe quel tissu greffé en vertu de la transparence des couches de la cornée. D’avantage, la base de la cavité formée par l’iris est riche en vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses autonomes, permettant une revascularisation rapide et la réinnervation des greffes19,20. Dr. Caicedo a utilisé avec succès cet espace anatomique pour l’entretien et l’étude longitudinale des îlots pancréatiques dans le passé21. Ici, nous montrons que cette stratégie constitue non seulement une approche valable pour étudier la dynamique des thymocytes au sein de la structure native orgue, mais également unique permet d’étendre l' in vivo des enregistrements longitudinales à l’étude du recrutement de l’ancêtre et égression de lymphocytes T mature étapes chez la souris.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

L’objectif de la méthode présentée est de montrer, pour la première fois, la greffe du nouveau-né thymi dans le compartiment antérieur de le œil de souris adultes isogéniques pour in vivo longitudinal suivi en temps réel de thymocytes´ dynamique dans un vascularisé segment du thymus. Après la transplantation, laser, microscopie (LSM) à travers la cornée permet en vivo imagerie répétés non invasive au niveau cellulaire de la résolution. Ce qui est important, l’approche ajoute au précédente maturation des lymphocytes intravitale imagerie modèles la possibilité pour le recrutement de cellules progénitrices continu et enregistrements de sortie lymphocytes matures chez le même animal. Avantages supplémentaires du système sont la transparence de la zone greffée, permettant une surveillance rapide macroscopique des tissus implantés, et l’accessibilité à l’implant permettant localisés en plus de traitements systémiques. La principale limite est le volume du tissu qui s’inscrit dans l’espace réduit de la chambre de le œil qui exige pour que la suppression du lobe. Intégrité de l’organe est maximisée en disséquant des lobes de thymus chez les patrons déjà montrés pour être fonctionnel pour la production de lymphocytes T mature. La technique est potentiellement adaptée pour interroger un milieu de médicalement des questions liées à la fonction du thymus qui incluent l’auto-immunité, l’immunodéficience et tolérance centrale ; processus qui restent mécaniquement mal définis. La dissection fine des mécanismes guidant la sélection, la différenciation et la migration des thymocytes devrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les cellules T en développement.

Thymus des souris nouveau-nées ont été isolés de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas souris comme décrit dans le présent protocole (étapes 1.1 à 1.9). Chez ces souris transgéniques, le promoteur de l’actine beta poulet dirige l’expression de la variante de la protéine fluorescente rouge DsRed. MST sous l’influence de l’enrichisseur début immédiat de cytomégalovirus (CMV) facilitant le suivi des implants.
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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’immunologie sur les mécanismes de l’auto-immunité, l’immunodéficience, la tolérance centrale, et l’involution thymus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’enregistrement longitudinal in vivo du recrutement d’ancêtre et de l’égression mature de T-cellule dans les segments vascularisés et greffés de thymus de souris. Bien que cette méthode peut fournir un aperçu du développement et la fonction du thymus, peut également être appliquée à d’autres tissus tels que les îlots pancréatiques ou glomeruli rein.Pour isoler le thymus, placez la souris sur des serviettes en papier absorbant stériles en position verticale dorsale dans une hotte d’écoulement laminaire et vaporisez et essuyez l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol. Faire une incision superficielle en forme de V dans le bas-ventre pour exposer la cavité thoracique et utiliser une paire de ciseaux de dissecting droite de 10 centimètres pour faire une incision de 0,5 à un centimètre dans la poitrine le long de la ligne médiane ventrale. Pliez la peau de chaque côté de la poitrine pour exposer la cavité thoracique et faire deux incisions latérales plus profondes de 0,5 à un centimètre à travers le diaphragme et la cage thoracique pour accéder au mediastinum supérieur dans la cavité thoracique antérieure.Le thymus doit apparaître sous forme de deux lobes pâles juste au-dessus du cœur. Placez des pointes de force incurvées sous le thymus et tirez verticalement pour extraire l’organe complet, empêchant le repli de la cage thoracique avec une paire de forceps droits. Puis submergez le thymus isolé dans un plat stérile de 60 millilitres contenant du PBS stérile froid sur la glace et utilisez un scalpel pour couper l’isthme conjonctif pour séparer les lobes thymiques.Avant la transplantation, étiqueter et peser chaque souris receveur et placer le premier animal dans une position latérale couchée latérale avec un œil directement exposé à la lentille d’un microscope disséquant. À l’aide de ciseaux Vannas, exciser l’un des lobes thymiques isolés jusqu’à un millimètre de largeur suivant un motif de zigzag pour s’assurer que chaque segment contient du cortex thymique et du tissu médullaire. Il est essentiel de couper le thymus juste avant l’implantation car les gros morceaux peuvent ne pas se greffer correctement.Ensuite, à partir de la base de la cornée de la zone chirurgicale, utilisez la pointe d’une aiguille de calibre 18 de 40 millimètres pour faire une petite incision dans les couches externes de cornée afin que la pointe d’une paire de ciseaux disséquants puisse être introduite. Utilisez les ciseaux pour faire une incision de flanc de cinq à 10 millimètres directement autour de la base de la cornée tout en utilisant des forceps plats pour maintenir fermement la cornée ouverte pour empêcher le résealing. Saisir l’épithélium cornéen coupé avec les forceps plats, maintenir l’ouverture dans la cornée tout en insérant un segment thymique par l’ouverture.Il est important d’insérer le morceau de thymus rapidement par l’ouverture cornéenne pour empêcher le résealing spontané avant que le tissu soit introduit. Veillez à préserver l’intégrité des tissus à cette étape. Appuyez doucement sur la surface des yeux pour faire glisser le segment de tissu introduit à une position latérale par rapport à la pupille pour préserver la fonction de l’œil.Et utilisez des forceps plats pour appuyer sur les deux côtés de l’ouverture cornéenne fermement les uns contre les autres pendant trois à cinq secondes pour favoriser l’auto-scellement. Si la greffe doit être effectuée sur les deux yeux, tournez la souris sur le côté latéral opposé pour une deuxième implantation comme nous venons de le démontrer. Lorsque la chirurgie est terminée, retourner la souris dans une cage vide préchauffée à l’aide d’une lampe thermique avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement couchée.Au moment expérimental approprié, placez une souris bénéficiaire anesthésiée sur une plate-forme de microscope à stade fixe dans une position latérale couchée latérale sur un coussin chauffant avec un œil face vers le haut. Et insérez la tête de la souris dans un porte-tête stéréotaxique. Ajustez le bouton pour retenir la tête de la souris en position latérale pour permettre un accès direct de l’objectif microscope à l’œil tenant la greffe de thymus et retirez les paupières tout en tenant l’œil à la marge cornéenne avec une paire de pointes de pince à épiler recouvertes d’un tube de polyéthylène attaché à un joint universel solide UST-2.Ajouter quelques gouttes de larmes salines stériles ou artificielles entre la cornée et la lentille avant de placer l’objectif microscope 5X sur l’œil de la souris et de localiser le thymus dans le champ microscope. Passez ensuite à un objectif d’immersion d’eau à haute résolution avec une longue distance de travail et sélectionnez le mode d’acquisition dans le logiciel microscope. Démarrez le mode scanner de résonance et sélectionnez le mode d’imagerie XYZT.Allumez le laser argon et ajustez la puissance à 30% pour l’excitation de fluorescence. Sélectionnez une ligne laser d’excitation appropriée et réglez le contrôle du séparateur de faisceau acousto-optique pour les longueurs d’onde d’émission appropriées à l’aide de la détection de réflexion simultanément pour détecter la rétrocédérateur et délimité la structure tissulaire. Collecter l’émission à la longueur d’onde sélectionnée et définir une résolution de 512 par 512 pixels.Cliquez ensuite en direct pour démarrer l’imagerie, en ajustant les niveaux de gain au besoin. Concentrez-vous sur le dessus de l’implant thymique et sélectionnez commencer à définir le début de la pile Z. Ensuite, concentrez-vous sur le dernier plan du thymus implanté qui peut être visualisé et sélectionnez l’extrémité pour définir l’extrémité de la pile Z à l’aide d’une taille en z-step de cinq micromètres.Définissez l’intervalle de temps pour l’acquisition de chaque pile Z pendant 1,5 à 2 secondes et sélectionnez l’option d’acquisition jusqu’à l’arrêt pour l’imagerie continue. Cliquez ensuite pour commencer à para paraize l’enregistrement. Ici, des images de champ lumineux et de fluorescence de la même zone de l’implant thymus qui peuvent servir à un double suivi macroscopique de la croissance des tissus et des études d’involution et de continuation sont montrées.L’image de champ lumineux facilite également la visualisation de la vascularisation du tissu implanté, permettant l’étude unique de la dépendance de la physiologie du thymus sur l’approvisionnement en sang au fil du temps. Ce modèle permet la visualisation de la transmigration cellulaire du torrent sanguin dans le thymus implanté, le suivi des contacts entre les cellules progénitrices gfp-positives entrant dans l’implant thymique avec des cellules épithéliales thymiques résidentes et stromal étiquetées RFP pendant les processus de différenciation et de sélection, ainsi que la surveillance des cellules immunitaires égressives du thymus dans les vaisseaux sanguins périphériques. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de réduire au minimum l’exposition de tissu pour l’engraftment optimal et également de limiter la taille d’incision dans l’oeil pour permettre l’excision indemne de fragment par la cornée tout en réduisant la fibrose pendant la guérison.Après cette procédure, d’autres méthodes comme les traitements de contrôle localisés et l’incision d’autres tissus dans l’œil contralatéral peuvent être effectuées de façon à répondre à d’autres questions sur les dysfonctionnements immunitaires liés aux infections, les déterminants de l’involution et les mécanismes de tolérance à la transplantation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer le développement des cellules T, y compris le recrutement d’ancêtre, la dynamique thymus-oeil, et les étapes matures d’évacuation des cellules T in vivo.

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