Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH грантов R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) и R21ES025673 (AC) и лучшие/2015/043 Грант (Consellería де Educació, cultura я киберспорта, Женералитата valenciana, Валенсия, Испания) (ЭО). Авторы благодарят команду отправлено в Universidad Católica де Валенсия Сан Висенте Мартир, Валенсия, Испания и Альберто Эрнандес в Centro de Investigación Принсипе Фелипе, Валенсия, Испания, за их помощь с видео съемки и редактирования.

Все эксперименты согласно рекомендациям IACUC одобрил институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Майами.
1. изоляция и обрезки новорожденных Thymi
<ol><li>Подготовьте все реагенты и инструменты автоклавирования или других методов, обеспечени...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Ввиду важности процесса созревания Т-клеток для индивидуальной иммунной компетентности4 и предполагаемого воздействия прекурсоров клеток динамики на зрелых Т-клетки, производимые тимуса2,3инвестировали значительные усилия разработать ал?...

Intrathymic Т-клеточная дифференцировка и выбор субпопуляции Т-клеток являются ключевых процессов для развития и поддержания клеточного иммунитета в позвоночных1. Этот процесс включает в себя сложные последовательности плотно организованных мероприятий, включая вербовку прародителей от крови, пролиферации и миграции, дифференциальной выражение мембранных белков, и массивные запрограммированная смерть клетки для подмножества выбор. Результатом является освобождение зрелых Т-клетки реагируют на большой спектр иностранных антигены во время отображения свернутого ответы на self пептиды, которые конца вверх колонизировать периферических лимфоидных органов отдельных2,3. Аберрантное тимоцитов выбор репертуара αβTCR приводит к аутоиммунным заболеванием или иммунных дисбаланс4 , которые главным образом являются производными от дефектов во время процесса отбора положительное или отрицательное прекурсоров, соответственно.
Направления миграции тимоцитов через тимуса является неотъемлемой частью всех стадий созревания Т-клеток и это предусмотрено как серию одновременное или последовательное несколько стимулов, включая chemokines, клей, и снять клей внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия протеина3,5. Изучение фиксированных тканей оказывает крайне необходимую информацию о характере выражения для мигрирующих подсказки тимоцитов в определенных тимуса микросреды5,6, в то время как ex vivo исследований выявил два распространенных мигрирующие поведение тимоцитов в два гистологически различных областях органа: медленный Стохастический движений в коре и быстрый, ограничивается подвижность в продолговатого мозга-7,-8,9,10 , 11 , 12 , 13. увеличение миграционных ставки коррелируют с тимуса позитивного выбора13 и негативный выбор связан с поддерживая гипотезу, что кинетика путешествие через тимуса определяет правильное поведение при обходе созревания тимоцитов. Несмотря на их актуальности топология взаимодействия тимоцитов стромальных клеток и динамика тимоцитов моторики через орган микросреды во время созревания Т-клеток остаются плохо определены.
Большинство ex vivo исследования на сегодняшний день включают плода или reaggregate тимуса орган культур14,15, кусочки ткани или эксплантов нетронутыми доли тимуса, где тимоцитов движений визуализируются два фотона лазерного сканирования микроскопия (TPLSM)8, прижизненные изображения технику с ограниченным максимальное рабочее расстояние и визуализации глубиной 1 мм в соответствии с ткани изучены16. В отличие от кропотливого тимуса орган культур, которые зависят от расширенной инкубации раз в виде 3D-структуры, предварительно помечены как, тимуса ломтик технику, так и нетронутыми доли тимуса подход разрешение контроль введения определенных подмножеств тимоцитов в среду архитектуры родной ткани. Однако, так как поток крови отсутствует в этих моделях, они явно ограничены для изучения процесса набора персонала, урегулирования прародителями (ОТУ) тимуса паренхиме или динамика тимуса egression зрелых Т-лимфоцитов тимуса.
В естественных условиях модели для изучения тимуса Т-клеточной физиологии созревания в мышах включают графтов фрагментов или весь орган лопастями, размещены либо внутри почек капсула17 или intradermally18. Хотя эти варианты показал их полезности допросить системного функционального приживления ткани, позиция тимуса графтов глубоко внутри животного или охваченных слоев непрозрачной ткани ограничивает их использование для экспертизы в vivo имплантатов TPLSM.
Передней камеры глаза обеспечивает легкодоступными пространство для непосредственного мониторинга любых привитые ткани благодаря прозрачности роговицы слоя. Преимущество основание камеры, образованной радужки богат кровеносных сосудов и вегетативной нервных окончаний, позволяя быстрое реваскуляризации и Реиннервация графтов19,20. Д-р Caicedo успешно использовал это анатомические пространство для поддержания и продольной исследование панкреатических островков в прошлом21. Здесь мы показываем, что эта стратегия не только представляет собой допустимый подход к изучению тимоцитов динамика в структуре родной орган, но также однозначно разрешает продлить в vivo продольной записи к изучению прародитель вербовки и зрелых Т-клеточной egression шаги в мыши.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Представлен метод призвана показать, в первый раз, пересадка новорожденных thymi в передней глаз палаты isogenic взрослых мышей в vivo продольной реального времени мониторинга динамики thymocytes´ в пределах васкуляризированной Тимус сегмент. После трансплантации лазерной сканирующей микроскопии (МИС) через роговицу позволяет в vivo неинвазивной повторяющихся изображений на уровне клеточных резолюции. Важно отметить, что подход добавляет предыдущих прижизненной созревание Т-клеток, визуализации модели возможность непрерывного прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выход записи в то же самое животное. Дополнительные преимущества системы являются прозрачность привитые области, позволяющие макроскопических быстрого мониторинга имплантированных ткани, и доступность для имплантации, позволяя для локализованных в дополнение к системной терапии. Основным ограничением является объем ткани, вписывается в ограниченном пространстве глаз камеры, которая требует для обрезки лепестка. Целостности органа максимизируется путем рассечения тимуса лопастями в шаблоны, ранее показанный функциональным для зрелых Т-клеток производства. Техника потенциально подходит допросить окружение медицински соответствующих вопросов, связанных с тимуса функции, которые включают аутоиммунные заболевания, приобретенного иммунодефицита и центральной толерантности; процессы, которые остаются механистически плохо определены. Тонкой рассечение руководящих тимоцитов миграции, дифференциация и выбор механизмов должно привести к Роман терапевтические стратегии ориентации развивающихся Т-клеток.

Тимус от новорожденных мышей были изолированы от B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Жас мышей, как описано в настоящем Протоколе (шаги 1,1-1,9). В этих трансгенных мышей промоутер актина курица бета направляет выражение Красного флуоресцирующего белка вариант DsRed. MST под влиянием цито?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

В режиме реального времени в Vivo отслеживания тимоцитов в передней камере глаза лазерная сканирующая микроскопия

Целью протокола является показать продольной прижизненной слежение в реальном времени тимоцитов, лазерной сканирующей микроскопии в тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Прозрачность роговицы и васкуляризация трансплантат позволяет непрерывно записывать прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выхода.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии о механизмах аутоиммунных заболеваний, иммунодефицита, центральной толерантности и интулации тимуса. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет в vivo продольной записи набора прародителя и зрелой Т-клеточной экгрессии в васкуляризированных и привитых сегментах тимуса мыши. Хотя этот метод может дать представление о развитии и функции тимуса, также может быть применен к другим тканям, таким как островки поджелудочной железы или гломерули почек.Чтобы изолировать тимус, поместите мышь на стерильные абсорбентные бумажные полотенца в спинном вертикальном положении в капюшоне ламинарного потока и распылите и протрите живот мыши 70% этанола. Сделайте поверхностный V-образный разрез в нижней части живота, чтобы разоблачить грудную полость и использовать пару прямых 10-сантиметровых рассекающих ножниц, чтобы сделать разрез на 0,5-1 сантиметр в груди вдоль брюшной средней линии. Сложите кожу по обе стороны грудной клетки, чтобы разоблачить грудной полости и сделать два дополнительных глубже 0,5 до одного сантиметра боковых разрезов через диафрагму и грудную клетку для доступа к превосходной медиастинии в передней грудной полости.Тимус должен выглядеть как две бледные доли прямо над сердцем. Поместите изогнутые force под тимус и потяните вертикально, чтобы извлечь полный орган, предотвращая складной задней части грудной клетки с парой прямых типсов. Затем погрузите изолированный тимус в стерильное 60-миллилитровое блюдо, содержащее холодный стерильный PBS на льду, и используйте скальпель, чтобы сократить соединительный перешеек, чтобы отделить тимические доли.Перед трансплантацией пометите и взвесите каждую мышь-реципиент и поместите первое животное в боковое боковое лежачий положение с одним глазом, непосредственно подвергаемым воздействию объектива рассеченного микроскопа. Используя ножницы Vannas, акциз один из изолированных тимических долей до одного миллиметра в ширину после зигзагообразной картины, чтобы гарантировать, что каждый сегмент содержит некоторые тимической коры и ткани медуллы. Очень важно, чтобы обрезать тимус прямо перед имплантацией, как большие куски не могут engraft должным образом.Далее, начиная с основания роговицы хирургической области, используйте кончик 40-миллиметровой 18-калибровой иглы, чтобы сделать небольшой разрез во внешние слои роговицы, так что кончик пары рассечения ножницы могут быть введены. Используйте ножницы, чтобы сделать от пяти до 10-миллиметровый разрез фланга непосредственно вокруг основания роговицы при использовании плоских типсов, чтобы твердо держать роговицу открытой, чтобы предотвратить повторное пропечатывание. Хватая вырезать эпителия роговицы с плоскими типсами, поддерживать отверстие в роговице при вставке тимического сегмента через отверстие.Важно, чтобы вставить кусок тимуса быстро через отверстие роговицы, чтобы предотвратить спонтанное перепечатывание до введения ткани. Будьте осторожны, чтобы сохранить целостность тканей на этом этапе. Нажмите мягко на поверхность глаза, чтобы сдвинуть введенный сегмент ткани в боковое положение по отношению к зрачку, чтобы сохранить функцию глаза.И использовать плоские типсы, чтобы нажать обе стороны роговицы открытия твердо друг против друга в течение трех-пяти секунд для содействия самопечати. Если пересадка должна быть выполнена на обоих глазах, поверните мышь на противоположную боковую сторону для второй имплантации, как только что продемонстрировано. Когда операция будет завершена, верните мышь в пустую клетку, предварительно разогретую тепловой лампой с мониторингом до полного лежачих мест.В соответствующем экспериментальном времени, поместите анестезированной мыши получателя на фиксированной стадии микроскопа платформы в боковом боковом положении лежа на тепловой панели с одним глазом вверх. И вставьте голову мыши в стереотаксис держателя головы. Отрегулируйте ручку, чтобы сдержать голову мыши в боковом боковом положении, чтобы позволить прямой доступ микроскопа цели для глаз проведения трансплантата тимуса и оттянуть веки, удерживая глаз на роговице края с парой пинцет-советы покрыты полиэтиленовой трубки прилагается к UST-2 твердых универсальных суставов.Добавьте несколько капель стерильного солевого раствора или искусственных разрывов между роговицей и хрусталиком, прежде чем поместить цель микроскопа 5X на глаз мыши и найти тимус в поле микроскопа. Затем переключитесь на цель погружения воды более высокого разрешения с большим рабочим расстоянием и выберите режим приобретения в программном обеспечении микроскопа. Запустите режим резонансного сканера и выберите режим визуализации XY'T.Включите аргонный лазер и отрегулируйте мощность до 30% для возбуждения флуоресценции. Выберите соответствующую лазерную линию возбуждения и установите акусто-оптический пучок сплиттера для соответствующих длин волн выбросов, используя обнаружение отражения одновременно для обнаружения backscatter и разграничения структуры тканей. Соберите эмиссию на выбранной длине волны и установите разрешение пикселей 512 на 512.Затем нажмите в прямом эфире, чтобы начать визуализацию, регулируя уровни усиления по мере необходимости. Сосредоточьтесь на верхней части тимического имплантата и выберите начать определять начало стека. Затем сосредоточьтесь на последней плоскости в имплантированном тимусе, который можно визуализировать, и выберите конец, чтобы определить конец стека, используя размер в пять микрометров.Установите интервал времени для приобретения каждого стека в течение 1,5-двух секунд и выберите опцию приобретения до тех пор, пока не будет остановлена для непрерывного изображения. Затем нажмите кнопку начать инициализировать запись. Здесь показаны ярко-полевые и флуоресценционные изображения одной и той же области имплантата тимуса, которые могут служить для двойного макроскопического продолжения роста тканей и исследований инавертки и продолжения.Ярко-полевой образ также облегчает визуализацию васкуляризации имплантированных тканей, позволяя с течением времени уникально изучать зависимость физиологии тимуса от кровоснабжения. Эта модель позволяет визуализировать трансмиграцию клеток из кровотока в имплантированный тимус, отслеживание контактов между GFP-положительными клетками-предшественниками, входящими в тимический имплантат с RFP-маркировкой резидентных тимических эпителиальных и стромальных клеток во время процессов дифференциации и отбора, а также мониторинг регрессивных иммунных клеток из тимуса в периферические кровеносные сосуды. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы свести к минимуму воздействие тканей для оптимального engraftment, а также ограничить размер разреза в глазу, чтобы невредимые иссечения фрагмента через роговицу при одновременном снижении фиброза во время заживления.После этой процедуры, другие методы, такие как локализованное лечение контроля и разрез других тканей в контралатеральный глаз могут быть выполнены, с тем чтобы ответить на дополнительные вопросы о иммунных дисфункций, связанных с инфекциями, детерминанты и механизмы толерантности к трансплантации. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области иммунологии, чтобы исследовать развитие Т-клеток, в том числе прародителя набора, тимус-глаз динамики, и зрелые шаги регрессии Т-клеток in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

В естественных условиях микро-циркуляции Измерение в скелетной мышце путем Intra-жизненно микроскопии

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...