Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) e R21ES025673 (AC) e pela concessão melhor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura eu esport, Generalitat valenciana, Valência, Espanha) (EO). Autores agradecer a equipe enviada na Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valência, Espanha e Alberto Hernandez no Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valência, Espanha, por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo.

O cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os experimentos de acordo com as diretrizes IACUC.
1. isolamento e corte de recém-nascido Thymi
<ol><li>Prepare todos os reagentes e instrumentos por autoclavagem ou outros métodos, garantindo condições estéreis.</li>
	<li>Para minimizar as contaminações, execute todos os procedimentos cirúrgicos sob uma capa de fluxo laminar.</li>
	<li>Antes da eutanásia ratos doador, ench...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Devido a importância do processo de maturação de células T de competência imunológica individual4 e o presumível impacto da dinâmica de célula precursora na T-células maduras, produzidas pela Timo2,3, grandes esforços foram investidos desenvolver alternativas para a abordagem de instantâneo clássico tecido fixo.
Apesar de fatias de tecido e outros explantes são claramente superiores em reproduzir a...

Diferenciação de células T intratímica e seleção de subpopulação de células T constituem processos-chave para o desenvolvimento e a manutenção da imunidade mediada por células de vertebrados1. Esse processo envolve uma sequência complexa de eventos firmemente organizados, incluindo o recrutamento de progenitores da corrente sanguínea, migração e proliferação celular, expressão diferencial de proteínas de membrana e morte celular programada maciça para subconjuntos seleção. O resultado é a liberação de T-células maduras reativas para um amplo espectro de antígenos estranhos ao exibir respostas minimizadas para autopeptídeos, que acabar-se colonizar os órgãos linfoides secundários do individual2,3. Seleção de timócitos aberrante do repertório αβTCR leva à doença auto-imune ou desequilíbrio imune4 que derivam principalmente de defeitos durante os processos de seleção de precursor negativo ou positivo, respectivamente.
Migração direcional de timócitos através do timo é intrínseca a todas as fases de maturação de células T e é previsto como uma série de simultânea ou sequencial a vários estímulos, incluindo quimiocinas, adesivas, e adesivo de matriz extracelular (ECM) 3,de interações proteína5. O estudo dos tecidos fixos tornou a informação crítica sobre os padrões de expressão de pistas migratórias de timócitos no microambiente tímico definidos5,6, enquanto estudos ex vivo revelou dois prevalente comportamentos migratórios de timócitos em duas áreas histologicamente distintas do órgão: lento movimentos estocásticos no córtex e motilidade rápida, confinada na medula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento taxas migratórias correlacionam com selecção positiva do Timo13 e seleção negativa é associada com o comportamento de rastreamento apoiam a hipótese de que a cinética da viagem através do Timo determina o próprio maturação dos timócitos. Apesar de sua relevância, a topologia de interações de células estromais de timócitos e a dinâmica da motilidade de timócitos em microambiente do órgão durante a maturação de células T continua mal definida.
A maioria dos ex vivo estudos realizados até à data incluem fetais ou reaggregate órgão tímico culturas14,15, fatias de tecido ou explantes lóbulo tímico intacta, onde os movimentos de timócitos são visualizados por varredura a laser de dois fotões microscopia (TPLSM)8, uma técnica de imagem intravital com um máximo restrito trabalhando a distância e profundidade de 1 mm de acordo com o tecido de imagem examinou16. Em contraste com as culturas de laborioso órgão do Timo que dependem de tempos de incubação prolongado para formar estruturas de 3D, ambos, a técnica de fatia do Timo e a introdução de autorização controlada de abordagem lóbulo tímico intacta de subconjuntos específicos de pre-rotulado timócitos em um ambiente de arquitetura do tecido nativo. No entanto, desde que o fluxo sanguíneo é ausente nestes modelos, eles são claramente limitados para estudar o processo de recrutamento de Timo resolução progenitores (TSPs) para o parênquima do timo ou a dinâmica de egression do timo de células T maduras.
Modelos in vivo para o estudo da fisiologia de maturação de células T do timo em ratos incluem os enxertos de fragmentos ou lóbulos de todo órgão colocados tanto no interior do rim cápsula17 ou18por via intradérmica. Embora essas opções mostraram sua utilidade para interrogar a enxertia funcional sistêmica do tecido, a posição dos enxertos tímicos profundamente dentro do animal ou cobertos por camadas de tecido opaco restringe seu uso para exame na vivo de implantes pela TPLSM.
Câmara anterior do olho fornece um espaço facilmente acessível para monitoramento direto de qualquer tecido enxertado em virtude da transparência das camadas da córnea. De vantagem, a base da câmara formada pela íris é rica em vasos sanguíneos e terminações nervosas autonômicas, permitindo rápida revascularização e reinervação dos enxertos19,20. Dr. Caicedo tem utilizado com sucesso este espaço anatômico para a manutenção e o estudo longitudinal de ilhotas pancreáticas nos últimos21. Aqui, nós mostramos que esta estratégia não só constitui uma abordagem válida para estudar a dinâmica dos timócitos dentro da estrutura do órgão nativo, mas também excepcionalmente permite estender o na vivo gravações longitudinais para o estudo do recrutamento de progenitor e egression de células T madura passos em mouse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

O objetivo do método a ser apresentado é para mostrar, pela primeira vez, o transplante de recém-nascido thymi na câmara anterior do olho do isogénicas ratos adultos na vivo longitudinal monitoramento em tempo real da dinâmica de thymocytes´ dentro de um vascularizado segmento de timo. Após o transplante, laser, microscopia (LSM) através da córnea permite na vivo não invasiva imagens repetidas no nível celular resolução. Importante, a adiciona a maturação de células T intravital anterior modelos de imagem a possibilidade de recrutamento de células progenitoras contínua e gravações de egresso de células T maduras no mesmo animal. Vantagens adicionais do sistema são a transparência da área enxertada, permitindo monitoramento rápido macroscópico do tecido implantado, e a acessibilidade ao implante permitindo localizadas além de tratamentos sistémicos. A principal limitação, sendo o volume do tecido que se encaixa no espaço reduzido da câmara do olho que exige para o aparamento de lobo. Integridade do órgão é maximizada dissecando lobos do timo em padrões mostrados anteriormente para ser funcional para a produção de células T madura. A técnica é potencialmente adequada para interrogar um meio de clinicamente relevantes questões relacionadas com a função do Timo que incluem auto-imunidade, imunodeficiência e tolerância central; processos que permanecem mecanicamente mal definidos. A dissecação bem dos mecanismos orientadores timócitos migração, diferenciação e seleção deve levar a novas estratégias terapêuticas, visando o desenvolvimento de células T.

Timo de camundongos recém-nascidos foram isoladas a partir B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratos, conforme descrito no presente protocolo (etapas 1,1-1,9). Nestes ratos transgénicos, o promotor do frango beta actina direciona a expressão da variante da proteína fluorescente vermelha DsRed. MST sob a influência do realçador início imediato citomegalovírus (CMV), facilitando o rastreamento dos implantes.
Para e...

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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunologia sobre os mecanismos de autoimunidade, imunodeficiência, tolerância central e involução de timo. A principal vantagem dessa técnica é que permite o registro longitudinal in vivo do recrutamento progenitor e a egressão madura de células T nos segmentos de timo de camundongos vascularizados e enxertados. Embora este método possa fornecer uma visão sobre o desenvolvimento e a função do timo, também pode ser aplicado a outros tecidos, como ilhotas pancreáticas ou glomeruli renal.Para isolar o timo, coloque o rato em toalhas de papel absorvente estéreis na posição dorsal vertical em um capô de fluxo laminar e pulverize e limpe o abdômen do rato com 70% de etanol. Faça uma incisão superficial em forma de V no abdômen inferior para expor a cavidade torácica e use um par de tesouras dissecando 10 centímetros em linha reta para fazer uma incisão de 0,5 a um centímetro no peito ao longo da linha média ventral. Dobre a pele sobre cada lado do peito para expor a cavidade torácica e faça duas incisões laterais adicionais de 0,5 a um centímetro através do diafragma e da caixa torácica para acessar o mediastino superior na cavidade torácica anterior.O timo deve aparecer como dois lóbulos pálidos bem acima do coração. Coloque as pontas de força curvas sob o timo e puxe verticalmente para extrair o órgão completo, impedindo a dobra traseira da caixa torácica com um par de fórceps retos. Em seguida, submergir o timo isolado em um prato estéril de 60 mililitros contendo PBS estéril frio no gelo e usar um bisturi para cortar o istmo conjuntivo para separar os lóbulos timímicos.Antes do transplante, marque e pese cada rato receptor e coloque o primeiro animal em uma posição lateral lateral recumbent com um olho diretamente exposto à lente de um microscópio dissecando. Usando uma tesoura Vannas, extireta um dos lobos timímicos isolados de até um milímetro de largura seguindo um padrão em ziguezague para garantir que cada segmento contenha algum córtex timiático e tecido medulla. É fundamental aparar o timo antes da implantação, pois peças grandes podem não ser maltratadas corretamente.Em seguida, a partir da base da córnea da área cirúrgica, use a ponta de uma agulha de calibre 18 de 40 milímetros para fazer uma pequena incisão em camadas externas de córnea para que a ponta de um par de tesouras dissecando possa ser introduzida. Use a tesoura para fazer uma incisão flanco de 5 a 10 milímetros diretamente ao redor da base da córnea enquanto usa fórceps de ponta plana para manter firmemente a córnea aberta para evitar o resealing. Agarrando o epitélio córnea cortado com as fórceps de ponta plana, mantenha a abertura na córnea ao inserir um segmento timêmico através da abertura.É importante inserir a peça de timo rapidamente através da abertura da córnea para evitar o resealing espontâneo antes do tecido ser introduzido. Tenha cuidado para preservar a integridade do tecido nesta etapa. Pressione suavemente na superfície dos olhos para deslizar o segmento de tecido introduzido para uma posição lateral em relação à pupila para preservar a função do olho.E use fórceps planos para pressionar ambos os lados da abertura da córnea firmemente um contra o outro por três a cinco segundos para promover a auto-vedação. Se o transplante for realizado em ambos os olhos, vire o rato para o lado lateral oposto para uma segunda implantação como apenas demonstrado. Quando a cirurgia estiver completa, devolva o rato a uma gaiola vazia pré-aquecida com uma lâmpada de calor com monitoramento até a recumbência total.No ponto de tempo experimental apropriado, coloque um mouse receptor anestesiado em uma plataforma de microscópio de estágio fixo em uma posição lateral lateral reclinável em uma almofada de calor com um olho voltado para cima. E insira a cabeça do mouse em um suporte de cabeça estereotaxic. Ajuste o botão para conter a cabeça do rato na posição lateral lateral para permitir o acesso direto do objetivo do microscópio ao olho segurando o enxerto de timo e puxe as pálpebras enquanto segura o olho na margem da córnea com um par de pontas de pinça cobertas por um tubo de polietileno ligado a uma articulação universal sólida UST-2.Adicione algumas gotas de soro fisiológico estéril ou lágrimas artificiais entre a córnea e a lente antes de colocar o objetivo do microscópio 5X no olho do mouse e localizar o timo no campo do microscópio. Em seguida, mude para um objetivo de imersão de água de maior resolução com uma longa distância de trabalho e selecione o modo de aquisição no software de microscópio. Inicie o modo de scanner de ressonância e selecione o modo de imagem XYZT.Ligue o laser de argônio e ajuste a potência para 30% para excitação de fluorescência. Selecione uma linha laser de excitação apropriada e defina o controle do divisor de feixes óptico para os comprimentos de onda de emissão apropriados usando a detecção de reflexão simultaneamente para detectar backscatter e delinear a estrutura tecidual. Colete a emissão no comprimento de onda selecionado e defina uma resolução de 512 por 512 pixels.Em seguida, clique ao vivo para iniciar a imagem, ajustando os níveis de ganho conforme necessário. Concentre-se na parte superior do implante timiço e selecione começar a definir o início da pilha Z. Em seguida, concentre-se no último plano no timo implantado que pode ser visualizado e selecione a extremidade para definir a extremidade da pilha Z usando um tamanho de passo Z de cinco micrômetros.Defina o intervalo de tempo para a aquisição de cada pilha Z por 1,5 a dois segundos e selecione a opção de aquisição até o intervalo para imagens contínuas. Em seguida, clique em iniciar a gravação. Aqui, imagens de campo brilhante e fluorescência da mesma área do implante de timo que pode servir para um duplo acompanhamento macroscópico do crescimento tecidual e estudos de involução e continuação são mostrados.A imagem de campo brilhante também facilita a visualização da vascularização do tecido implantado, permitindo o estudo único da dependência da fisiologia do timo no suprimento de sangue ao longo do tempo. Este modelo permite a visualização da transmigração celular da torrente sanguínea para o timo implantado, o rastreamento dos contatos entre as células progenitoras GFP-positivas que entram no implante timiço com epiteliais e células estrômicas residentes rotuladas pela RFP durante processos de diferenciação e seleção, bem como o monitoramento das células imunes egressivas do timo ao tímumo em vasos sanguíneos periféricos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para minimizar a exposição tecidual para o enxerto ideal e também para limitar o tamanho da incisão no olho para permitir excisão de fragmentos ilesos através da córnea enquanto reduz a fibrose durante a cicatrização.Após esse procedimento, outros métodos como tratamentos de controle localizado e incisão de outros tecidos no olho contralateral podem ser realizados de modo a responder perguntas adicionais sobre disfunções imunológicas ligadas a infecções, determinantes de involução e mecanismos de tolerância ao transplante. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunologia explorarem o desenvolvimento de células T, incluindo recrutamento de progenitores, dinâmica de olho de timo e passos maduros de egressão de células T in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...