Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) ו R21ES025673 (AC), ועל ידי המענק הטוב/2015/043 (Consellería de Educació, קולטורה אני esport, Generalitat valenciana, ולנסיה, ספרד) (EO). מחברים להודות לצוות שנשלחו אוניברסיטת ולנסיה דה Católica סן ויסנטה Mártir, ולנסיה, ספרד ו אלברטו הרננדז-סנטרו דה Investigación פרינסיפה פליפה, ולנסיה, ספרד על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה.

טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים בהתאם להנחיות IACUC.
1. בידוד וגיזום של היילוד Thymi
<ol><li>להכין כל ריאגנטים שעוצבו על-ידי autoclaving או בשיטות אחרות, הבטחת בתנאים סטריליים.</li>
	<li>כדי למזער את מציג, לבצע כל הניתוחים תחת תא למינארי.</li>...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

בשל החשיבות של תהליך ההבשלה T-cell עבור הפרט כשירות המערכת החיסונית4 ואת ההשפעה המשוער של קודמן תא dynamics על תאי-T בוגרים המיוצר על ידי בלוטת התימוס2,3, הושקעו מאמצים נרחבים לפתח חלופות הגישה בזק קלאסי רקמות קבוע.
למרות פרוסות רקמות ו exp...

Intrathymic T-cell בידול ובחירה subpopulation T-cell מהווים מפתח תהליכים פיתוח ותחזוקה של חסינות תאית חולייתנים1. תהליך זה דורש רצף אירועים מאורגנים היטב כולל הגיוס של אבות למחזור הדם, התפשטות תאים, הגירה, ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני ממברנה ולאחר מות תאים מתוכנת מסיבית קבוצות משנה מורכבים מבחר. התוצאה היא שחרורו של T תאים בוגרים תגובתי ספקטרום נרחב של אנטיגנים זרים תוך הצגת תגובות ממוזער העצמי-פפטידים, אשר מקצה את colonizing איברי הלימפה ההיקפית של הפרט2,3. Thymocyte סוטה ממבחר הרפרטואר αβTCR מוביל מחלות אוטואימוניות או חוסר איזון מערכת החיסון4 הנובעות בעיקר פגמים במהלך תהליכי בחירה קודמן חיובית או שלילית, בהתאמה.
כיווני ההגירה של thymocytes מעבר התימוס הוא מהותי בכל שלבי ההבשלה T-cell וזה וליטוש סדרת בו זמנית, או רציף גירויים מרובים, כולל נוגדנים, דבק, ודה-דבק מטריצה חוץ-תאית (ECM) אינטראקציות חלבון3,5. המחקר של רקמות קבוע יש מעובד מידע חיוני לגבי דפוסי ביטוי למקלות נודדות thymocyte microenvironments הרתי מוגדר5,6, בעוד מחקרים לשעבר vivo חשף שתי שכיחה התנהגויות הנדידה של thymocytes בשני תחומים ברורים בהיסטולוגיה איבר: להאט תנועות סטוכסטי בקליפת תנועתיות מהר, סגור לשד7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. תעריפי הנדידה הגדילו לתאם עם הבחירה חיובי הרתי13 והיא שלילית הבחירה קשורה עם אופן פעולה של סריקה התומכים את ההשערה כי קינטיקה של המסע דרך בלוטת התימוס קובע נכונה ההבשלה של thymocytes. למרות הרלוונטיות שלהם, את הטופולוגיה של אינטראקציות תא thymocyte-סטרומה את הדינמיקה של תנועתיות thymocyte על פני איברים microenvironments במהלך ההבשלה T-cell עדיין מעורפל.
רוב שמחוץ מחקרים שבוצעו עד כה כוללים עוברית או reaggregate איברים הרתי תרבויות14,15, רקמות פרוסות או שלמים האונה הרתי explants איפה thymocyte תנועות הם דמיינו ידי סריקת לייזר שני הפוטונים מיקרוסקופ (TPLSM)8, טכניקת דימות intravital עם מקסימום מוגבלת לעבוד מרחוק והדמיה בעומק של 1 מ"מ בהתאם הרקמה בחן16. לעומת התרבויות איברים הרתי מפרך התלויות דגירה ממושכת פעמים טופס 3D-מבנים, הן, הטכניקה פרוסה הרתי והן המבוא היתר מבוקר ללא פגע באונה הרתי גישה של קבוצות משנה מסוימת של מראש הנקרא thymocytes לתוך סביבה אדריכלות רקמה מקורית. עם זאת, כיוון זרימת הדם הוא נעדר במודלים אלה, הם מוגבלים בבירור ללמוד בתהליך הגיוס של בלוטת התימוס להתיישב אבות (TSPs) parenchyma התימוס או את הדינמיקה של הרתי egression של תאי-T בוגרים.
In vivo הדגמים לצורך המחקר לפיזיולוגיה ההבשלה T-cell הרתי בעכברים כוללים את השתלים של חלקים או אונות האיבר כולו למקם בתוך הכליה קפסולה17 או intradermally18. למרות אפשרויות אלה הראה השירות שלהם לחקור מערכתית engraftment תפקודית של הרקמה, המיקום של שתלי הרתי עמוק בתוך החיה או מכוסה על ידי שכבות של רקמות אטום מגבילה את השימוש בהם ב- vivo בדיקה של שתלים על ידי TPLSM.
התא הקדמי של העין מספק שטח נגיש עבור פיקוח ישיר על כל רקמות המושתל בשל השקיפות של שכבות הקרנית. יתרון, הבסיס של תא הנוצרת על-ידי הקשתית הוא עשיר כלי הדם ואת קצות העצבים האוטונומית, הפעלת revascularization מהירה reinnervation מתוך19,שתלי20. ד ר Caicedo השתמשה בהצלחה את המרחב האנטומי הזה עבור תחזוקה ומחקר אורך של לנגרהנס העבר21. . הנה, אנחנו מראים כי אסטרטגיה זו לא רק מהווה גישה חוקית בחקר הדינמיקה של thymocytes בתוך מבנה איבר מקורי, אך גם באופן ייחודי מאפשר להרחיב ויוו הקלטות האורך במחקר של קדמון גיוס ו שלבים egression של T-cell בוגרת עכבר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

מטרת השיטה שהוצגו היא להראות, בפעם הראשונה, את ההשתלה של היילוד thymi אל החדר העין הקדמי של עכברים בוגרים isogenic לניטור ויוו האורך בזמן אמת של הדינמיקה thymocytes´ בתוך vascularized קטע בלוטת התימוס. בעקבות ההשתלה, סריקת מיקרוסקופ (LSM) דרך הקרנית לייזר מאפשר ויוו לא פולשנית חוזרות הדמיה ברמת רזולוציה הסלולר. חשוב, הגישה מוסיף הקודם ההבשלה T-cell intravital הדמיה מודלים האפשרות עבור גיוס תא קדמון רציפה והקלטות בוגרת T-cell היציאה של אותה חיה. יתרונות נוספים של המערכת השקיפות של האזור המושתל, המתיר ניטור מהיר מאקרוסקופית של הרקמה מושתל, הנגישות השתל המאפשר לשפות אחרות בנוסף טיפולים סיסטמיים. המגבלה העיקרית להיות בנפח של הרקמה זה מתאים במרחב מופחתת של תא העין אשר דורש עבור זמירה האונה. שלמות איבר מוגדל על ידי לנתח אונות בלוטת התימוס בדפוסי בעבר הוכח להיות פונקציונלי לייצור תא T בוגרים. הטכניקה מתאימה באופן פוטנציאלי לחקור וחשש רלוונטי שאלות הקשורות לתפקוד בלוטת התימוס הכוללים מחלת חיסון עצמי, כשל חיסוני וסובלנות המרכזית; תהליכים אשר יישארו מוגדרים mechanistically לקוי. ניתוח מנגנוני המנחה thymocyte ההעברה, בידול ובחירה בסדר אמור להוביל הרומן אסטרטגיות טיפוליות מיקוד מתפתחות בתאי T.

התימוס של היילוד עכברים הם בודדו אותנו מהמתרחש B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/ג'ס עכברים כפי שמתואר פרוטוקול זה (שלבים 1.1-1.9). באלה העכברים הטרנסגניים, עוף ביתא אקטין האמרגן מנחה את הביטוי של variant חלבון פלואורסצנטי אדום DsRed. MST תחת השפעת cytomegalovirus (CMV) מיידית מוקדם משפר להקל על המעקב של ?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה על מנגנוני חסינות אישית, כשל חיסוני, סובלנות מרכזית, ו involution התימוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הקלטה אורך vivo של גיוס אב ואגרסיה בוגרת של תאי T בתוך מקטעי התימוס של העכבר כלי דם מושתלים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על ההתפתחות והתפקוד של התימוס, ניתן להחיל גם על רקמות אחרות כגון איים בלבלב או גלומרולי כליות.כדי לבודד את התימוס, מניחים את העכבר על מגבות נייר סטריליות סופגות בתמונת הגב זקוף במכסה המנוע לזרימה למינארית ומרססים ומנגבים את בטן העכבר עם 70% אתנול. בצע חתך שטחי בצורת V בבטן התחתונה כדי לחשוף את חלל בית החזה ולהשתמש בזוג מספריים ישרים של 10 ס"מ כדי לבצע חתך של 0.5 עד סנטימטר בחזה לאורך קו האמצע הגחוני. מקפלים את העור על כל צד של החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה ולעשות שני חתכים נוספים עמוקים יותר 0.5 עד סנטימטר צדדי דרך הסרעפת וכלוב הצלעות כדי לגשת mediastinum מעולה בחלל בית החזה לפני.התימוס צריך להופיע כשתי אונות חיוורות ממש מעל הלב. מניחים קצות כף מעוקל מתחת התימוס ולמשוך אנכית כדי לחלץ את האיבר המלא, מניעת מתקפל האחורי של בית החזה עם זוג מדפים ישר. ואז להטביע את התימוס המבודד בצלחת סטרילית 60 מיליליטר המכיל PBS סטרילי קר על קרח ולהשתמש אזמל לחתוך את isthmus החיבור להפריד את האונות התימית.לפני ההשתלה, תיייגו ושקלו כל עכבר נמען והמקמו את החיה הראשונה בתמקום צדדית צדדית עם עין אחת החשופה ישירות לעדשה של מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות מספריים Vannas, בלו אחת האונות התימית מבודדת עד מילימטר אחד ברוחב בעקבות דפוס זיגזג כדי להבטיח כי כל קטע מכיל כמה קליפת המוח התימית רקמת medulla. זה קריטי לקצץ את התימוס ממש לפני ההשתלה כמו חתיכות גדולות לא יכול חריטה כראוי.לאחר מכן, החל בבסיס הקרנית של האזור הכירורגי, להשתמש בקצה של מחט 40 מילימטר 18-מד כדי להפוך חתך קטן לתוך שכבות קרנית חיצונית, כך קצה של זוג מספריים לנתח ניתן להציג. השתמש במספריים כדי לבצע חתך אגף של חמישה עד 10 מילימטרים ישירות סביב בסיס הקרנית תוך שימוש בממטרים שטוחים כדי להחזיק בחוזקה את הקרנית פתוחה כדי למנוע חתך מחדש. אוחזים באפיתל הקרנית החתך עם המדפים השטוחים, שומרים על הפתח בקרנית תוך החדרת קטע תימין דרך הפתח.חשוב להכניס את חתיכת התימוס במהירות דרך פתח הקרנית כדי למנוע ניתוח מחדש ספונטני לפני הרקמה של הציג. היזהר לשמור על שלמות הרקמות בשלב זה. לחץ בעדינות על משטח העין כדי להחליק את קטע הרקמה שהוצג למיקום בצד השני ביחס לתלמיד כדי לשמר את תפקוד העין.ולהשתמש במקלחים שטוחים כדי ללחוץ על שני צידי פתח הקרנית בחוזקה אחד נגד השני במשך שלוש עד חמש שניות כדי לקדם איטום עצמי. אם ההשתלה תבוצע בשתי העיניים, סובבו את העכבר לצד הצדדי הנגדי להשתלה שנייה כפי שהודגם זה הרגע. לאחר השלמת הניתוח, החזירו את העכבר לכלוב ריק מחומם מראש עם מנורת חום עם ניטור עד לחזרה מלאה.בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, מניחים עכבר נמען הרדמה על פלטפורמת מיקרוסקופ בשלב קבוע בתמקמה צדדית צדדית על כרית חום עם עין אחת פונה כלפי מעלה. ולהכניס את ראש העכבר למחזיק ראש סטריאטוקסי. כוונן את הידית כדי לרסן את ראש העכבר בתצורת הצד הצדדית כדי לאפשר גישה ישירה של מטרת המיקרוסקופ לעין המחזיקה את שתל התימוס ולמשוך לאחור את העפעפיים תוך החזקת העין בשולי הקרנית עם זוג קצות פינצטה מכוסים בצינור פוליאתילן המחובר למפרק אוניברסלי מוצק UST-2.מוסיפים כמה טיפות של תמיסת מלח סטרילית או קרעים מלאכותיים בין הקרנית לעדשה לפני הנחת מטרת המיקרוסקופ 5X על עין העכבר ולאתר את התימוס בשדה המיקרוסקופ. לאחר מכן עבור למטרת טבילת מים ברזולוציה גבוהה יותר עם מרחק עבודה ארוך ובחר את מצב הרכישה בתוכנת המיקרוסקופ. הפעל את מצב סורק תהודה ובחר במצב דימות XYZT.הפעל את לייזר ארגון ולהתאים את הכוח ל 30% עבור גירוי פלואורסצנטי. בחר קו לייזר גירוי מתאים ולהגדיר את בקרת מפצל קרן acousto-אופטי עבור אורכי גל פליטה המתאימים באמצעות זיהוי השתקפות בו זמנית כדי לזהות backscatter ולתווה מבנה רקמות. אסוף את הפליטה באורך הגל שנבחר והגדר רזולוציה של 512 על 512 פיקסלים.לאחר מכן לחץ על בשידור חי כדי להתחיל את ההדמיה, התאמת רמות הרווח לפי הצורך. התמקד בחלק העליון של השתל התימי ובחר להתחיל להגדיר את תחילת מחסנית Z. לאחר מכן התמקדו במישור האחרון בתימוס המושתל שניתן לדמיין ולבחור קצה כדי להגדיר את קצה מחסנית Z באמצעות גודל Z-צעד של חמישה מיקרומטרים.הגדר את מרווח הזמן לרכישת כל מחסנית Z למשך 1.5 עד שתי שניות ובחר באפשרות רכישה עד להפסקה להדמיה רציפה. לאחר מכן לחץ על התחל לאתחל את ההקלטה. כאן, תמונות שדה בהיר פלואורסצנטי של אותו אזור של שתל התימוס שעשוי לשמש מעקב מקרוסקופי כפול של צמיחת רקמות, involution ומחקרי המשך מוצגים.התמונה השדה הבהיר גם מקלה על הדמיה של כלי הדם של הרקמה המושתלת, ומאפשרת את המחקר הייחודי של התלות של פיזיולוגיית התימוס באספקת הדם לאורך זמן. מודל זה מאפשר הדמיה של גלגול תאים מבול הדם לתוך התימוס המושתל, מעקב אחר המגעים בין תאי הצאצאים החיוביים של GFP הנכנסים לשתל התימי עם תאי אפיתל וסטרומליים תושבים בעלי תווית RFP במהלך תהליכי בידול ובחירה, כמו גם ניטור של תאי החיסון האלקטרוניים מהתימוס לכלי דם היקפיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את החשיפה לרקמות עבור חריטה אופטימלית וגם להגביל את גודל החתך בעין כדי לאפשר כריתת שבר ללא פגע דרך הקרנית תוך הפחתת פיברוזיס במהלך הריפוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיפולי בקרה מקומיים וחתך של רקמות אחרות לתוך העין ההמולתית כדי לענות על שאלות נוספות על תפקוד לקוי של מערכת החיסון הקשורות לזיהומים, גורמים נוגדי נדיפה ומנגנוני סובלנות להשתלה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את התפתחות תאי T, כולל גיוס אבי התיעוב, דינמיקת עין התימוס, וצעדי יציאה בוגרים של תאי T ב-vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...