Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

この作品は NIH 助成金 R56DK084321 (AC)、R01DK084321 (AC)、R01DK111538 (AC)、R01DK113093 (AC)、R21ES025673 (AC) とベスト/2015/043 グラント サポートされている (Consellería ・ デ ・ Educació、文化会館私 esport、ジャナラリター バレンシア, バレンシア, スペイン) (EO)。サンペドロマルティル山脈バレンシア バレンシア ・ カトリカ大学サン ・ ビセンテ、スペイン、ビデオ撮影・編集のセントロ ・ デ ・危惧プリンシペ フェリペ、バレンシア、スペインでアルベルト ・ エルナンデスに送信チームを著者に感謝します。

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、マイアミ大学の IACUC ガイドラインに従ってすべての実験を承認しました。
1. 分離と新生児 Thymi のトリミング
<ol><li>すべての試薬・ オートクレーブまたは滅菌条件の確保、その他の方法で機器を準備します。</li>
	<li>、汚染を最小限に抑えるには、層流フードの下ですべての手術を実行します。</li>
	<li>ドナー マウスを安楽死さ?...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

個々 の免疫能力4 T 細胞の成熟過程の重要性と成熟 T 細胞胸腺2,3プロデュースの前駆細胞の動態の推定の影響のため多大な努力に投資されています。古典的な組織を固定する選択肢を開発するアプローチをスナップショットしました。
研究での使用組織スライスとその他の植が明らかに単分子膜または集計の?...

胸腺内 T 細胞分化と T 細胞亜集団の選択は、開発と脊椎動物1の細胞性免疫能の維持のため重要なプロセスを構成します。このプロセスは、複雑な一連の血流や細胞増殖の移行から前駆細胞の募集、サブセットの大規模なプログラム細胞死および膜タンパク質の発現を含むしっかりと組織のイベント選択します。結果は最小化された自己のペプチッド、レスポンスを表示しながら、成熟 T 細胞に外国の抗原の広いスペクトル反応のリリースを最後まで個々2,3の末梢リンパ器官を植民地化します。ΑβTCR レパートリーの迷入胸腺選択は、自己免疫疾患や免疫のアンバランス4主に正または負の前駆体選択の過程それぞれ欠陥から派生したに します。
胸腺で胸腺細胞の方向性の移行は T 細胞の成熟のすべての段階に組み込み、ケモカイン、接着剤を含む複数の刺激、同時またはシーケンシャルのシリーズとして構想・解消接着細胞外マトリックス (ECM)蛋白質の相互作用の3、5。固定組織の研究が表示される定義された胸腺微小5,6、渡り鳥のキューの胸腺細胞の表現のパターンに関する重要な情報ex vivoの研究は 2 つを明らかにした流行胸腺細胞器官の 2 つの組織の領域の移住性の動作: 遅い確率的な運動皮質と髄質7,8,9,10高速、限られた運動,11,12,13。 胸腺の肯定的な選択13と渡り鳥の増加率の相関と負の淘汰は胸腺旅の速度が適切なを決定すること仮説を支えるクロールの動作に関連付けられています。胸腺細胞の成熟。その妥当性にもかかわらず胸腺間質細胞の相互作用のトポロジおよび T 細胞の成熟に伴う臓器微小で胸腺細胞運動のダイナミクスは不明確なままです。
ほとんどは、前のヴィヴォの日付に対して研究胎児または胸腺器官培養14,15、切片または胸腺細胞の動きが 2 光子レーザーのスキャンによって可視化してそのまま胸腺葉外植片を再集約顕微鏡 (TPLSM)8、制限最大作動距離および組織に従い 1 mm の深さのイメージングと生体イメージング技術は、16を検討しました。胸腺スライス技術と特定のサブセットのままの胸腺葉アプローチ許可制御導入の両方であらかじめラベル 3 D 構造を形成する長期の潜伏時間に依存する骨の折れる胸腺器官培養と対照をなしてネイティブの組織アーキテクチャ環境に胸腺細胞。ただし、血流があるので欠席これらのモデルで胸腺胸腺実質または成熟 T 細胞の胸腺の egression のダイナ ミックス (Tsp) 前駆細胞をセトリングの採用プロセスを研究するため明確に限定されます。
In vivoモデル マウスにおける胸腺 T 細胞の成熟の生理学の研究のためには、全体の器官葉腎カプセル17または掻き18内に配置またはフラグメントの移植が含まれます。動物の奥深くまたは不透明な組織の層で覆われている胸腺移植片の位置が体内でインプラントの検査のための使用を制限がこれらのオプションは、組織の機能生着全身を尋問する彼らの有用性を示したTPLSM。
目の前房は角膜のレイヤーの透明度のおかげで、移植組織の直接監視の簡単にアクセスできるスペースを提供します。利点の虹彩によって形成されたチャンバのベースは血管や自律神経終末、急激な血行再建術と移植19,20の神経再生を有効にするが豊富です。博士カイセードがメンテナンスおよび過去21膵島の縦断的研究のためこの解剖学的領域を使用して正常に。ここで、紹介はこの戦略だけでなくネイティブ器官の構造内の胸腺細胞のダイナミクスを研究するための有効なアプローチを構成するも一意に前駆募集の研究に縦の録音は、生体内で拡張することができますが、マウス成熟 T 細胞 egression の手順。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

提示されているメソッドの目的は、最初の時間のため、新生児 thymi生体内で縦のリアルタイム モニタ リング、血管内 thymocytes´ ダイナミクスの同質の成体マウスの前眼房への移植を表示するは胸腺のセグメント。次の移植、レーザー顕微鏡 (LSM) 角膜は、携帯電話の解像度レベルでの繰り返し非侵襲的イメージング体内をことができます。重要なは、アプローチに追加しますイメージング モデル以前の生体の T 細胞の成熟に連続前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口の録音の可能性同じ動物。システムの付加的な利点は、移植組織の巨視的急速な監視を許可する接木部透明性と全身トリートメントに加え、インプラントへのアクセシビリティがローカライズされました。組織のボリュームをされている主な制限するは葉のトリミングを要求する目の商工会議所の省スペースに収まります。オルガンの整合性は、成熟した T 細胞の生産で機能する以前にパターンで胸腺ローブを解剖によって最大化されます。技術は可能性のある自己免疫疾患、免疫不全、中枢性トレランス; を含む胸腺機能に関連する医学的に関連の質問の環境調査に適していますプロセス定義が不十分な機械論的に残っています。胸腺細胞の移動、分化と選択を導くメカニズムの細かい解剖は、新規治療戦略開発 T 細胞をターゲットにつながるはずです。

新生児マウス胸腺がB6 から分離されました。Cg Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jasマウスこのプロトコル (手順 1.1 1.9) で説明されているようです。これらのトランスジェニック マウスにおける鶏 β アクチン プロモーターは赤色蛍光タンパク質変形した DsRed 発現を指示します。インプラントの追跡を促進する早い即時エンハンサー サイトメガロ ウイルス (CMV) の影響の下で MS...

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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T 細胞の出口を継続的に記録が可能です。

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

この方法は、自己免疫、免疫不全、中央耐性、胸腺の不全のメカニズムに関する免疫学分野の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、血管化および移植されたマウス胸腺セグメント内の前駆細胞の動員および成熟したT細胞の出口のインビボ縦方向の記録を可能にすることです。この方法は、胸腺の発達および機能に関する洞察を提供することができるが、膵島または腎臓糸球体リなどの他の組織にも適用することができる。胸腺を分離するには、薄層流れフードの後回りの直立位置に無菌吸収性ペーパータオルの上にマウスを置き、70%エタノールでマウス腹部をスプレーして拭きます。下腹部の表面的なV字型切開を行い、胸腔を露出させ、まっすぐな10センチメートルの解剖ハサミを使用して、腹側の正中線に沿って胸部に0.5〜1センチメートルの切開を行います。胸部の両側に皮膚を折り畳んで胸腔を露出させ、隔膜と肋骨ケージを通して2つの深い0.5〜1センチメートルの側面切開を行い、胸部前胸腔の優れた遠心部にアクセスします。胸腺は、心臓のすぐ上に2つの淡い葉として表示されるはずです。胸腺の下に湾曲した鉗子先端を置き、垂直に引っ張って完全な器官を抽出し、まっすぐな鉗子で胸部の折り畳みを防ぎます。その後、氷の上に冷たい滅菌PBSを含む滅菌60ミリリットル皿に孤立した胸腺を沈め、メスを使用して結合性地峡を切断して胸腺葉を分離する。移植前に、各レシピエントマウスをタグ付けし、重み付けし、解剖顕微鏡のレンズに直接露出した片目で最初の動物を側面横方向リカンベント位置に置きます。Vannasはさみを使用して、ジグザグパターンに従って1ミリメートルまでの幅で孤立した胸腺ローブの1つを切除し、各セグメントに胸腺皮質および髄質組織が含まれていることを確認する。大きな部分が適切に生着しない可能性があるため、移植の直前に胸腺をトリミングすることが重要です。次に、手術領域の角膜の基部から始めて、40ミリメートル18ゲージ針の先端を使用して、外的な角膜層に小さな切開を行い、一対の解剖ハサミの先端を導入できるようにします。はさみを使用して角膜の基部の周りに直接5〜10ミリメートルの側面の切開を行い、平らな鉗子を使用して角膜をしっかりと開いて再シールを防ぎます。切断した角膜上皮を平らな鉗子でつかみ、開口部を通して胸腺セグメントを挿入しながら角膜の開口部を維持する。組織が導入される前に自発的な再シールを防ぐために、角膜開口部を通して胸腺片を素早く挿入することが重要です。このステップで組織の完全性を維持するように注意してください。眼の表面を柔らかく押して、導入した組織セグメントを瞳孔に対して横位置にスライドさせて、眼の機能を維持します。そして、平らな鉗子を使用して、角膜開口部の両側を3〜5秒間しっかりと押し合い、自己シールを促進します。両方の目に移植を行う場合は、ちょうど実証したように、2番目の移植のためにマウスを反対側の側面に回します。手術が完了したら、完全な再発まで監視付きのヒートランプであらかじめ温めた空のケージにマウスを戻します。適切な実験時に、麻酔されたレシピエントマウスを固定ステージ顕微鏡プラットフォーム上に置き、片方の目を上に向けたヒートパッドの側面横方向リカンベント位置に置きます。そして、ステレオタックスヘッドホルダーにマウスの頭を挿入します。マウスヘッドを横方向の位置に拘束して、胸腺移植片を保持する目に顕微鏡の目的を直接アクセスできるように調整し、UST-2固体ユニバーサルジョイントに取り付けられたポリエチレンチューブで覆われた一対のツイーザーチップで角膜マージンで目を保持しながらまぶたを引き戻します。5X顕微鏡の目的をマウスの目に置き、顕微鏡フィールドに胸腺を配置する前に、角膜とレンズの間に滅菌生理食いまたは人工涙を数滴加えます。次に、長時間作動距離で高分解能の水浸漬目標に切り替え、顕微鏡ソフトウェアで取得モードを選択します。共振スキャナモードを開始し、XYZTイメージングモードを選択します。アルゴンレーザーをオンにし、蛍光励起のために30%に電力を調整します。適切な励起レーザラインを選択し、反射検出を同時に使用して適切な発光波長のアヌースト光光光スプリッタ制御を設定し、後方散乱を検出し、組織構造を線引きします。選択した波長で発光を収集し、512 x 512 ピクセルの解像度を設定します。次に、[ライブ] をクリックしてイメージングを開始し、必要に応じてゲイン レベルを調整します。胸腺インプラントの上部に焦点を当て、Zスタックの始まりを定義し始めます。次に、視覚化できる埋め込み胸腺の最後の平面に焦点を当て、5マイクロメートルのZステップサイズを使用してZスタックの終点を定義するために端を選択します。各 Z スタックの取得時間間隔を 1.5 ~ 2 秒間設定し、連続イメージングの取得停止オプションを選択します。次に、[開始] をクリックして録音を初期化します。ここでは、胸腺インプラントの同じ領域の明視野および蛍光画像が、組織の成長およびインボルリューションおよび継続研究の二重巨視的フォローアップに役立つ可能性がある。明視野画像はまた、移植された組織の血管化の視覚化を容易にし、時間の経過とともに胸腺生理学の血液供給への依存性のユニークな研究を可能にする。このモデルは、血液急流から移植された胸腺への細胞転移の視覚化、分化および選択プロセス中にRFP標識された常駐胸腺上皮および間質細胞を有する胸腺インプラントに入るGFP陽性前駆細胞間の接触の追跡、ならびに胸腺から末梢血管への通行免疫細胞のモニタリングを可能にする。この手順を試みる間、最適な生着のために組織暴露を最小限に抑え、また、治癒中に線維症を減らしながら角膜を通して無傷の断片切除を可能にするために目の切開サイズを制限することを覚えておくことが重要です。この手順に従って、局在した対照治療および他の組織を対側眼に切開するような他の方法は、感染症、インボルリューション決定因子、および移植耐性メカニズムに関連する免疫機能障害に関する追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が、前駆細胞の採用、胸腺-眼球ダイナミクス、および生体内の成熟したT細胞出口ステップを含むT細胞の発達を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

血漿レチノール結合タンパク質の膜受容体によってレチノール交通のリアルタイム解析

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

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共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...