Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

이 작품은 NIH 교부 금 R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) 및 R21ES025673 (AC)에 의해 고 최고/2015/043 그랜트에 의해 지원 되었다 (Consellería de Educació, 문화 나, esport Generalitat 발렌시아, 발렌시아, 스페인) (EO). 저자는 대학 Católica 드 발렌시아 산 비센테 Mártir, 발렌시아, 스페인, 센트로 데 Investigación 프린시페 펠리페, 발렌시아, 스페인에 대 한 그들의 비디오 촬영과 편집에서 알베르토 헤 르 난 데스에서 보낸 팀을 감사 합니다.

기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학의 IACUC 지침에 따라 모든 실험을 승인 했다.
1. 격리와 신생아 Thymi의 조정
<ol><li>모든 시 약 및 압력가 마로 소독 또는 멸 균 상태를 보장 하는 다른 방법으로 악기를 준비 합니다.</li>
	<li>오염 최소화, 층 류 두건 아래 모든 수술 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>Euthanizing 기증자 마우스, 이전 60 m m 메 마른 접시 인산 염 버퍼 식 ?...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

개별 면역 능력4 T 세포 성숙 과정의 중요성 및 성숙한 T 세포 thymus2,3에 의해 생산에 선구자 세포 역학의 추정된 영향, 광범위 한 노력이 투자 되었습니다. 대안 클래식 고정된 조직 스냅샷 접근을 개발 하십시오.
조직 조각과 다른 explants는 분명히 우수한 재현 monolayers 또는 집계 thymic 기관 문화14<s...

Intrathymic T-세포 분화 및 T 세포 부분 모집단 선택 개발 및 척추 동물1셀 중재 면역의 유지 보수에 대 한 핵심 프로세스를 구성합니다. 이 과정에서 혈액, 세포 증식 및 마이그레이션 창시자의 채용, 막 단백질, 그리고 하위 집합에 대 한 대규모 프로그램 된 세포 죽음의 차동 식 등 긴밀 하 게 조직 된 이벤트의 복잡 한 순서를 포함 선택입니다. 결과 T-세포로 성숙 외국 항 원의 넓은 스펙트럼에 반응의 출시 자체-펩 티 드, 최소화 된 응답을 표시 하는 동안 주변 림프 기관 개별2,3의 식민지는 끝낼. ΑβTCR 레 퍼 토리의 탈 선 thymocyte 선택 자가 면역 질환 또는 면역 불균형4 주로에서 파생 되는 결함의 음수 또는 양수 전조 선택 프로세스 동안 각각 이끌어 낸다.
Thymus 걸쳐 thymocytes의 방향 이동 T 세포 성숙의 모든 단계에 본질적인 것 이며 그것은 일련의 동시 또는 순차적으로 발산, 접착제를 포함 하 여 여러 자극을 상상 하 고 드 접착제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 상호 작용3,5. 고정 조직의 연구는 렌더링 정의 thymic microenvironments5,6, thymocyte 철새 단서에 대 한 표현의 패턴에 관한 중요 한 정보 ex vivo 연구 두 계시는 동안 널리 장기의 2 개의 조직학 명백한 지역에서 thymocytes의 철새 행동: 느린 피 질에서 확률적 움직임과 빠른, 한정 된 운동 성 정도7,8,,910 , 11 , 12 , 13. thymic 긍정적인 선택13 연관 증가 철새 요금 및 부정적인 선택 가설 thymus 통해 여행의 활동 적절 한 결정을 지 원하는 크롤링 동작와 연결 된 thymocytes 성숙 그들의 관련성에도 불구 하 고 thymocyte stromal 세포 상호 작용의 토폴로지 및 기관 microenvironments T 세포 성숙 동안에 걸쳐 thymocyte 운동 역학 병이 정의 유지.
대부분의 비보 전 날짜를 수행 연구 태아 포함 또는 thymic 기관 문화14,15, 조직 조각 또는 그대로 thymic 엽 explants thymocyte 움직임 2 광자 레이저 스캔 하 여 시각화는 reaggregate 현미경 검사 법 (TPLSM)8을 제한 된 최대 작동 거리 및 조직에 따라 1 mm의 깊이 이미징 intravital 이미징 기술16를 검사 합니다. 3D 구조 형성을 연장된 보육 시간에 따라 달라 지는 힘 드는 thymic 기관 문화, 달리 thymic 조각 기술과 그대로 thymic 엽 접근 허가 제어 소개의 특정 하위 집합의 모두, 사전 분류 thymocytes 네이티브 조직 건축 환경에. 그러나, 혈액 흐름은 이후 결 석이 모델은 명확 thymus thymus 실질 또는 성숙한 T 세포의 thymic egression 역학 창시자 (TSPs) 정착의 채용 과정을 공부에 대 한 제한.
Vivo에서 모델 쥐에서 thymic T 세포 성숙 생리학의 연구에 대 한 조각 또는 중 신장 캡슐17 또는 intradermally18안으로 배치 하는 전체 기관 돌출부의 이식 포함 됩니다. 비록 이러한 옵션 보여 조직의 조직 기능 engraftment가 그들의 유틸리티, thymic 이식 동물 내에서 깊은 또는 불투명 직물의 층에 의해 덮여의 위치 비보에 의해 임 플 란 트의 시험에 대 한 그들의 사용 제한 TPLSM입니다.
눈의 앞쪽 챔버 각 막 레이어의 투명도 덕택으로 어떤 이식할 조직을 직접 모니터링을 위한 쉽게 접근할 수 있는 공간을 제공 합니다. 이점의 홍 채에 의해 형성 된 챔버의 혈관과 자율 신경 엔딩, 빠른 revascularization 및 이식19,20reinnervation 풍부 하다. 박사 Caicedo 성공적으로 유지 보수 및 지난21에서 췌 장 독도의 종 적 연구에 대 한이 해 부 공간을 사용 하고있다. 자, 우리 보여이 전략 뿐만 아니라 네이티브 기관 구조 내에서 thymocytes의 역학을 공부 하는 유효한 접근을 구성 하지만 또한 고유 하 게 확장 하는 비보에 조상 모집의 연구에 경도 기록을 허용 하 고 성숙한 T 세포 egression 단계 마우스입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

제시 되는 방법의 목적은 쇼, 처음으로, vivo에서 경도 실시간 모니터링를 vascularized 내에서 thymocytes´ 역학의 isogenic 성인 쥐의 앞쪽 눈 챔버로 신생아 thymi의 이식 thymus 세그먼트입니다. 이식, 다음 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 각 막 통해 비보에 비 침 투 적인 반복된 이미징을 셀룰러 해상도 수준에서 수 있습니다. 중요 한 것은, 접근에 추가 이전 intravital T 세포 성숙 모델 이미징 연속 조상 세포 모집 및 성숙한 T 세포 출구 녹음에 대 한 가능성 같은 동물에서 합니다. 시스템의 추가 장점은 이식 조직의 거시적인 신속한 모니터링 허용 이식할 영역의 투명도 그리고 조직의 치료 뿐만 아니라 지역화 된 임 플 란 트에 대 한 허용에 대 한 접근. 주요 제한 되 고 조직의 볼륨을 엽 트리밍에 대 한 요구는 눈 챔버의 감소 된 공간에 맞는. 기관 무결성 패턴 이전 성숙한 T 세포 생산에 대 한 기능 표시 thymus 돌출부를 해 부하 여 최대화 됩니다. 기술은은 잠재적으로 환경 의학 관련 질문 thymus 함수에 관련 된 면역, 면역 결핍, 중앙 허용;의 적합 하다 프로세스 mechanistically 가난 하 게 정의 된 남아 있는입니다. 지도 thymocyte 마이그레이션, 차별화 및 선택 메커니즘의 미세 해 부 소설 치료 전략 개발 T 세포를 대상으로 지도 해야 한다.

Thymus 신생아 쥐에서 b 6에서에서 격리 했다. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas 쥐가이 프로토콜 (단계 1.1-1.9)에 설명 된 대로. 이러한 유전자 변형 쥐에서 닭 베타 걸 발기인 빨간 형광 단백질 변형 DsRed의 식을 지시합니다. 임 플 란 트의 추적을 촉진 세포 (CMV) 즉시 초기 증강의 영향 아래 산악 표준시.
조직 제거, 유전자와 isogenic 개?...

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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

이 방법은 자기 면역, 면역 결핍, 중앙 내성 및 흉부 불응력의 기계장치에 관하여 면역학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈관 및 접목 마우스 흉선 세그먼트 내에서 선조 모집 및 성숙한 T 세포 환귀의 생체 내 세로 기록을 허용한다는 것입니다. 이 방법은 흉선의 발달 그리고 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 췌장 섬이나 신장 구술과 같은 다른 조직에도 적용 될 수 있습니다.흉기를 분리하려면 마우스를 등쪽 수직 위치에 멸균 흡수성 종이 타월에 라미나르 플로우 후드에 놓고 70%에탄올로 마우스 복부를 닦아냅니다. 아래 복부에 피상적 V 자형 절개를 만들어 흉부 구멍을 노출하고 직선 10 센티미터 해부 가위를 사용하여 복부 미드 라인을 따라 가슴에 0.5 ~ 1 센티미터 절개를합니다. 흉부 구멍을 노출하고 격막과 흉곽 구멍을 통해 두 개의 추가 깊은 0.5 ~ 1 센티미터 측면 절개를 만들기 위해 가슴의 각 측면에 피부를 접을.흉선은 심장 바로 위에 두 개의 창백한 엽으로 나타나야합니다. 곡면 포프 팁을 흉막 아래에 놓고 수직으로 당겨 전체 장기를 추출하여 흉곽의 접이식 뒷면을 직선 집게로 방지합니다. 그런 다음 얼음에 차가운 멸균 PBS를 포함하는 멸균 60 밀리리터 접시에 고립 된 흉선을 잠그고 메스를 사용하여 결합 된 이스머스를 잘라 백리믹 로브를 분리합니다.이식하기 전에 각 수신자 마우스를 태그하고 계량하고 첫 번째 동물을 측면 측측 억양 위치에 놓고 한 쪽 눈이 해부 현미경의 렌즈에 직접 노출됩니다. Vannas 가위를 사용하여, 각 세그먼트가 일부 흉피질과 medulla 조직을 포함하는지 확인하기 위해 지그재그 패턴에 따라 폭1 밀리미터까지 고립 된 흉엽 중 하나를 소비합니다. 큰 조각이 제대로 이식되지 않을 수 있으므로 이식 직전에 흉을 손질하는 것이 중요합니다.다음으로, 수술 영역의 각막 기저에서 시작하여 40mm 18 게이지 바늘의 끝을 사용하여 외부 각막 층으로 작은 절개를 하여 한 쌍의 해부 가위 끝이 도입될 수 있도록 한다. 가위를 사용하여 각막 의 기지 바로 주위5 ~ 10mm 측면 절개를 만드는 동시에 평평한 단조 포셉을 사용하여 각막을 단단히 고정하여 재밀봉을 방지합니다. 평평한 집게로 컷 각막 상피를 잡고, 개구부를 통해 티믹 세그먼트를 삽입하면서 각막의 개구부를 유지합니다.조직이 도입되기 전에 자발적인 재밀봉을 방지하기 위해 각막 개구부를 통해 흉막 조각을 신속하게 삽입하는 것이 중요합니다. 이 단계에서 조직의 무결성을 보존하십시오. 눈 표면에 부드럽게 눌러 도입된 조직 세그먼트를 눈의 기능을 보존하기 위해 동공에 대하여 측면 위치로 밀어 놓습니다.그리고 평평한 집게를 사용하여 각막 의 양쪽을 3~5초 동안 서로 단단히 눌러 자체 밀봉을 촉진합니다. 이식이 양쪽 눈에 수행될 경우, 마우스를 두 번째 이식을 위해 반대쪽 측면으로 돌리십시오. 수술이 완료되면 마우스를 완전한 재복이 있을 때까지 모니터링할 수 있는 열램프로 미리 데워진 빈 케이지로 마우스를 되돌려 놓습니다.적절한 실험 시점에서 마취된 수신자 마우스를 한쪽 눈을 향한 열패드에 측면 측면 측면 재배치 위치에 고정 단계 현미경 플랫폼에 놓습니다. 그리고 마우스의 머리를 스테레오 탈탁 헤드 홀더에 삽입합니다. 마우스 헤드를 측면 위치에 고정하여 흉선 접목을 잡고 눈꺼풀을 당기고, UST-2 고체 범용 조인트에 부착된 폴리에틸렌 튜브로 덮인 트윈팁 한 쌍의 트위저 팁으로 눈꺼풀을 뒤로 당깁니다.마우스 눈에 5X 현미경 목표를 배치하고 현미경 필드에 흉분을 찾기 전에 각막과 렌즈 사이에 멸균 식염수 또는 인공 눈물 의 몇 방울을 추가합니다. 그런 다음 장거리 작업 거리로 고해상도 수분 침지 침지 목표로 전환하고 현미경 소프트웨어에서 획득 모드를 선택합니다. 공진 스캐너 모드를 시작하고 XYZT 이미징 모드를 선택합니다.아르곤 레이저를 켜고 형광 흥분을 위해 전력을 30 %로 조정합니다. 적절한 흥분 레이저 라인을 선택하고 반사 감지를 사용하여 적절한 방출 파장에 대한 아쿠스토 광학 빔 스플리터 제어를 설정하여 백스캐터를 감지하고 조직 구조를 묘사합니다. 선택한 파장에서 배출을 수집하고 512x512 픽셀 해상도를 설정합니다.그런 다음 라이브를 클릭하여 이미징을 시작하여 필요에 따라 게인 수준을 조정합니다. 흉부 임플란트의 상단에 초점을 맞추고 선택하여 Z 스택의 시작을 정의하기 시작합니다. 그런 다음 5 마이크로미터의 Z 단계 크기를 사용하여 Z 스택의 끝을 정의하기 위해 시각화할 수 있는 이식된 흉선의 마지막 평면에 초점을 맞추고 끝을 선택합니다.각 Z 스택을 획득하기 위한 시간 간격을 1.5초에서 2초 동안 설정하고 연속 이미징을 위한 획득-중지 옵션을 선택합니다. 그런 다음 레코딩을 초기화하기 시작하려면 클릭합니다. 여기서, 조직 성장 및 연속성 및 연속 연구의 이중 거시적 후속을 위해 봉사할 수 있는 흉선 임플란트의 동일한 영역의 밝은 필드 및 형광 심상이 나타난다.밝은 필드 이미지는 또한 이식 된 조직의 혈관화의 시각화를 용이하게, 시간이 지남에 따라 혈액 공급에 흉선 생리학의 의존성의 독특한 연구를 허용. 이 모델은 혈액 토런트에서 이식된 흉선으로세포 의 전이, RFP 표지된 상피 및 선택 과정 동안 흉부 임플란트에 들어가는 GFP 양성 전구 세포 사이의 접촉 추적, 흉부에서 백혈구의 세포 배설을 배분할 수 있게 한다. 이 절차를 시도하는 동안, 최적의 이식을위한 조직 노출을 최소화하고 또한 치유 하는 동안 섬유증을 감소 하는 동안 각막을 통해 무해 한 단편 절개를 허용 하는 눈의 절개 크기를 제한 하는 것을 기억 하는 것이 중요 하다.이 절차에 따라, 지역화 된 제어 치료 및 다른 조직의 절개와 같은 다른 방법은 감염, 불응성 결정요인 및 이식 내성 메커니즘에 연결된 면역 기능 장애에 대한 추가 질문에 대답할 수 있도록 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 면역학 분야의 연구원들이 선조 모집, 흉선 눈 역학 및 생체 내 성숙한 T 세포 퇴각 단계를 포함하여 T 세포 개발을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

연구

생물학

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...