Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-Stipendien R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) und R21ES025673 (AC) und durch die besten/2015/043-Bewilligung (Consellería de Educació, Cultura ich Esport, Generalitat Valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Autoren danken dem SENT-Team an der Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien und Alberto Hernandez am Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.

Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt die Experimente nach IACUC Richtlinien.
1. Isolierung und Trimmen des Neugeborenen Thymi
<ol><li>Bereiten Sie alle Reagenzien und Instrumente durch Autoklavieren oder andere Methoden, sterile Bedingungen zu gewährleisten.</li>
	<li>Um Verunreinigungen zu minimieren, führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter einem Laminar-Flow-Haube.</li>
	<li>Füllen Sie vor euthanizing Spender Mäuse ei...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. 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Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Aufgrund der Bedeutung der T-Zell-Reifung für individuelle immun-Kompetenz4 und die mutmaßlichen Auswirkungen der Vorläufer Zelldynamik auf Reifen T-Zellen produziert die Thymusdrüse2,3wurden umfangreiche Bemühungen investiert Alternativen zu den klassischen fixierte Gewebe Snapshot Ansatz zu entwickeln.
Obwohl Gewebe Scheiben und andere Explantaten deutlich überlegen bei der Reproduktion Gewebearchitektur...

Intrathymic T-Zell-Differenzierung und T-Zell Subpopulation Auswahl bilden wichtige Prozesse für die Entwicklung und Wartung von zellvermittelte Immunität in Wirbeltieren1. Dieser Prozess beinhaltet eine komplexe Abfolge von straff organisierten Veranstaltungen, einschließlich der Rekrutierung von Vorfahren aus Blut, Zell-Proliferation und Migration, differentielle Expression der Membranproteine und massive programmierten Zelltod für Teilmengen Auswahl. Das Ergebnis ist die Freisetzung von Reifen T-Zellen reagiert auf eine ausreichend Bandbreite an fremde Antigene während der Anzeige minimierter Antworten auf selbst-Peptide, welche enden besiedeln die peripheren lymphatischen Organen der einzelnen2,3. Aberranten Thymocyte Auswahl des Repertoires αβTCR führt zur Autoimmunerkrankung oder immun Ungleichgewicht4 , die vor allem von Mängeln während der Prozesse des negativen oder positiven Vorläufer Auswahl bzw. abgeleitet werden.
Gerichtete Migration von Thymozyten in den Thymus ist untrennbar mit allen Phasen der T-Zell-Reifung und es ist geplant als eine Reihe von gleichzeitige oder sequentielle mehrere Reize, einschließlich Chemokine, Klebstoff, und de-Kleber extrazellulären Matrix (ECM) Protein-Interaktionen3,5. Die Studie von festen Geweben hat wiedergegeben, kritische Informationen über die Muster des Ausdrucks für Thymocyte wandernden Cues in definierten zebrafischembryonen Mikroumgebungen5,6, während Ex-Vivo -Studien ergab zwei weit verbreitet wandernde Verhalten der Thymozyten in zwei histologisch verschiedene Bereiche der Orgel: langsame stochastische Bewegungen im Kortex und schnelle, engen Motilität in der Medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. erhöhte wandernden Preise korrelieren mit zebrafischembryonen Positivauswahl13 und negative Auslese krabbelverhalten unterstützen die Hypothese, dass die Kinetik der Reise durch die Thymusdrüse richtig bestimmt zugeordnet ist Reifung der Thymozyten. Trotz ihrer Relevanz bleiben die Topologie des Thymocyte Stromazellen Zell-Interaktionen und die Dynamik der Thymocyte Motilität über Orgel Mikroumgebungen während der T-Zell-Reifung nicht ausreichend geregelt.
Die meisten ex Vivo -Studien durchgeführt, um Datum gehören fetalen oder reaggregate zebrafischembryonen Orgel Kulturen14,15, Gewebe-Scheiben oder intakte zebrafischembryonen Lappen Explantaten wo Thymocyte Bewegungen von zwei-Photonen-Laser-scanning visualisiert werden Mikroskopie (TPLSM)8, untersucht ein intravitalen bildgebendes Verfahren mit einem eingeschränkten Maximum Arbeitsabstand und imaging-Tiefe von 1 mm im Einklang mit dem Gewebe16. Im Gegensatz zu den mühsamen zebrafischembryonen Orgel Kulturen die längere Inkubationszeiten zu 3D-Strukturen abhängen, vorab mit der Bezeichnung zebrafischembryonen Slice-Technik sowohl die intakte zebrafischembryonen Lappen Ansatz Genehmigung kontrolliert Einführung von bestimmten Teilmengen von Thymozyten in einer nativen Gewebe Architektur Umgebung. Jedoch fehlt da Blutfluss ist in diesen Modellen sind sie für das Studium des Recruiting-Prozesses der Thymus Ansiedlung Stammväter (FDA), Thymus Parenchym oder die Dynamik von zebrafischembryonen heraustreten von Reifen T-Zellen deutlich begrenzt.
In-Vivo -Modelle für das Studium der zebrafischembryonen T-Zell-Reifung-Physiologie in den Mäusen gehören die Transplantate Fragmente oder ganze Organ Lappen gelegt, entweder innerhalb der Niere Kapsel17 oder mikrodialysemembranen18. Obwohl sich diese Optionen ihre Nützlichkeit, systemische funktionale Engraftment des Gewebes zu befragen, schränkt die Position des zebrafischembryonen Transplantate tief in das Tier oder durch undurchsichtige Gewebeschichten ihre Verwendung zur in-Vivo -Untersuchung von Implantaten durch TPLSM.
Die Vorderkammer des Auges bietet eine leicht zugängliche Raum zur direkten Überwachung der transplantierten Gewebe aufgrund der Transparenz der Hornhaut Schichten. Von Vorteil ist die Basis der Kammer durch die Iris gebildet reich an Blutgefäßen und autonomen Nervenendigungen, ermöglicht rasche Revaskularisation und Reinnervation der Transplantate19,20. Dr. Caicedo wurde erfolgreich diesen anatomischen Raum für die Wartung und Längsschnittstudie des Pankreas Inseln in den letzten21verwendet. Hier zeigen wir, dass diese Strategie nicht nur einen gültigen Ansatz ist um Thymozyten Dynamik innerhalb der nativen Orgel-Struktur zu studieren, sondern auch eindeutig erlaubt, um die in Vivo längs Aufnahmen zum Studium der Stammvater Rekrutierung zu erweitern und Reife T-Zell-heraustreten Schritte bei der Maus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Die vorgestellte Methode soll zeigen, zum ersten Mal die Transplantation von Neugeborenen Thymi in die vorderen Auge Kammer isogenen Erwachsener Mäuse für in Vivo längs Echtzeit-Überwachung der Thymocytes´ Dynamik innerhalb einer vaskularisierte Thymus-Segment. Nach der Transplantation kann Laser-scanning-Mikroskopie (LSM) durch die Hornhaut in Vivo nicht-invasive wiederholte Bildgebung auf zelluläre Auflösung Ebene. Wichtig ist, verleiht der Ansatz vorherigen intravitalen T-Zell-Reifung imaging-Modelle die Möglichkeit für die kontinuierliche Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg-Aufnahmen im gleichen Tier. Weitere Vorteile des Systems sind die Transparenz der transplantierten Bereich makroskopische schnelle Überwachung des implantierten Gewebes, bei schönem und der Zugriff auf das Implantat, so dass für lokalisierte neben systemischen Behandlungen. Die Haupteinschränkung wird das Volumen des Gewebes, das passt im reduzierten Raum der Auge Kammer die Forderungen nach Lappen trimmen. Orgel-Integrität wird maximiert durch Sezieren Thymus Lappen in den Mustern, die zuvor gezeigt, dass funktional für Reife T-Zell-Produktion. Die Technik eignet sich möglicherweise um ein Milieu der medizinisch relevanten Fragen im Zusammenhang mit Thymus-Funktion zu verhören, die Autoimmunität, Immunschwäche und zentrale Toleranz enthalten; Prozesse, die mechanisch schlecht definierten bleiben. Die feinere Zerlegung des Mechanismen führen Thymocyte Migration, Differenzierung und Auswahl sollte für neue therapeutische Strategien zielen entwickelnde T-Zellen führen.

Thymus von Neugeborenen Mäusen wurden isoliert von B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas Mäuse wie in diesem Protokoll (Schritte 1.1-1.9) beschrieben. In diesen transgenen Mäusen leitet Huhn Beta-Actin Promotor den Ausdruck der roten fluoreszierenden Proteins Variante DsRed. MST unter dem Einfluss von unmittelbaren frühen Enhancer Cytomegalovirus (CMV) Erleichterung der Verfolgung von Implantaten.
Zu verhindern Gewebe ...

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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie über die Mechanismen der Autoimmunität, Immunschwäche, zentrale Toleranz und Thymus-Involution zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie in vivo Längsaufzeichnung von VorläuferRekrutierung und reife T-Zell-Egression in vaskularisierten und transplantierten Maus-Thymus-Segmenten ermöglicht. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Entwicklung und Funktion des Thymus geben kann, kann auch auf andere Gewebe wie Pankreasinseln oder Nierenglomeruli angewendet werden.Um den Thymus zu isolieren, legen Sie die Maus auf sterile saugfähige Papierhandtücher in der dorsalen aufrechten Position in einer laminaren Durchflusshaube und sprühen und wischen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol ab. Machen Sie einen oberflächlichen V-förmigen Schnitt im Unterbauch, um die Brusthöhle freizulegen, und verwenden Sie ein Paar gerade 10-Zentimeter-Sezieren der Schere, um einen 0,5 bis 1 Zentimeter großen Schnitt in der Brust entlang der ventralen Mittellinie zu machen. Falten Sie die Haut über jede Seite der Brust, um die Brusthöhle freizulegen, und machen Sie zwei zusätzliche tiefere 0,5 bis ein Zentimeter seitliche Einschnitte durch das Zwerchfell und den Rippenkäfig, um auf das überlegene Mediastinum in der vorderen Brusthöhle zuzugreifen.Der Thymus sollte als zwei blasse Lappen direkt über dem Herzen erscheinen. Legen Sie gekrümmte Kraftspitzen unter den Thymus und ziehen Sie vertikal, um das komplette Organ zu extrahieren, wodurch das Faltenrücken des Brustkorbs mit einem Paar gerader Zange verhindert wird. Dann tauchen Sie den isolierten Thymus in eine sterile 60-Milliliter-Schale mit kaltem sterilem PBS auf Eis und schneiden Sie den Bindegang, um die Thymianlappen zu trennen, mit einem Skalpell.Vor der Transplantation jede Empfängermaus markieren und wiegen und das erste Tier in eine seitliche Liegeposition mit einem Auge legen, das direkt der Linse eines Sezierendes Mikroskops ausgesetzt ist. Mit der Vannas-Schere, verbrauchen Sie einen der isolierten thymischen Lappen bis zu einem Millimeter in der Breite nach einem Zickzack-Muster, um sicherzustellen, dass jedes Segment enthält einige thymische Kortex und Medulla Gewebe. Es ist wichtig, den Thymus direkt vor der Implantation zu trimmen, da große Stücke nicht richtig eingraviert werden können.Als nächstes, beginnend an der Basis der Hornhaut des Operationsbereichs, verwenden Sie die Spitze einer 40-Millimeter 18-Spur-Nadel, um einen kleinen Schnitt in externe Hornhautschichten zu machen, so dass die Spitze einer Sezierenderin eingeführt werden kann. Verwenden Sie die Schere, um einen Fünf- bis 10-Millimeter-Flankenschnitt direkt um die Basis der Hornhaut zu machen, während Sie flache Zangen verwenden, um die Hornhaut fest offen zu halten, um eine Erneutversiegelung zu verhindern. Das geschnittene Hornhautepithel mit den flach endenen Zangen greifen, die Öffnung in der Hornhaut beibehalten, während sie ein thymisches Segment durch die Öffnung einfügen.Es ist wichtig, das Thymusstück schnell durch die Hornhautöffnung einzufügen, um eine spontane Wiederversiegelung vor dem Einleiten des Gewebes zu verhindern. Achten Sie darauf, die Gewebeintegrität in diesem Schritt zu bewahren. Drücken Sie sanft auf die Augenoberfläche, um das eingeführte Gewebesegment in eine seitliche Position in Bezug auf die Pupille zu schieben, um die Funktion des Auges zu erhalten.Und verwenden Sie flache Zangen, um beide Seiten der Hornhautöffnung drei bis fünf Sekunden lang fest gegeneinander zu drücken, um die Selbstversiegelung zu fördern. Wenn die Transplantation an beiden Augen durchgeführt werden soll, drehen Sie die Maus auf die gegenüberliegende Seitenseite für eine zweite Implantation, wie gerade gezeigt. Wenn die Operation abgeschlossen ist, kehren Sie die Maus in einen leeren Käfig zurück, der mit einer Wärmelampe mit Überwachung bis zur vollständigen Reemumbency vorgewärmt ist.Platzieren Sie zum entsprechenden versuchsmäßigen Zeitpunkt eine anästhesierte Empfängermaus auf einer mikroskopischen Plattform mit fester Bühne in einer seitlichen Liegeposition auf einem Heatpad mit einem Auge nach oben. Und setzen Sie den Kopf der Maus in einen stereotaxic Kopfhalter. Stellen Sie den Knopf ein, um den Mauskopf in der seitlichen Seitenposition zurückzuhalten, um den direkten Zugang des Mikroskopobjektivs zum Auge zu ermöglichen, das das Thymustransplantat hält, und ziehen Sie die Augenlider zurück, während Sie das Auge am Hornhautrand mit einem Paar Pinzettspitzen halten, die von einem Polyethylenrohr bedeckt sind, das an einem festen Gelenk gelenk UST-2 befestigt ist.Fügen Sie ein paar Tropfen steriler Saline oder künstlicher Risse zwischen der Hornhaut und der Linse hinzu, bevor Sie das 5X-Mikroskopobjektiv auf das Mausauge legen und den Thymus im Mikroskopfeld lokalisieren. Wechseln Sie dann zu einem höher auflösenden Wassertauch-Tauchziel mit einem langen Arbeitsabstand und wählen Sie den Erfassungsmodus in der Mikroskopsoftware aus. Starten Sie den Resonanzscanner-Modus und wählen Sie den XYZT-Bildmodus aus.Schalten Sie den Argonlaser ein und stellen Sie die Leistung für die Fluoreszenzerregung auf 30 % ein. Wählen Sie eine geeignete Anregungslaserlinie aus und stellen Sie die akusto-optische Strahlteilersteuerung für die entsprechenden Emissionswellenlängen ein, indem Sie gleichzeitig Reflexionserkennung verwenden, um Rückstreuung zu erkennen und die Gewebestruktur abzuschrägen. Sammeln Sie die Emission bei der gewählten Wellenlänge und legen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln fest.Klicken Sie dann auf live, um die Bildgebung zu starten, und passen Sie die Verstärkungsstufen bei Bedarf an. Konzentrieren Sie sich auf die Oberseite des Thymianimplantats und wählen Sie beginnen, den Anfang des Z-Stacks zu definieren. Konzentrieren Sie sich dann auf die letzte Ebene im implantierten Thymus, die visualisiert werden kann, und wählen Sie Ende aus, um das Ende des Z-Stacks mit einer Z-Schrittgröße von fünf Mikrometern zu definieren.Legen Sie das Zeitintervall für die Erfassung jedes Z-Stacks für 1,5 bis zwei Sekunden fest, und wählen Sie die Option Acquire-until-Stopped für die kontinuierliche Bildgebung aus. Klicken Sie dann auf Starten, um die Aufzeichnung zu initialisieren. Hier werden Hellfeld- und Fluoreszenzbilder aus dem gleichen Bereich des Thymusimplantats gezeigt, die für eine doppelte makroskopische Nachbeobachtung von Gewebewachstum und Involution- und Fortsetzungsstudien dienen können.Das Hellfeldbild erleichtert auch die Visualisierung der Vaskularisation des implantierten Gewebes und ermöglicht die einzigartige Untersuchung der Abhängigkeit der Thymusphysiologie von der Blutversorgung im Laufe der Zeit. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung der Zelltransmigration aus dem Blutstrom in den implantierten Thymus, die Verfolgung der Kontakte zwischen GFP-positiven Vorläuferzellen, die in das Thymianimplantat mit RFP-markierten ansässigen Thythel- und Stromalzellen während differenzierungs- und Selektionsprozessen eindringen, sowie die Überwachung der egressiven Immunzellen aus dem Thymusmus in periphere Blutgefäße. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gewebeexposition für eine optimale Engraftmentierung zu minimieren und auch die Schnittgröße im Auge zu begrenzen, um eine unversehrte Fragmentexzision durch die Hornhaut zu ermöglichen und gleichzeitig die Fibrose während der Heilung zu reduzieren.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie lokalisierte Kontrollbehandlungen und das Einschnitten anderer Gewebe in das kontralaterale Auge durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über Immunfunktionsstörungen im Zusammenhang mit Infektionen, Involution-Determinanten und Transplantationstoleranzmechanismen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Entwicklung von T-Zellen zu erforschen, einschließlich Derrekrutierung von Vorläufern, Thymus-Augen-Dynamik und reifen T-Zell-Egressionsschritten in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

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Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

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Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

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