Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R56DK084321 (CA), R01DK084321 (CA), R01DK111538 (CA), R01DK113093 (CA) y R21ES025673 (CA) y por la concesión del mejor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Valencia, España) (EO). Autores agradecen al equipo enviado a la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, España y Alberto Hernández en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España por su ayuda con video filmación y edición.

El cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los experimentos según las pautas IACUC.
1. aislamiento y corte de recién nacido Thymi
<ol><li>Preparar todos los reactivos y los instrumentos por autoclave u otros métodos, asegurando las condiciones de esterilidad.</li>
	<li>Para minimizar la contaminación, realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo campana de flujo laminar.</li>
	<li>Antes euthanizing ratones donantes, llen...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

Debido a la importancia de la maduración de células T para competencia inmune individual4 y el presunto impacto de precursor celular dinámica en células T maduras producidas por el timo2,3, se han invertido grandes esfuerzos desarrollar alternativas al enfoque clásico tejido fijo instantánea.
Aunque claramente superiores en la reproducción de la arquitectura del tejido de monocapas o agregado órgano timo...

Diferenciación intratímica de células T y células T subpoblación selección constituyen procesos claves para el desarrollo y mantenimiento de la inmunidad mediada por células en vertebrados1. Este proceso implica una compleja secuencia de eventos firmemente organizados incluyendo el reclutamiento de progenitores de sangre, proliferación celular y migración, expresión diferencial de proteínas de la membrana y muerte celular programada masiva para subconjuntos selección. El resultado es la liberación de células T maduras reactivas a un amplio espectro de antígenos extraños mientras se muestra minimizado las respuestas para auto-péptidos, que final-hasta colonizar los órganos linfoides periféricos de los2,3. Selección de timocitos aberrante del repertorio αβTCR conduce a enfermedades autoinmunes o desequilibrio inmune4 que derivan principalmente de defectos durante los procesos de selección de precursor positiva o negativa, respectivamente.
La migración direccional de los timocitos en el timo es intrínseca a todas las etapas de maduración de la célula de T y es concebido como una serie de simultáneas o secuenciales múltiples estímulos, como quimioquinas, adhesivo, y pegamento de la matriz extracelular (ECM) proteína las interacciones3,5. El estudio de los tejidos fijos ha prestado información crítica con respecto a los patrones de expresión para señales migratorias thymocyte en microambientes tímicos definido5,6, mientras que los estudios ex vivo ha revelado dos frecuentes comportamientos migratorios de los timocitos en dos áreas histológico del órgano: lentos movimientos estocásticos en la corteza y la movilidad rápida, confinada en la médula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento tasas migratorias correlacionan con selección positiva tímica13 y selección negativa se asocia con comportamientos rastreros apoyan la hipótesis de que la cinética de la travesía por el timo determina apropiado maduración de los timocitos. A pesar de su importancia, la topología de las interacciones de células estromales de timocitos y la dinámica de movilidad de timocitos en microambientes del órgano durante la maduración de células T siendo mal definida.
Mayoría ex vivo de los estudios realizados hasta la fecha incluyen fetales o reagregarse timo órgano culturas14,15, rebanadas de tejido o explantes lóbulo tímico intacta donde se visualizan los movimientos anti-thymocyte por escaneo láser de dos fotones microscopia (TPLSM)8, una técnica con un máximo restringido distancia y profundidad de 1 mm según el tejido de imágenes intravital examinó16. En contraste con las culturas de órgano timo laboriosa en tiempos de incubación extendido para formar estructuras de 3D, tanto la técnica de slice tímico y la introducción de permiso de control de enfoque lóbulo tímico intacto de subconjuntos particulares de la etiqueta timocitos en un entorno de arquitectura de tejido propio. Sin embargo, puesto que el flujo sanguíneo está ausente en estos modelos, están claramente limitados para estudiar el proceso de contratación de timo colocar progenitores (TSPs) el parénquima del timo o la dinámica de egression timo de células T maduras.
Modelos in vivo para el estudio de la fisiología de maduración de células T tímico en ratones son los injertos de fragmentos o lóbulos del órgano entero colocados ya sea dentro de la cápsula renal17 o por vía intradérmica18. Aunque estas opciones demostraron su utilidad para interrogar sistémico funcional engraftment del tejido, la posición de los injertos tímicos profundos dentro del animal o cubiertos por capas de tejido opaco restringe su uso en vivo examen de implantes por TPLSM.
La cámara anterior del ojo proporciona un espacio de fácil acceso para monitoreo directo de los tejidos injertados en virtud de la transparencia de las capas corneales. De ventaja, la base de la cámara formada por el iris es rica en vasos sanguíneos y las terminaciones nerviosas autonómicas, lo que permite la rápida revascularización y reinervación de los injertos19,20. Dr. Caicedo ha utilizado este espacio anatómico para el mantenimiento y el estudio longitudinal de islotes pancreáticos en los últimos21. Aquí, mostramos que esta estrategia no sólo constituye un enfoque válido para estudiar la dinámica de timocitos dentro de la estructura del órgano nativo, pero también únicamente permite extender el en vivo grabaciones longitudinales para el estudio del reclutamiento del progenitor y pasos de egression células T madurados en ratón.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

El propósito del método presentado es mostrar, por primera vez, el trasplante de thymi recién en la cámara anterior del ojo de ratones adultos isogénicas para en vivo longitudinal seguimiento en tiempo real de la dinámica de thymocytes´ dentro de un vascularizado segmento de timo. Después del trasplante, láser, microscopía (LSM) a través de la córnea permite que en vivo no invasor proyección de imagen repetida a nivel celular de resolución. Lo importante es el enfoque agrega a maduración de células T intravital anterior imagen modelos la posibilidad de reclutamiento de células progenitoras continua y grabaciones de salida de células T maduras en el mismo animal. Ventajas adicionales del sistema son la transparencia de la zona injertada, permitiendo monitoreo rápido macroscópica del tejido implantado, y la accesibilidad al implante que permite localiza además de tratamientos sistémicos. La principal limitación es el volumen del tejido se ajusta en el reducido espacio de la cámara de ojo que exige para el ajuste del lóbulo. Se maximiza la integridad del órgano por disección lóbulos del timo en los patrones previamente demostrados ser funcionales para la producción de células T madura. La técnica es potencialmente adecuada para interrogar a un entorno de médicamente relevantes cuestiones relacionadas con la función del timo que incluyen autoinmunidad, inmunodeficiencia y tolerancia central; procesos que siguen siendo mecánico mal definidos. La disección fina de mecanismos rectores thymocyte migración, diferenciación y selección debe conducir a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a células T en desarrollo.

Timo de ratones recién nacidos fueron aislados de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratones como se describe en este protocolo (pasos 1.1-1.9). En estos ratones transgénicos, el promotor de pollo beta actina dirige la expresión de la variante de la proteína fluorescente roja DsRed. MST bajo la influencia de la inmediata temprana potenciador del citomegalovirus (CMV) facilitando el seguimiento de los implantes.
Para...

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Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre los mecanismos de autoinmunidad, inmunodeficiencia, tolerancia central e involución del timo. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro longitudinal in vivo del reclutamiento de progenitores y la salida de células T maduras dentro de segmentos de timo de ratón vascularizado e injertado. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo y la función del timo, también se puede aplicar a otros tejidos como los islotes pancreáticos o los glomérulos renales.Para aislar el timo, coloque el ratón sobre toallas de papel absorbentes estériles en la posición dorsal erguida en una capucha de flujo laminar y rocíe y limpie el abdomen del ratón con 70% de etanol. Haz una incisión superficial en forma de V en la parte inferior del abdomen para exponer la cavidad torácica y usa un par de tijeras diseccionadas rectas de 10 centímetros para hacer una incisión de 0.5 a un centímetro en el pecho a lo largo de la línea media ventral. Dobla la piel sobre cada lado del pecho para exponer la cavidad torácica y haz dos incisiones laterales más profundas de 0,5 a un centímetro a través del diafragma y la caja torácica para acceder al mediastino superior en la cavidad torácica anterior.El timo debe aparecer como dos lóbulos pálidos justo encima del corazón. Coloque las puntas curvas del óp parte del timo y tire verticalmente para extraer el órgano completo, evitando el plegado de la caja torácica con un par de fórceps rectos. A continuación, sumerja el timo aislado en un plato estéril de 60 mililitros que contenga PBS estéril en frío sobre hielo y use un bisturí para cortar el istmo conectivo para separar los lóbulos timicos.Antes del trasplante, etiqueta y pesa cada ratón receptor y coloca al primer animal en una posición lateral reclinado lateral lateral con un ojo expuesto directamente a la lente de un microscopio diseccionador. Usando tijeras Vannas, exteje uno de los lóbulos timicos aislados de hasta un milímetro de ancho siguiendo un patrón en zigzag para asegurarse de que cada segmento contiene algo de corteza timica y tejido de médula. Es fundamental recortar el timo justo antes de la implantación, ya que las piezas grandes pueden no injerto correctamente.A continuación, comenzando en la base de la córnea del área quirúrgica, utilice la punta de una aguja de 40 milímetros de 18 milímetros para hacer una pequeña incisión en las capas externas de la córnea de modo que se pueda introducir la punta de un par de tijeras diseccionadas. Utilice las tijeras para hacer una incisión de flanco de cinco a 10 milímetros directamente alrededor de la base de la córnea mientras usa fórceps de extremo plano para mantener firmemente la córnea abierta para evitar el resedimiento. Agarrando el epitelio corneal cortado con los fórceps planos, mantener la abertura en la córnea mientras se inserta un segmento timico a través de la abertura.Es importante insertar la pieza del timo rápidamente a través de la abertura corneal para evitar el resedor espontáneo antes de que se introduzca el tejido. Tenga cuidado de preservar la integridad del tejido en este paso. Presione suavemente sobre la superficie del ojo para deslizar el segmento de tejido introducido a una posición lateral con respecto a la pupila para preservar la función del ojo.Y utilice fórceps planos para presionar ambos lados de la abertura corneal firmemente uno contra el otro durante tres a cinco segundos para promover el autosellado. Si el trasplante se va a realizar en ambos ojos, gire el ratón hacia el lado lateral opuesto para una segunda implantación como acaba de demostrar. Una vez completada la cirugía, vuelva a colocar el ratón en una jaula vacía precalentada con una lámpara de calor con monitoreo hasta la recumbancia completa.En el punto de tiempo experimental apropiado, coloque un ratón receptor anestesiado en una plataforma de microscopio de etapa fija en una posición lateral en una almohadilla de calor con un ojo hacia arriba. E inserte la cabeza del ratón en un soporte de cabeza estereotaxico. Ajuste la perilla para sujetar la cabeza del ratón en la posición lateral lateral para permitir el acceso directo del objetivo del microscopio al ojo que sostiene el injerto de timo y tire hacia atrás de los párpados mientras sostiene el ojo en el margen corneal con un par de puntas de pinza cubiertas por un tubo de polietileno unido a una articulación universal sólida UST-2.Añadir unas gotas de solución salina estéril o lágrimas artificiales entre la córnea y la lente antes de colocar el objetivo del microscopio 5X en el ojo del ratón y localizar el timo en el campo del microscopio. A continuación, cambie a un objetivo de inmersión en agua de mayor resolución con una larga distancia de trabajo y seleccione el modo de adquisición en el software del microscopio. Inicie el modo de escáner de resonancia y seleccione el modo de imagen XYZT.Encienda el láser de argón y ajuste la potencia al 30% para la excitación de fluorescencia. Seleccione una línea láser de excitación adecuada y establezca el control del divisor de haz acousto-óptico para las longitudes de onda de emisión adecuadas utilizando la detección de reflexión simultáneamente para detectar la retroflujo y delinear la estructura del tejido. Recoja la emisión en la longitud de onda seleccionada y establezca una resolución de 512 por 512 píxeles.A continuación, haga clic en live para iniciar la imagen, ajustando los niveles de ganancia según sea necesario. Concéntrese en la parte superior del implante timico y seleccione comenzar a definir el comienzo de la pila Z. A continuación, concéntrese en el último plano del timo implantado que se puede visualizar y seleccione el extremo para definir el final de la pila Z utilizando un tamaño de paso Z de cinco micrómetros.Establezca el intervalo de tiempo para la adquisición de cada pila Z durante 1,5 a dos segundos y seleccione la opción acquire-until-stopped para la creación de imágenes continuas. A continuación, haga clic en Iniciar para inicializar la grabación. Aquí, se muestran imágenes de campo brillante y fluorescencia de la misma zona del implante de timo que pueden servir para un doble seguimiento macroscópico del crecimiento tisular y se muestran estudios de involución y continuación.La imagen de campo brillante también facilita la visualización de la vascularización del tejido implantado, permitiendo el estudio único de la dependencia de la fisiología del timo en el suministro de sangre con el tiempo. Este modelo permite la visualización de la transmigración celular desde el torrente sanguíneo en el timo implantado, el seguimiento de los contactos entre las células progenitoras GFP-positivas que entran en el implante timico con células epiteliales y estromales timicas residentes etiquetadas por RFP durante los procesos de diferenciación y selección, así como el seguimiento de las células inmunitarias egresivas del timo en los vasos sanguíneos periféricos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la exposición tisular para un injerto óptimo y también limitar el tamaño de la incisión en el ojo para permitir la escisión de fragmentos ilesos a través de la córnea mientras se reduce la fibrosis durante la curación.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como tratamientos de control localizados e incisión de otros tejidos en el ojo contralateral para responder preguntas adicionales sobre disfunciones inmunitarias relacionadas con infecciones, determinantes de involución y mecanismos de tolerancia al trasplante. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran el desarrollo de células T, incluyendo el reclutamiento de progenitores, la dinámica del ojo del timo y los pasos maduros de la egresión de células T in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Investigación

Biología

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

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La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...