Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet ved NIH tilskudd R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) og R21ES025673 (AC), og den beste/2015/043 grant (Consellería de Educació, cultura jeg esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spania) (EO). Forfatterne takker de sendt ved Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spania og Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spania for deres hjelp med filming og redigering.

Institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Miami godkjent alle eksperimenter i henhold IACUC retningslinjer.
1. isolering og Trimming av nyfødte Thymi
<ol><li>Forberede alle reagenser og instrumenter av autoklavering eller andre metoder, sikre sterile forhold.</li>
	<li>For å minimere forurensing, utføre alle kirurgiske prosedyrer under laminær strømning hette.</li>
	<li>Før euthanizing donor mus, Fyll en 60 mm sterilt rett med sterilt prechilled 1 x fosfat-...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Betydningen av T-celle modning prosessen for individuelle immun kompetanse4 og antatte virkningen av forløperen celle dynamikken på modne T-celler produsert av thymus2,3, har omfattende arbeid blitt investert å utvikle alternativer til den klassiske faste vev øyeblikksbilde tilnærmingen.
Selv om vev skiver og andre explants er bedre enn inne reproduserbar vev arkitektur enn monolayers eller samlet thymic or...

Intrathymic T-celle differensiering og T-celle subpopulasjon utvalg utgjør nøkkelprosesser for utvikling og vedlikehold av celle-mediert immunitet i virveldyr1. Denne prosessen innebærer en omfattende rekke tett organiserte arrangementer inkludert rekruttering av progenitors fra blodet, celle spredning og migrasjon, differensial uttrykk for membran proteiner og massiv programmert celledød for delsett utvalg. Resultatet er utgivelsen av modne T-celler reaktiv til et stort spekter av utenlandske antigener mens minimerte Svar å selv-peptider som ender opp kolonisere perifere lymfoide organer av enkelte2,3. Avvikende thymocyte utvalg av αβTCR repertoaret fører til autoimmune sykdommer eller immun ubalanse4 som hovedsakelig avledet defekter i prosessene av negative eller positive forløper utvalg, henholdsvis.
Retningsbestemt overføring av thymocytes over thymus er sentral i alle faser av T-celle modning og det er tenkt som en rekke simultan eller sekvensiell flere stimuli, inkludert chemokines, lim, og de selvklebende ekstracellulær matrix (EFM) protein interaksjoner3,5. Studiet av fast vev har gjort kritisk informasjon om mønstre av uttrykk for thymocyte trekkfugler bunker i definerte thymic microenvironments5,6, mens ex vivo studier har avdekket to utbredt vandrende atferd av thymocytes i to histologisk forskjellige områder av orgelet: slow Stokastisk bevegelser i cortex og rask, trange motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. økt vandrende priser korrelerer med thymic positive utvalg13 og negative utvalg er forbundet med virkemåte for kravlesøk støtter hypotesen at the kinetics av turen gjennom thymus avgjør riktig modning av thymocytes. Til tross for deres relevans fortsatt topologien for thymocyte-stromal cell interaksjoner og dynamikken i thymocyte motilitet over organ microenvironments under T-celle modning dårlig definerte.
De fleste ex vivo studier utført hittil inkluderer fosterets eller Kumuler på nytt thymic orgel kulturer14,15, vev skiver eller intakt thymic lobe explants der thymocyte bevegelser er visualisert ved to-fotonet laserskanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital tenkelig teknikk med begrenset maksimalt arbeidsavstand og tenkelig dybdeskarphet 1 mm i samsvar med vevet undersøkt16. I motsetning til de arbeidskrevende thymic orgel kulturene avhengig utvidet inkubasjon ganger skjemaet 3D-strukturer, både thymic stykke teknikken og intakt thymic lobe tilnærming tillatelse kontrollert innføring av bestemt delsett av pre merket thymocytes i en innfødt vev arkitektur miljø. Men siden blodstrøm er fraværende i disse modellene, de er tydelig begrenset for å studere rekrutteringsprosessen av thymus settling progenitors (TSPs) thymus parenchyma eller dynamikken i thymic egression av modne T-celler.
I vivo modeller for studier av thymic T-celle modning fysiologi i mus inkluderer graftene fragmenter eller hele orgel lobes plassert enten i nyre kapsel17 eller intradermally18. Selv om disse alternativene viste deres nytte å forhøre systemisk funksjonelle engraftment av vev, begrenser plasseringen av thymic grafts dypt inne dyr eller dekket av lag med ugjennomsiktig vev bruken for i vivo undersøkelse av implantater av TPLSM.
Det fremre kammeret av øyet gir en lett tilgjengelig plass for direkte overvåking av alle podet vev i kraft av gjennomsiktigheten av hornhinnen lag. Fordel er bunnen av kammeret dannet av iris rikt på blod fartøy og autonome nerveender, muliggjør rask revaskularisering og reinnervation av grafts19,20. Dr. Caicedo har brukt dette anatomiske området for vedlikehold og langtidsstudie av bukspyttkjertelen holmer i siste21. Her viser vi at denne strategien ikke bare utgjør en gyldig tilnærming for å studere thymocytes' dynamikken i den opprinnelige orgel strukturen, men også unikt tillater for å forlenge den i vivo langsgående opptak til studiet av stamfar rekruttering og modne T-celle egression trinn i mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Formålet med metoden som presenteres er å vise for første gang, transplantasjon av nyfødte thymi i fremre øye kammeret av isogenic voksen mus i vivo langsgående sanntids overvåking av thymocytes´ dynamikken i en Stangeriaceae Brisselen segmentet. Etter transplantasjon lar laserskanning mikroskopi (LSM) gjennom hornhinnen i vivo noninvasive gjentatte bildebehandling på mobilnettet oppløsning nivå. Viktigere, legger tilnærming til forrige intravital T-celle modning imaging modeller mulighet for kontinuerlig stamfar celle rekruttering og modne T-celle egress opptak i samme dyret. Ytterligere fordeler av systemet er gjennomsiktigheten av podet området, tillater makroskopisk rask overvåking av implantert vev, og tilgjengeligheten til implantatet tillater lokalisert i tillegg til systemisk behandlinger. Hovedbegrensningen er volumet av vev som passer i det nedsatte mellomrom av øyet kammer som krever for lobe trimmer. Orgel integritet er maksimert av dissecting thymus lobes i mønstre tidligere vist seg å være funksjonell for modne T-celle produksjon. Teknikken er muligheter egnet til å lage en kunstnerkoloni medisinsk relevante spørsmål knyttet til thymus funksjon som inkluderer autoimmunitet, immunsvikt og sentrale toleranse; prosesser som er mechanistically dårlig definert. Den fine Disseksjon av mekanismer guiding thymocyte overføring, differensiering og utvalg bør føre til romanen strategier målretting utvikle T-celler.

Brisselen fra nyfødte mus ble isolert fra B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas mus som beskrevet i denne protokollen (trinn 1.1-1,9). I transgene mus angir kylling beta begrepsordbok arrangøren uttrykket av den røde fluorescerende protein varianten DsRed. MST under påvirkning av den cytomegalovirus (CMV) umiddelbar tidlig enhancer tilrettelegge sporing av implantater.
Å hindre vevsavvisning, isogenic personer med gen...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Sanntid i Vivo sporing av Thymocytes i fremre kammer av øyet ved bruk av Laser mikroskopi

Målet med protokollen er å vise langsgående intravital sanntidssporing av thymocytes ved bruk av laser mikroskopi thymic implantater i fremre kammer av musen øyet. Gjennomsiktigheten av hornhinnen og endometrial blodkar av graftet tillater kontinuerlig opptak stamfar celle rekruttering og modne T-celle egress.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen immunologifeltet om mekanismene for autoimmunitet, immunsvikt, sentral toleranse og thymus involution. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater in vivo langsgående registrering av stamfarrekruttering og moden T-celleegression innenfor vaskulariserte og podet mus thymus segmenter. Selv om denne metoden kan gi innsikt i utviklingen og funksjonen til thymus, kan også brukes på andre vev som bukspyttkjertel holmer eller nyreglomeruli.For å isolere thymus, plasser musen på sterile absorberende papirhåndklær i den dorsale oppreist stilling i en laminær strømningshette og spray og tørk av muselivet med 70% etanol. Lag et overfladisk V-formet snitt i underlivet for å utsette thoraxhulen og bruke et par rette 10-centimeter dissekering saks for å gjøre en 0,5 til en centimeter snitt i brystet langs ventral midtlinjen. Brett huden over hver side av brystet for å utsette thoraxhulen og gjøre to ekstra dypere 0,5 til en centimeter laterale snitt gjennom membranen og brystkassen for å få tilgang til det overlegne mediastinum i det fremre thoraxhulen.Thymus skal vises som to bleke fliker rett over hjertet. Plasser buede kraftspisser under thymus og trekk vertikalt for å trekke ut hele orgelet, og forhindre folding av brystkassen med et par rette tang. Senk deretter den isolerte thymus i en steril 60-milliliter tallerken som inneholder kaldsteril PBS på is og bruk en skalpell til å kutte bindemus for å skille de thymiske fliker.Før transplantasjon, tag og veie hver mottaker mus og plassere det første dyret i en side lateral liggende posisjon med ett øye direkte utsatt for linsen av et dissekere mikroskop. Bruk Vannas saks, avgiftsdirektoratet en av de isolerte thymic fliker opp til en millimeter i bredde etter en sikksakk mønster for å sikre at hvert segment inneholder noen thymic cortex og medulla vev. Det er viktig å trimme thymus rett før implantasjonen som store biter kan ikke engraft riktig.Deretter starter ved foten av hornhinnen i operasjonsområdet, bruk spissen av en 40-millimeter 18-gauge nål for å lage et lite snitt i eksterne hornhinnen lag slik at spissen av et par dissekering saks kan innføres. Bruk saksen til å gjøre en fem til 10-millimeter flanke snitt direkte rundt bunnen av hornhinnen mens du bruker flat-end tang å fast holde hornhinnen åpen for å hindre resealing. Gripe kuttet hornhinnen epitel med flat-end tang, opprettholde åpningen i hornhinnen mens du setter inn et thymisk segment gjennom åpningen.Det er viktig å sette inn thymus stykket raskt gjennom hornhinnen åpningen for å hindre spontan resealing før vevet er introdusert. Vær forsiktig med å bevare vevsintegritet på dette trinnet. Trykk mykt på øyeoverflaten for å skyve det introduserte vevssegmentet til en lateral stilling med hensyn til eleven for å bevare øyets funksjon.Og bruk flate tang til å trykke på begge sider av hornhinnen åpningen fast mot hverandre i tre til fem sekunder for å fremme selvtetning. Hvis transplantasjonen skal utføres på begge øyne, slå musen på motsatt sideside for en andre implantasjon som nettopp demonstrert. Når operasjonen er fullført, returner musen til et tomt bur forvarmet med en varmelampe med overvåking til full recumbency.På riktig eksperimentelt tidspunkt plasserer du en bedøvet mottakermus på en fast-trinns mikroskopplattform i en sidesidesideliggende posisjon på en varmepute med ett øye vendt opp. Og sett musens hode inn i en stereotaksisk hodeholder. Juster knotten for å holde musehodet i sideposisjon for å gi direkte tilgang til mikroskopet objektivt til øyet som holder thymus graft og trekk tilbake øyelokkene mens du holder øyet på hornhinnen margin med et par pinsett-tips dekket av en polyetylen rør festet til en UST-2 solid universell ledd.Tilsett noen dråper steril saltvann eller kunstige tårer mellom hornhinnen og linsen før du plasserer 5X-mikroskopmålet på museøyet og finn thymus i mikroskopfeltet. Bytt deretter til et høyere oppløsnings vann nedsenkingsdyppingsmål med lang arbeidsavstand og velg oppkjøpsmodus i mikroskopprogramvaren. Start resonansskannermodus og velg XYZT-bildemodus.Slå på argonlaseren og juster kraften til 30% for fluorescens eksitasjon. Velg en passende eksitasjonslaserlinje og sett den acoustooptiske strålesplitterkontrollen for de riktige utslippsbølgelengdene ved hjelp av refleksjonsdeteksjon samtidig for å oppdage bakgrunnsscatter og for å avgrense vevsstrukturen. Samle utslippene ved den valgte bølgelengden og angi en oppløsning på 512 to 512 piksler.Klikk deretter live for å starte bildet, justere forsterkningsnivået etter behov. Fokuser på toppen av thymic implantatet og velg begynne å definere begynnelsen av Z-stakken. Deretter fokuserer du på det siste planet i den implanterte thymus som kan visualiseres og velge slutten for å definere slutten av Z-stakken ved hjelp av en Z-trinnsstørrelse på fem mikrometer.Angi tidsintervallet for anskaffelsen av hver Z-stabel i 1,5 til to sekunder, og velg alternativet henting til stoppet for kontinuerlig bildebehandling. Klikk deretter start for å initialisere opptaket. Her vises bilder av lysfelt og fluorescens av det samme området av thymusimplantatet som kan tjene til en dobbel makroskopisk oppfølging av vevsvekst og involution og videreføringsstudier.Det lyse feltbildet letter også visualisering av vaskulariseringen av det implanterte vevet, slik at den unike studien av avhengigheten av thymus fysiologi på blodtilførsel over tid. Denne modellen tillater visualisering av celletransmigrasjon fra blodstrømmen til den implanterte thymus, sporing av kontaktene mellom GFP-positive stamceller som kommer inn i thymic implantatet med RFP-merket bosatt thymic epitel og stromal celler under differensiering og utvelgelsesprosesser, samt overvåking av de utgående immuncellene fra thymus til perifere blodkar. Mens du prøver denne prosedyren, Det er viktig å huske å minimere vev eksponering for optimal engraftment og også å begrense snitt størrelse i øyet for å tillate uskadd fragment excision gjennom hornhinnen samtidig redusere fibrose under healing.Etter denne prosedyren kan andre metoder som lokaliserte kontrollbehandlinger og snitt av andre vev i det kontralaterale øyet utføres for å svare på flere spørsmål om immundysfunksjoner knyttet til infeksjoner, involution determinanter og transplantasjonstoleransemekanismer. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen immunologi for å utforske T-celleutvikling, inkludert stamfarrekruttering, thymus-eye dynamikk og modne T-celle egression trinn i vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time analyser av Retinol Transport av membranen Receptor av Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonal Sporing av Hematopoetiske Stem og stamceller Preget av fem Fluorescent Proteiner bruker Confocal og multiphoton Mikros

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserte Real-time PCR tilnærminger for kvantitativ måling av microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics med variabel vinkel epifluorescens Mikros

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Måle Stivhet<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Aorta Bruke Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...