Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

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L'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Miami ha approvato tutti gli esperimenti secondo linee guida IACUC.
1. isolamento e guarnizione del neonato Thymi
<ol><li>Preparare tutti i reagenti e strumenti di sterilizzazione in autoclave o altri metodi, garantendo condizioni di sterilità.</li>
	<li>Per minimizzare le contaminazioni, eseguire tutte le procedure chirurgiche sotto cappa a flusso laminare.</li>
	<li>Prima dell'eutanasia topi donatore, riempire un pia...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Dovuto l'importanza del processo di maturazione della T-cellula per competenza immunitaria individuale4 e il presunto impatto delle dinamiche delle cellule precursore su cellule T mature prodotte dal timo2,3, notevoli sforzi sono stati investiti sviluppare alternative all'approccio classico tessuto fisso dello snapshot.
Anche se fettine di tessuto e altri espianti sono chiaramente superiori a riprodurre l'archit...

Intratimica differenziazione a cellula T e selezione sottopopolazione di cellule T costituiscono processi chiave per lo sviluppo e la manutenzione di immunità cellulo-mediata in vertebrati1. Questo processo coinvolge una complessa sequenza di eventi strettamente organizzati, tra cui il reclutamento dei progenitori dal flusso sanguigno, la proliferazione e la migrazione, l'espressione differenziale di proteine di membrana e la morte cellulare programmata massiccia per sottoinsiemi selezione. Il risultato è il rilascio di cellule T mature reattive ad un ampio spettro di antigeni estranei durante la visualizzazione ridotta a icona risposte a self-peptidi, che finiscono colonizzare gli organi linfoidi periferici delle singole2,3. Selezione di timociti aberrante del repertorio αβTCR conduce alla malattia autoimmune o squilibrio immunitario4 che derivano principalmente da difetti durante i processi di selezione precursore positivo o negativo, rispettivamente.
Migrazione direzionale di timociti attraverso il timo è intrinseco a tutte le fasi di maturazione delle cellule T ed è concepito come una serie di simultanea o sequenziale stimoli multipli, tra cui chemochine, adesive, e de-adesivo della matrice extracellulare (ECM) proteina interazioni3,5. Lo studio dei tessuti fissi ha reso informazioni critiche per quanto riguarda i modelli di espressione per stecche migratori timociti in microambienti timica definiti5,6, mentre gli studi ex vivo ha rivelato due prevalente i comportamenti migratori dei timociti in due aree istologicamente distinte dell'organo: slow stochastic movimenti nella corteccia e motilità veloce, confinate nel midollo7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento tassi migratori correlano con selezione timica positiva13 e selezione negativa è associato con comportamento strisciante, supportando l'ipotesi che la cinetica del viaggio attraverso il timo determina il corretto maturazione dei timociti. Nonostante la loro rilevanza, la topologia delle interazioni delle cellule stromal timociti e le dinamiche della motilità di timociti attraverso microambienti organo durante la maturazione delle cellule T rimangono mal definite.
Maggior parte degli studi ex vivo eseguita fino ad oggi includono fetale o ricongiungessero organo timico culture14,15, fettine di tessuto o espianti di lobo timico intatto cui movimenti di timociti sono visualizzati da scansione laser del due-fotone microscopia (TPLSM)8, una tecnica di imaging videomicroscopia con un massimo limitato, distanza di lavoro e profondità di 1 mm in conformità con il tessuto di imaging ha esaminato16. In contrasto con le culture di organo timico laborioso che dipendono dai tempi di incubazione estesa a formare 3D-strutture, entrambi, la tecnica di fetta timica e l'introduzione di permesso controllata di approccio lobo timico intatto di sottoinsiemi particolari dei pre-etichettata timociti in ambienti dall'architettura tessuto nativo. Tuttavia, poiché il flusso sanguigno è assente in questi modelli, sono chiaramente limitati per lo studio del processo di reclutamento del timo sedimentazione dei progenitori (TSPs) al parenchima del timo o le dinamiche di egression timica dei linfociti T maturi.
Modelli in vivo per lo studio della fisiologia di maturazione delle cellule T timica in topi includono gli innesti di frammenti o lobi intero organo collocati sia all'interno della capsula renale17 o per via intradermica18. Anche se queste opzioni hanno mostrato la loro utilità per interrogare engraftment sistemico funzionale del tessuto, la posizione degli innesti timici profondi all'interno dell'animale o coperti da strati di tessuto opaco limita il loro uso per esame in vivo degli impianti di TPLSM.
La camera anteriore dell'occhio fornisce uno spazio facilmente accessibile per il monitoraggio diretto di qualsiasi tessuto innestato in virtù della trasparenza di strati corneali. Di vantaggio, la base della camera formata dall'iride è ricca di vasi sanguigni e terminazioni nervose autonomiche, consentendo la rapida rivascolarizzazione e reinnervazione del innesti19,20. Dr. Caicedo ha utilizzato con successo questo spazio anatomico per la manutenzione e lo studio longitudinale degli isolotti pancreatici nel passato21. Qui, indichiamo che questa strategia non solo costituisce un valido approccio per studiare la dinamica dei timociti all'interno della struttura nativa dell'organo, ma anche in modo univoco consente di estendere l' in vivo longitudinale registrazioni allo studio del reclutamento di cellule progenitrici e passaggi di egression cellula T maturi nel topo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Lo scopo del metodo viene presentato è quello di mostrare, per la prima volta, il trapianto del neonato thymi nella camera anteriore dell'occhio di topi adulti isogeniche per in vivo longitudinale monitoraggio in tempo reale di thymocytes´ dinamiche all'interno di un vascolarizzato segmento di timo. Dopo il trapianto, microscopia (LSM) attraverso la cornea a scansione laser permette in vivo imaging ripetuti non invadente a livello cellulare ad alta risoluzione. D'importanza, l'approccio aggiunge alla maturazione delle cellule T videomicroscopia precedenti modelli di imaging la possibilità per il reclutamento di cellule progenitrici continuo e maturo della T-cellula egress registrazioni nello stesso animale. Ulteriori vantaggi del sistema sono la trasparenza dell'area innestata, permettendo il monitoraggio rapido macroscopica del tessuto impiantato, e l'accessibilità all'impianto consentendo localizzati oltre ai trattamenti sistemici. La limitazione principale essendo il volume del tessuto che si inserisce nello spazio ridotto della camera occhio che esige per il taglio del lobo. L'integrità dell'organo è massimizzata da lobi del timo in modelli precedentemente indicati per essere funzionale per la produzione di T-cellula matura di dissezione. La tecnica è potenzialmente adatta per interrogare un milieu di clinicamente rilevanti questioni relazionati alla funzione del timo che includono l'autoimmunità, immunodeficienza e tolleranza centrale; processi che rimangono meccanicistico scarsamente definiti. La raffinata dissezione dei meccanismi guida timociti migrazione, differenziazione e selezione dovrebbe portare a nuove strategie terapeutiche in via di sviluppo le cellule di T di targeting.

Timo da topi neonati sono stati isolati da B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas topi come descritto in questo protocollo (punti 1.1-1.9). In questi topi transgenici, il promotore di pollo beta actina dirige l'espressione della variante della proteina fluorescente rossa DsRed. MST sotto l'influenza del rinforzatore di inizio immediato del citomegalovirus (CMV) facilitando il monitoraggio degli impianti.
Per prevenire il ri...

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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo immunologico sui meccanismi di autoimmunità, immunodeficienza, tolleranza centrale e involuzione del timo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la registrazione longitudinale in vivo del reclutamento del progenitore e dell'egressione matura delle cellule T all'interno di segmenti di timo del topo vascolarizzati e innestati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo e sulla funzione del timo, può essere applicato anche ad altri tessuti come isolotti pancreatici o glomeruli renali.Per isolare il timo, posizionare il mouse su asciugamani di carta assorbenti sterili nella posizione verticale dorsale in un cappuccio di flusso laminare e spruzzare e pulire l'addome del topo con il 70% di etanolo. Fai un'incisione superficiale a forma di V nell'addome inferiore per esporre la cavità toracica e usa un paio di forbici sezionanti dritte da 10 centimetri per fare un'incisione da 0,5 a un centimetro nel petto lungo la linea mediana ventrale. Piegare la pelle su ciascun lato del torace per esporre la cavità toracica e fare altre due incisioni laterali più profonde da 0,5 a un centimetro attraverso il diaframma e la gabbia toracica per accedere al mediastino superiore nella cavità toracica anteriore.Il timo dovrebbe apparire come due lobi pallidi proprio sopra il cuore. Posizionare le punte curve sotto il timo e tirare verticalmente per estrarre l'organo completo, impedendo la ripiegatura della gabbia toracica con un paio di forcette dritte. Quindi immergere il timo isolato in un piatto sterile da 60 millilitri contenente PBS sterile freddo sul ghiaccio e utilizzare un bisturi per tagliare l'istmo connettivo per separare i lobi timici.Prima del trapianto, etichettare e pesare ogni topo ricevente e posizionare il primo animale in posizione reclinata laterale con un occhio direttamente esposto alla lente di un microscopio sezionante. Usando le forbici Vannas, asporta uno dei lobi timici isolati fino a un millimetro di larghezza seguendo un modello a zig-zag per garantire che ogni segmento contenga un po 'di corteccia timica e tessuto midollare. È fondamentale tagliare il timo proprio prima dell'impianto poiché i pezzi di grandi dimensioni potrebbero non essere accinnesciti correttamente.Successivamente, partendo dalla base della cornea dell'area chirurgica, utilizzare la punta di un ago calibro 18 di 40 millimetri per fare una piccola incisione in strati esterni di cornea in modo da poter introdurre la punta di un paio di forbici sezionanti. Usa le forbici per fare un'incisione del fianco da cinque a 10 millimetri direttamente intorno alla base della cornea mentre usi forcelle a terminazione piatta per tenere saldamente aperta la cornea per evitare il riposigillamento. Afferrando l'epitelio corneale tagliato con le forcep piatte, mantenere l'apertura nella cornea mentre si inserisce un segmento timico attraverso l'apertura.È importante inserire rapidamente il pezzo di timo attraverso l'apertura corneale per evitare il riposigillamento spontaneo prima dell'introduzione del tessuto. Fai attenzione a preservare l'integrità dei tessuti in questo passaggio. Premere dolcemente sulla superficie oculare per far scorrere il segmento tissutale introdotto in una posizione laterale rispetto alla pupilla per preservare la funzione dell'occhio.E usa le forcelle piatte per premere saldamente entrambi i lati dell'apertura corneale l'uno contro l'altro per tre o cinque secondi per promuovere l'autosigillamento. Se il trapianto deve essere eseguito su entrambi gli occhi, ruotare il mouse sul lato laterale opposto per un secondo impianto come appena dimostrato. Al termine dell'intervento chirurgico, riportare il mouse in una gabbia vuota pre-riscaldata con una lampada termica con monitoraggio fino alla piena rimpasto.Nel momento sperimentale appropriato, posizionare un mouse ricevente anestetizzato su una piattaforma di microscopio a stadio fisso in posizione reclinata laterale su un riscaldatore con un occhio rivolto verso l'alto. E inserire la testa del mouse in un portacapo stereotassico. Regolare la manopola per trattenere la testa del mouse nella posizione laterale laterale per consentire l'accesso diretto dell'obiettivo del microscopio all'occhio che tiene l'innesto di timo e tirare indietro le palpebre tenendo l'occhio al margine corneale con un paio di punte di tweezer coperte da un tubo di polietilene attaccato a un giunto universale solido UST-2.Aggiungere alcune gocce di lacrime soluzione salina o artificiale sterili tra la cornea e l'obiettivo prima di posizionare l'obiettivo del microscopio 5X sull'occhio del mouse e individuare il timo nel campo del microscopio. Quindi passare a un obiettivo di immersione in acqua ad alta risoluzione con una lunga distanza di lavoro e selezionare la modalità di acquisizione nel software del microscopio. Avviare la modalità scanner di risonanza e selezionare la modalità di imaging XYZT.Accendere il laser argon e regolare la potenza al 30% per l'eccitazione a fluorescenza. Selezionare una linea laser di eccitazione appropriata e impostare il controllo dello splitter del fascio acousto-ottico per le lunghezze d'onda di emissione appropriate utilizzando il rilevamento della riflessione contemporaneamente per rilevare il backscatter e delineare la struttura tissutale. Raccogliere l'emissione alla lunghezza d'onda selezionata e impostare una risoluzione di 512 x 512 pixel.Quindi fai clic dal vivo per avviare l'imaging, regolando i livelli di guadagno in base alle esigenze. Concentrati sulla parte superiore dell'impianto timico e seleziona inizia a definire l'inizio della pila Z. Quindi concentrati sull'ultimo piano nel timo impiantato che può essere visualizzato e seleziona l'estremità per definire l'estremità della pila Z usando una dimensione del passo Z di cinque micrometri.Impostare l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni stack Z da 1,5 a due secondi e selezionare l'opzione acquire-until-stopped per l'imaging continuo. Quindi fare clic su Avvia per inizializzare la registrazione. Qui vengono mostrate immagini a campo luminoso e a fluorescenza della stessa area dell'impianto del timo che possono servire per un doppio follow-up macroscopico della crescita dei tessuti e degli studi di involuzione e continuazione.L'immagine a campo luminoso facilita anche la visualizzazione della vascolarizzazione del tessuto impiantato, consentendo lo studio unico della dipendenza della fisiologia del timo dall'apporto di sangue nel tempo. Questo modello consente la visualizzazione della trasmigrazione cellulare dal torrente sanguigno nel timo impiantato, il tracciamento dei contatti tra le cellule progenitrici positive alla GFP che entrano nell'impianto timico con cellule epiteliali e stromali tiroidee residenti etichettate RFP durante i processi di differenziazione e selezione, nonché il monitoraggio delle cellule immunitarie egressive dal timo ai vasi sanguigni periferici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti per un innesto ottimale e anche di limitare le dimensioni dell'incisione nell'occhio per consentire l'escissione del frammento illesa attraverso la cornea riducendo al contempo la fibrosi durante la guarigione.Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come i trattamenti di controllo localizzati e l'incisione di altri tessuti nell'occhio contralaterale in modo da rispondere a ulteriori domande sulle disfunzioni immunitarie legate a infezioni, determinanti dell'involuzione e meccanismi di tolleranza al trapianto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare lo sviluppo delle cellule T, tra cui il reclutamento del progenitore, la dinamica timo-occhio e le fasi mature di egressione delle cellule T in vivo.

Research

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Biology

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