Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

इस काम को NIH पलाश R56DK084321 (AC) ने सपोर्ट किया था, R01DK084321 (एसी), R01DK111538 (एसी), R01DK113093 (एसी), और R21ES025673 (एसी), और द्वारा सर्वश्रेष्ठ/2015/043 अनुदान (Consellería de Educació, cultura मैं esport, Generalitat valenciana, वालेंसिया, स्पेन) (ईओ) । लेखक अल्बर्टो de Hernandez Centro Investigación, वालेंसिया, स्पेन में Universidad Católica de वालेंसिया San विसेंट Mártir, वालेंसिया, स्पेन और Príncipe फेलिप पर भेजा टीम धंयवाद वीडियो फिल्माने और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए ।

विश्वविद्यालय मियामी के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी ।
1. अलगाव और नवजात Thymi की छंटनी
<ol><li>autoclaving या अन्य तरीकों से, बाँझ स्थितियो?...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

व्यक्तिगत प्रतिरक्षा क्षमता4 के लिए टी सेल परिपक्वता प्रक्रिया के महत्व और परिपक्व टी-थाइमस द्वारा उत्पादित कोशिकाओं पर अग्रदूत सेल गतिशीलता के माना प्रभाव के कारण2,3, व...

Intrathymic टी-सेल विभेद और टी सेल उप जनसंख्या चयन रीढ़1में कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा के विकास और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का गठन । इस प्रक्रिया में खून से progenitors की भर्ती, सेल प्रसार और प्रवास, झिल्ली प्रोटीन की विभेदक अभिव्यक्ति, और सबसेट के लिए बड़े पैमाने पर क्रमादेशित सेल मौत सहित कसकर संगठित घटनाओं के एक जटिल अनुक्रम शामिल चयन. परिणाम परिपक्व टी की रिहाई के लिए विदेशी प्रतिजनों के एक पर्याप्त स्पेक्ट्रम के लिए प्रतिक्रियाशील है जबकि स्वयं पेप्टाइड्स, जो अंत तक व्यक्तिगत2,3के परिधीय लसीकावत् अंगों बस्तियां के लिए कम प्रतिक्रियाओं प्रदर्शित । αβTCR प्रदर्शनों की ंयायपालिका thymocyte चयन स्व-प्रतिरक्षित रोग या प्रतिरक्षा असंतुलन4 कि मुख्य रूप से नकारात्मक या सकारात्मक प्रणेता चयन की प्रक्रिया के दौरान दोषों से प्राप्त करने के लिए सुराग, क्रमशः ।
थाइमस भर thymocytes के दिशात्मक प्रवास टी के सभी चरणों के लिए आंतरिक है-सेल परिपक्वता और यह एक साथ की एक श्रृंखला के रूप में परिकल्पना की है, या अनुक्रमिक एकाधिक उत्तेजनाओं, सहित chemokines, चिपकने वाला, और de-चिपकने वाला extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन इंटरैक्शन3,5. फिक्स्ड ऊतकों के अध्ययन में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की गई है thymocyte प्रवासी cues के लिए अभिव्यक्ति के पैटर्न के बारे में परिभाषित thymic microenvironments5,6, जबकि पूर्व vivo अध्ययन दो प्रचलित पता चला है दो histologically में thymocytes के प्रवासी व्यवहार अंग के विशिष्ट क्षेत्रों: प्रांतस्था और तेज, गतिशीलता7,8,9,10 में सिमटा मज्जा में धीमी गति से stochastic आंदोलनों , 11 , 12 , 13. बढ़ी हुई प्रवासी दरों thymic सकारात्मक चयन के साथ सहसंबंधी13 और नकारात्मक चयन की परिकल्पना का समर्थन रेंगने व्यवहार के साथ जुड़ा हुआ है कि थाइमस के माध्यम से यात्रा के कैनेटीक्स उचित निर्धारित करता है thymocytes की परिपक्वता । उनकी प्रासंगिकता के बावजूद, thymocyte के टोपोलॉजी-stromal सेल बातचीत और अंग microenvironments भर में thymocyte गतिशीलता की गतिशीलता टी सेल के दौरान परिपक्वता बीमार परिभाषित रहते हैं ।
सबसे पूर्व vivo अध्ययन तिथि करने के लिए प्रदर्शन किया भ्रूण या समग्र thymic अंग संस्कृतियों14,15, ऊतक स्लाइस या बरकरार thymic पालि explants जहां thymocyte आंदोलनों दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग द्वारा कल्पना कर रहे है शामिल माइक्रोस्कोप (TPLSM)8, एक प्रतिबंधित अधिकतम काम की दूरी और इमेजिंग गहराई के साथ एक intravital इमेजिंग तकनीक के अनुसार 1 मिमी के ऊतकों की जांच की16. श्रमसाध्य thymic अंग संस्कृतियों जो विस्तारित मशीन समय पर निर्भर करने के लिए 3 डी संरचनाओं, दोनों के विपरीत, thymic टुकड़ा तकनीक और बरकरार thymic पालि दृष्टिकोण पूर्व के विशेष सबसेट का परिचय नियंत्रित अनुमति लेबल एक देशी ऊतक वास्तुकला वातावरण में thymocytes । हालांकि, के बाद से रक्त प्रवाह इन मॉडलों में अनुपस्थित है, वे स्पष्ट रूप से थाइमस पैरेन्काइमा या परिपक्व टी कोशिकाओं के thymic egression की गतिशीलता के लिए थाइमस बसने progenitors (TSPs) की भर्ती प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए सीमित हैं ।
thymic टी सेल के अध्ययन के लिए वीवो मॉडल में चूहों में परिपक्वता फिजियोलॉजी के टुकड़े या पूरे अंग या तो गुर्दे कैप्सूल के अंदर रखा पालियों17 या intradermally18के भ्रष्टाचार शामिल हैं । हालांकि इन विकल्पों के ऊतकों के प्रणालीगत कार्यात्मक engraftment पूछताछ करने के लिए अपनी उपयोगिता से पता चला, thymic की स्थिति में गहरे जानवर या अपारदर्शी ऊतक की परतों द्वारा कवर के लिए उनके उपयोग को प्रतिबंधित करने के लिए vivo में प्रत्यारोपण के परीक्षा TPLSM ।
आंख के पूर्वकाल कक्ष corneal परतों की पारदर्शिता के आधार पर किसी भी भ्रष्टाचारी ऊतक के प्रत्यक्ष निगरानी के लिए एक आसानी से सुलभ जगह प्रदान करता है । लाभ के, आईरिस द्वारा गठित चैंबर के आधार रक्त वाहिकाओं और स्वायत्त तंत्रिका अंत में समृद्ध है, तेजी से revascularization और भ्रष्टाचारियों के reinnervation को सक्षम करने के19,20। डॉ Caicedo सफलतापूर्वक पिछले21में अग्नाशय के टाप के रखरखाव और अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इस संरचनात्मक अंतरिक्ष का इस्तेमाल किया है । यहां, हम बताते है कि इस रणनीति न केवल मूल अंग संरचना के भीतर thymocytes ' गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण का गठन किया है, लेकिन यह भी अद्वितीय परमिट जनक भर्ती के अध्ययन के लिए vivo अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग में विस्तार करने के लिए और परिपक्व टी सेल egression माउस में कदम ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

प्रस्तुत किया जा रहा है विधि का उद्देश्य, पहली बार के लिए, vivo अनुदैर्ध्य में thymocytes ´ गतिशीलता के एक संवहनी के भीतर वास्तविक समय की निगरानी के लिए isogenic वयस्क चूहों के पूर्वकाल नेत्र कक्ष में नवजात thymi का प्रत्यारोपण थाइमस सेगमेंट. रोपाई के बाद, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (LSM) कॉर्निया के माध्यम से vivo में सेलुलर संकल्प स्तर पर इनवेसिव दोहराया इमेजिंग की अनुमति देता है । महत्वपूर्ण बात, दृष्टिकोण पिछले intravital टी सेल परिपक्वता इमेजिंग मॉडल के लिए एक ही जानवर में सतत जनक सेल भर्ती और परिपक्व टी सेल निकास रिकॉर्डिंग के लिए संभावना कहते हैं । प्रणाली के अतिरिक्त लाभ भ्रष्टाचारी क्षेत्र की पारदर्शिता, प्रत्यारोपित ऊतक के macroscopic तेजी से निगरानी की अनुमति, और प्रणालीगत उपचार के अलावा स्थानीयकृत के लिए अनुमति प्रत्यारोपण के लिए पहुंच रहे हैं । मुख्य सीमा ऊतक की मात्रा जा रहा है कि आंख चैंबर के कम जगह में फिट बैठता है जो पालि trimming के लिए मांग करता है । अंग अखंडता पहले परिपक्व टी सेल उत्पादन के लिए कार्यात्मक हो दिखाया पैटर्न में विदारक थाइमस पालियों द्वारा अधिकतम है । तकनीक संभावित रूप से प्रतिरक्षा, इम्यूनो और केंद्रीय सहिष्णुता शामिल है कि थाइमस समारोह से संबंधित चिकित्सकीय प्रासंगिक सवालों के एक वातावरण पूछताछ करने के लिए अनुकूल है; प्रक्रियाओं जो mechanistically खराब परिभाषित रहते हैं । तंत्र के ठीक विच्छेदन thymocyte प्रवास मार्गदर्शक, भेदभाव और चयन उपंयास चिकित्सीय टी कोशिकाओं के विकास को लक्षित रणनीतियों को बढ़ावा देना चाहिए ।

नवजात चूहों से थाइमस को बी-6 से पृथक किया गया . तटरक्षक-टीजी (सीएजी-DsRed * MST) 1Nagy/बीआयएस चूहों के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित (कदम 1.1-1.9) । इन ट्रांसजेनिक चूहों में चिकन बीटा actin प्रवर्तक लाल फ्लो?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा आंख के पूर्वकाल चैंबर में Vivo ट्रैकिंग Thymocytes में वास्तविक समय

प्रोटोकॉल के लक्ष्य को दिखाने के लिए अनुदैर्ध्य intravital वास्तविक समय लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा thymocytes की ट्रैकिंग thymic प्रत्यारोपण में माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में है । भ्रष्टाचार के कॉर्निया और vascularization की पारदर्शिता लगातार रिकॉर्डिंग जनक सेल भर्ती और परिपक्व टी सेल निकास के लिए अनुमति देता है ।

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

यह विधि इम्यूनोलॉजी क्षेत्र में ऑटोइम्युनिटी, इम्यूनोडेफिशिएंसी, केंद्रीय सहिष्णुता और थाइमस इनोलेशन के तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह संवहनी भर्ती और परिपक्व टी-सेल ईएसग्रेशन की वीवो देशांतर रिकॉर्डिंग में संवहनी और ग्राफ्टेड माउस थाइमस खंडों के भीतर अनुमति देता है। हालांकि यह विधि थाइमस के विकास और कार्य में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन अन्य ऊतकों जैसे अग्नाशय आइलेट्स या किडनी ग्लोमेरुली पर भी लागू किया जा सकता है।थाइमस को अलग करने के लिए, माउस को बाँझ शोषक पेपर तौलिए पर एक लैमिनार प्रवाह हुड में पृष्ठीय ईमानदार स्थिति में रखें और स्प्रे करें और माउस पेट को 70% इथेनॉल से पोंछें। वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए निचले पेट में एक सतही वी के आकार का चीरा बनाएं और वेंट्रल मिडलाइन के साथ छाती में 0.5 से एक सेंटीमीटर चीरा बनाने के लिए सीधे 10 सेंटीमीटर विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। छाती के प्रत्येक पक्ष पर त्वचा गुना छाती गुहा का पर्दाफाश करने के लिए और पूर्वकाल वक्ष गुहा में बेहतर मध्यस्थता गुहा का उपयोग करने के लिए डायाफ्राम और रिब पिंजरे के माध्यम से दो अतिरिक्त गहरी ०.५ से एक सेंटीमीटर पार्श्व चीरों बनाते हैं ।थाइमस को दिल के ठीक ऊपर दो पीली पालियों के रूप में दिखाई देना चाहिए। थाइमस के नीचे घुमावदार संदंश-युक्तियां रखें और सीधे संदंश की एक जोड़ी के साथ रिबकेज के गुना-बैक को रोकने के लिए, पूर्ण अंग निकालने के लिए खड़ी खींचें। फिर बर्फ पर ठंडे बाँझ पीबीएस युक्त एक बाँझ ६०-मिलीलीटर पकवान में अलग थाइमस जलमग्न और एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए संयोजी isthmus कटौती करने के लिए थाइमिक लोब्स अलग ।प्रत्यारोपण से पहले, टैग और प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस वजन और एक तरफ पार्श्व recumbent स्थिति में एक आंख सीधे एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के लेंस को उजागर के साथ पहले जानवर जगह है । वन्नास कैंची का उपयोग करके, एक टेढ़े-मेढ़े पैटर्न के बाद चौड़ाई में एक मिलीमीटर तक अलग-थलग थाइमिक लोब्स में से एक उत्पादित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक खंड में कुछ थाइमिक कॉर्टेक्स और मेडुला ऊतक शामिल हैं। प्रत्यारोपण से ठीक पहले थाइमस को ट्रिम करना महत्वपूर्ण है क्योंकि बड़े टुकड़े ठीक से संलग्न नहीं हो सकते हैं।इसके बाद, सर्जिकल क्षेत्र के कॉर्निया के आधार पर शुरू, बाहरी कॉर्निया परतों में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए 40-मिलीमीटर 18 गेज सुई की नोक का उपयोग करें ताकि विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी की नोक पेश की जा सके। कैंची का उपयोग करने के लिए एक पांच से 10 मिलीमीटर पार्श्व चीरा सीधे कॉर्निया के आधार के आसपास जबकि फ्लैट समाप्त संदंश का उपयोग करने के लिए दृढ़ता से कॉर्निया खुला रखने के लिए resealing को रोकने के लिए । फ्लैट-एंडेड संदंश के साथ कट कॉर्नियल एपिथेलियम को पकड़ना, उद्घाटन के माध्यम से एक थाइमिक सेगमेंट डालने के दौरान कॉर्निया में उद्घाटन को बनाए रखें।ऊतक के पेश होने से पहले सहज पुनर्सीलिंग को रोकने के लिए कॉर्नियल खोलने के माध्यम से थाइमस टुकड़ा जल्दी से सम्मिलित करना महत्वपूर्ण है। इस कदम पर ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए सावधान रहें। आंख की सतह पर धीरे से प्रेस करने के लिए आंख के समारोह की रक्षा के लिए छात्र के संबंध में एक पार्श्व स्थिति के लिए शुरू ऊतक खंड स्लाइड ।और स्वयं को बढ़ावा देने के लिए तीन से पांच सेकंड के लिए एक दूसरे के खिलाफ मजबूती से खोलने कॉर्नियल खोलने के दोनों पक्षों को दबाने के लिए फ्लैट संदंश का उपयोग करें । यदि प्रत्यारोपण दोनों आंखों पर किया जाना है, एक दूसरे प्रत्यारोपण के लिए विपरीत पार्श्व पक्ष पर माउस बारी के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया । जब सर्जरी पूरी हो जाती है, तो माउस को एक खाली पिंजरे में वापस करें, जब तक कि पूर्ण अनुनद तक निगरानी के साथ गर्मी के दीपक के साथ पूर्व-गर्म हो।उपयुक्त प्रायोगिक समय बिंदु पर, एक एनेस्थेटाइज्ड प्राप्तकर्ता माउस को एक निश्चित चरण माइक्रोस्कोप मंच पर एक तरफ पार्श्व रेक्यूबेंट स्थिति में रखें, जिसमें एक आंख का सामना करना पड़ रहा है। और माउस के सिर को एक स्टीरियोटैक्सिक हेड होल्डर में डालें। पार्श्व पक्ष की स्थिति में माउस सिर को नियंत्रित करने के लिए घुंडी समायोजित करें ताकि थाइमस भ्रष्टाचार को थाइमस भ्रष्टाचार रखने वाली आंखों में माइक्रोस्कोप उद्देश्य की सीधी पहुंच की अनुमति दी जा सके और एक यूएसटी-2 ठोस सार्वभौमिक संयुक्त से जुड़े पॉलीथीन ट्यूब द्वारा कवर किए गए चिमटी-युक्तियों की एक जोड़ी के साथ कॉर्नियल मार्जिन पर आंखों को पकड़ते हुए पलकों को वापस खींचें।माउस की आंख पर 5X माइक्रोस्कोप उद्देश्य रखने से पहले कॉर्निया और लेंस के बीच बाँझ खारा या कृत्रिम आंसू की कुछ बूंदें जोड़ें और माइक्रोस्कोप क्षेत्र में थाइमस का पता लगाएं। फिर एक लंबी कार्य दूरी के साथ एक उच्च संकल्प जल विसर्जन सूई उद्देश्य पर स्विच करें और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण मोड का चयन करें। अनुनाद स्कैनर मोड शुरू करें और XYZT इमेजिंग मोड का चयन करें।आर्गन लेजर को चालू करें और फ्लोरेसेंस उत्तेजन के लिए पावर को 30% तक एडजस्ट करें। एक उपयुक्त उत्तेजना लेजर लाइन का चयन करें और उपयुक्त उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के लिए एसीको-ऑप्टिकल बीम स्प्लिटर नियंत्रण सेट करें जो बैकस्कैटर का पता लगाने और ऊतक संरचना को चित्रित करने के लिए एक साथ प्रतिबिंब का पता लगाने का उपयोग करके उपयुक्त उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करते हैं। चयनित तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जन को इकट्ठा करें और 512-बाय-512 पिक्सेल रेजोल्यूशन सेट करें।फिर इमेजिंग शुरू करने के लिए लाइव पर क्लिक करें, लाभ के स्तर को आवश्यक रूप से समायोजित करें। थाइमिक प्रत्यारोपण के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करें और चयन करें जेड स्टैक की शुरुआत को परिभाषित करना शुरू करें। फिर प्रत्यारोपित थाइमस में अंतिम विमान पर ध्यान केंद्रित करें जिसे कल्पना की जा सकती है और पांच माइक्रोमीटर के जेड-स्टेप आकार का उपयोग करके जेड स्टैक के अंत को परिभाषित करने के लिए अंत का चयन करें।1.5 से दो सेकंड के लिए प्रत्येक जेड स्टैक के अधिग्रहण के लिए समय अंतराल निर्धारित करें और निरंतर इमेजिंग के लिए अधिग्रहण-जब तक-बंद विकल्प का चयन करें। फिर रिकॉर्डिंग को शुरू करने के लिए शुरू पर क्लिक करें। यहां, थाइमस प्रत्यारोपण के एक ही क्षेत्र के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरेसेंस छवियों कि ऊतक विकास और involution और निरंतरता अध्ययन के एक डबल स्थूल अनुवर्ती के लिए सेवा कर सकते है दिखाया गया है ।उज्ज्वल क्षेत्र छवि भी प्रत्यारोपित ऊतक के संवहनी के दृश्य की सुविधा है, समय के साथ रक्त की आपूर्ति पर थाइमस शरीर विज्ञान की निर्भरता के अद्वितीय अध्ययन की अनुमति । यह मॉडल रक्त धार से प्रत्यारोपित थाइमस में कोशिका ट्रांसफ्यूजन के दृश्य की अनुमति देता है, जीएफपी-पॉजिटिव जनक कोशिकाओं के बीच संपर्कों की ट्रैकिंग को RFP-लेबल निवासी थाइमिक एपिथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ थाइमिक प्रत्यारोपण में प्रवेश करता है भेदभाव और चयन प्रक्रियाओं के दौरान, साथ ही थाइमस से एग्रेसिव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निगरानी को छिद्रपूर्ण रक्त वाहिकाओं में। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, इष्टतम engraftment के लिए ऊतक जोखिम को कम करने के लिए और भी आंख में चीरा आकार को सीमित करने के लिए कॉर्निया के माध्यम से अहानिकर टुकड़ा उत्तेजना की अनुमति है, जबकि उपचार के दौरान फाइब्रोसिस को कम करने के लिए याद रखना महत्वपूर्ण है ।इस प्रक्रिया के बाद, स्थानीयकृत नियंत्रण उपचार और कॉन्ट्रालेटरल आंखों में अन्य ऊतकों के चीरा जैसे अन्य तरीकों को किया जा सकता है ताकि संक्रमण, इनोलेशन निर्धारकों और प्रत्यारोपण सहिष्णुता तंत्र से जुड़े प्रतिरक्षा रोगों के बारे में अतिरिक्त सवालों का जवाब दिया जा सके। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए जनक भर्ती, थाइमस-आई गतिशीलता, और वीवो में परिपक्व टी-सेल इम्यून स्टेप्स सहित टी-सेल विकास का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

Vivo में माइक्रो परिसंचरण कंकाल की मांसपेशी में अंतरराज्यीय महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी द्वारा मापन

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

समय चूक प्रारंभिक Embryogenesis में माइक्रोस्कोपी Caenorhabditis एलिगेंस

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

जीवित कोशिकाओं में घटनाओं संकेत Unimolecular Biosensors की वास्तविक समय की निगरानी के लिए माइक्रोस्कोपी झल्लाहट

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

प्लाज्मा Retinol बाइंडिंग प्रोटीन की झिल्ली रिसेप्टर द्वारा वास्तविक समय Retinol परिवहन का विश्लेषण

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की विवो Clonal ट्रैकिंग में

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

जांच-आधारित वास्तविक समय पीसीआर microRNAs के मात्रात्मक मापन के लिए दृष्टिकोण

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

चर-कोण Epifluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ संयंत्र सेल भूतल गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग और जीवित मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं में microtubule गतिशीलता की स्वचालित विश्लेषण

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

मापने की कठोरता<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; माउस Aortas परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...