Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Detta arbete fick stöd genom NIH grants R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) och R21ES025673 (AC) och bästa/2015/043 bidraget (Consellería de Educació, cultura jag esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Författarna vill tacka skickat laget vid Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien och Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien för hjälp med video filmning och redigering.

De institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Miami godkända alla experimenten enligt IACUC riktlinjer.
1. isolering och trimning av nyfödda Thymi
<ol><li>Förbereda alla reagens och instrument genom autoklavering eller andra metoder, att säkerställa sterila förhållanden.</li>
	<li>För att minimera föroreningar, utföra alla kirurgiska ingrepp under en LAF.</li>
	<li>Innan euthanizing givare möss, fylla en 60 mm steril maträtt med sterila prechil...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

På grund av vikten av T-cell mognadsprocessen för enskilda immun kompetensen4 och förmodade effekterna av föregångare cell dynamics på mogna T-celler produceras av tymus2,3, har omfattande ansträngningar investerats att utveckla alternativ till den klassiska fasta vävnad snapshot strategin.
Även om vävnad skivor och andra bladsticklingar är klart överlägsen i reproducera vävnad arkitektur än enski...

Intrathymic T-cell differentiering och T-cell subpopulation urval utgör viktiga processer för utveckling och underhåll av cell-medierad immunitet i ryggradsdjur1. Denna process innefattar en komplicerad händelseförlopp tätt organiserade inklusive rekryteringen av stamfäder från blodomloppet, cellproliferation och migration, differentiell uttryck av membranproteiner, och massiva programmerad celldöd för undergrupper urval. Resultatet är frisättningen av mogna T-celler reagerar snabbt på ett stort spektrum av främmande antigener medan du visar minimerade Svaren till self-peptider, som slut upp kolonisera de perifera lymfoida organ av enskilda2,3. Avvikande thymocyte urval av αβTCR repertoaren leder till autoimmun sjukdom eller immuna obalans4 som främst härrör från defekter under processerna för negativ eller positiv föregångare urval, respektive.
Directional migration av tymocyter över tymus är inneboende på alla stadier av T-cell mognad och det är tänkt som en serie av simultana eller sekventiella flera stimuli, inklusive chemokiner, självhäftande, och de självhäftande extracellulär matrix (ECM) protein interaktioner3,5. Studien av fasta vävnader har återges kritisk information angående mönster av uttryck för thymocyte flyttande signaler definierade thymic mikromiljö5,6, medan ex vivo -studier har avslöjat två förhärskande flyttande beteenden av tymocyter två histologiskt distinkta områden av orgeln: slow stokastiska rörelser i cortex och snabb, trånga motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. ökad flyttande priser korrelerar med thymic positiva urval13 och negativa urval är associerad med krypande beteende stödja hypotesen att kinetiken för resan genom bräss bestämmer rätt mognaden av tymocyter. Trots deras relevans fortfarande topologi thymocyte-stromal cell interaktioner och dynamiken i thymocyte motilitet över orgel mikromiljö under T-cell mognad oklara.
De flesta ex vivo studier hittills inkluderar fostrets eller reaggregate thymic orgel kulturer14,15, vävnad skivor eller intakt thymic LOB bladsticklingar där thymocyte rörelser visualiseras av två-photon laserskanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital bildteknik med högst begränsade arbetsavstånd och imaging djup av 1 mm i enlighet med vävnaden undersöks16. I motsats till den mödosamma thymic orgel-kulturer som beror på längre inkubationstider att bilda 3D-strukturer, både thymic slice tekniken och intakt thymic LOB strategi tillstånd kontrolleras införandet av särskilda grupper av pre märkt tymocyter i en miljö med infödda vävnad i arkitekturen. Men eftersom blodflödet är frånvarande i dessa modeller, de är klart begränsade för att studera rekryteringsprocessen av tymus lösa stamfäder (TSP) till tymus parenkymet eller dynamiken i thymic egression av mogna T-celler.
In vivo modeller för att studera thymic T-cell mognad fysiologi hos möss inkluderar grafterna av fragment eller hela orgel lober placeras antingen inuti njuren kapsel17 eller intradermalt18. Även om alternativen visade deras verktyg för att förhöra systemisk funktionell engraftment av vävnad, begränsar positionen för thymic ympkvistar djupt inom djuret eller omfattas av lager av ogenomskinlig vävnad deras användning i vivo undersökning av implantat av TPLSM.
Den främre kammaren i ögat ger en lättillgänglig plats för direkt övervakning av någon ympade vävnad genom insyn i hornhinnans lager. Fördel är basen av kammaren bildas av iris rik på blodkärl och autonoma nervändar, vilket möjliggör snabb revaskularisering och reinnervation av ympkvistar19,20. Dr. Caicedo har framgångsrikt använt denna anatomiska utrymme för underhåll och longitudinell studie av Langerhanska i tidigare21. Här visar vi att denna strategi inte bara utgör en giltig metod för att studera tymocyter dynamics inom infödda orgel struktur, men också unikt tillstånd för att förlänga den i vivo längsgående inspelningar till studien av stamceller rekrytering och mogna T-cell egression steg i musen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Syftet med metoden som presenteras är att visa, för första gången, transplantation av nyfödda thymi in i främre öga kammaren av syngena vuxna möss för i vivo längsgående realtidsövervakning av thymocytes´ dynamik inom en simblåsa Thymus segment. Efter transplantation tillåter laserscanning mikroskopi (LSM) genom hornhinnan i vivo noninvasiv upprepade bildbehandling på cellulär resolution nivå. Ännu viktigare, lägger metoden till föregående intravital T-cell mognad imaging modeller möjligheten för kontinuerlig progenitor cell rekrytering och mogna T-cell avstigning inspelningar på samma djur. Ytterligare fördelar med systemet är insynen i ympade området, tillåter makroskopiska snabb övervakning av implanterade vävnad, och tillgängligheten till implantatet möjliggör lokaliserade förutom systemiska behandlingar. Den största begränsningen är volymen på vävnaden som passar i det reducera utrymmet öga avdelning som krav för LOB trimning. Orgel integritet maximeras genom att dissekera bräss lober i mönster som tidigare visat sig vara funktionell för mogna T-cell produktion. Tekniken är potentiellt lämpade att förhöra en miljö av medicinskt relevanta frågor som avser bräss funktion som omfattar autoimmunitet, immunbrist och centrala tolerans; processer som förblir slentrianmässigt dåligt definierade. Fina dissektion av mekanismer som styr thymocyte migration, differentiering och urval bör leda till nya terapeutiska strategier inriktning utveckla T-celler.

Thymus från nyfödda möss var isolerade från B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas möss som beskrivs i detta protokoll (steg 1.1-1,9). I dessa transgena möss instruerar kyckling beta aktin arrangören uttrycket av den röda fluorescerande protein varianten DsRed. MST under inflytande av den cytomegalovirus (CMV) omedelbara tidiga förstärkare att underlätta spårning av implantat.
Att förhindra avstötning, syngena...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In Vivo spårning av tymocyter i främre kammaren i ögat av laserscanning mikroskopi i realtid

Syftet med protokollet är att Visa längsgående intravital realtidsspårning av tymocyter av laserscanning mikroskopi i thymic implantat i främre ögonkammaren på möss. Insyn i hornhinnan och vaskularisering av graften tillåter kontinuerligt inspelning progenitor cell rekrytering och mogna T-cell avstigning.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom immunologi området om mekanismerna för autoimmunitet, immunbrist, central tolerans, och bräss involution. Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter in vivo longitudinella inspelning av progenitor rekrytering och mogna T-cell egression inom vascularized och ympade mus bräss segment. Även om denna metod kan ge insikt i utveckling och funktion av bräss, kan också tillämpas på andra vävnader såsom bukspottskörteln holmar eller njure glomeruli.För att isolera brässet, placera musen på sterila absorberande pappershanddukar i dorsala upprätt läge i en laminär flöde huva och spraya och torka av musen buken med 70%etanol. Gör en ytlig V-formad snitt i nedre delen av buken för att exponera brösthålan och använda ett par raka 10-centimeter dissekera sax för att göra en 0,5 till en centimeter snitt i bröstet längs ventrala mittlinjen. Vik huden över varje sida av bröstet för att exponera brösthålan och göra två ytterligare djupare 0,5 till en centimeter laterala snitt genom membranet och bröstkorgen för att komma åt den överlägsna mediastinum i främre brösthålan.Brässen ska visas som två bleka lober rakt ovanför hjärtat. Placera böjda forcep-tips under brässet och dra vertikalt för att extrahera det kompletta organet, förhindrar vek-tillbaka av bröstkorgen med ett par raka tång. Sedan dränka den isolerade bräss i en steril 60-milliliter maträtt som innehåller kall steril PBS på is och använda en skalpell för att skära bindhinnemus för att separera thymic lober.Innan transplantation, tag och väga varje mottagare mus och placera det första djuret i en sida laterala recumbent position med ett öga direkt utsätts för linsen av en dissekera mikroskop. Använda Vannas sax, punktskatt en av de isolerade thymic lober upp till en millimeter i bredd efter en sicksack mönster för att säkerställa att varje segment innehåller några thymic cortex och medulla vävnad. Det är viktigt att trimma brässet precis före implantationen som stora bitar kanske inte engraft ordentligt.Därefter, med början vid basen av hornhinnan i operationsområdet, använd spetsen på en 40-millimeters 18-gauge nål för att göra ett litet snitt i externa hornhinnan lager så att spetsen på ett par dissekera sax kan införas. Använd saxen för att göra en fem till 10-millimeters flank snitt direkt runt basen av hornhinnan medan du använder flat-ended tlyktor för att stadigt hålla hornhinnan öppen för att förhindra återförslutning. Gripa tag i den skurna hornhinnans epitel med flat-ended tlyck, upprätthålla öppningen i hornhinnan medan du sätter in ett thymic segment genom öppningen.Det är viktigt att för in brässbiten snabbt genom hornhinnans öppning för att förhindra spontan återförslutning innan vävnadens introduceras. Var noga med att bevara vävnadsintegritet i detta steg. Tryck mjukt på ögonytan för att föra det införda vävnadssegmentet till ett lateralt läge med avseende på pupillen för att bevara ögats funktion.Och använd platta tlyctor för att trycka på båda sidor av hornhinneöppningen stadigt mot varandra i tre till fem sekunder för att främja självförsegling. Om transplantationen ska utföras på båda ögonen, vrid musen på den motsatta laterala sidan för en andra implantation som just visat. När operationen är klar, tillbaka musen till en tom bur förvärmd med en värmelampa med övervakning tills full recumbency.Vid lämplig experimentell tidpunkt, placera en sövd mottagarmus på en fast-steg mikroskop plattform i en sida laterala recumbent position på en värmedyna med ett öga uppåt. Och sätt in musens huvud i en stereotaxisk huvudhållare. Justera ratten för att hålla fast mushuvudet i sidoläget i sidled för att möjliggöra direkt åtkomst av mikroskopmålet till ögat som håller i brässyften och dra tillbaka ögonlocken medan du håller ögat vid kornealmarginalen med ett par pincettspetsar som täcks av ett polyetylenrör som är fäst vid en UST-2 solid universalled.Tillsätt några droppar steril saltlösning eller konstgjorda tårar mellan hornhinnan och linsen innan du placerar 5X mikroskop målet på musögat och lokalisera bräss i mikroskopfältet. Byt sedan till en vattensänkningsmål för vatten med högre upplösning med ett långt arbetsavstånd och välj förvärvsläge i mikroskopprogramvaran. Starta resonansskannerläget och välj bildläget XYZT.Slå på argonlasern och justera strömmen till 30%för fluorescensutexcitation. Välj en lämplig excitationslaserlinje och ställ in den acousto-optiska stråldelarsreglaget för lämpliga emissionsvåglängder med hjälp av reflektionsdetektering samtidigt för att upptäcka backscatter och för att avgränsa vävnadsstrukturen. Samla in emissionen vid vald våglängd och ställ in en upplösning på 512 med 512 pixlar.Klicka sedan på live för att starta bildtagningen, justera förstärkningsnivåerna vid behov. Fokusera på toppen av thymic implantatet och välj börja definiera början av Z-stacken. Fokusera sedan på det sista planet i den implanterade brässen som kan visualiseras och välj slutet för att definiera slutet på Z-stacken med hjälp av en Z-stegs storlek på fem mikrometer.Ställ in tidsintervallet för anskaffning av varje Z-stack för 1,5 till två sekunder och välj alternativet acquire-until-stopped för kontinuerlig avbildning. Klicka sedan på start för att initiera inspelningen. Här visas ljusa fält- och fluorescensbilder av samma område av brässimplantatet som kan tjäna för en dubbel makroskopisk uppföljning av vävnadstillväxt och involutions- och fortsättningsstudier.Bright-field bilden underlättar också visualisering av vascularization av den implanterade vävnaden, vilket möjliggör den unika studiet av beroendet av thymus fysiologi på blodtillförsel över tiden. Denna modell gör det möjligt att visualisering av cell transmigration från blodet torrent i den implanterade bräss, spårning av kontakterna mellan GFP-positiva progenitor celler in i thymic implantatet med RFP-märkt bosatt thymic epitelial och stromal celler under differentiering och processer urval, samt övervakningen av de egressiva immuncellerna från brässen i perifert blod fartyg. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att minimera vävnad exponering för optimal engraftment och även att begränsa snitt storlek i ögat för att tillåta oskadd fragment excision genom hornhinnan samtidigt minska fibros under läkning.Efter detta förfarande, andra metoder som lokaliserade kontroll behandlingar och snitt av andra vävnader i kontralateral ögat kan utföras så att besvara ytterligare frågor om immun dysfunktioner kopplade till infektioner, involution determinanter, och transplantation tolerans mekanismer. Efter dess utveckling, banade denna teknik vägen för forskare inom immunologi att utforska T-cells utveckling, inklusive progenitor rekrytering, tymus-eye dynamik, och mogna T-cells egression steg i vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In vivo Micro-cirkulation Mätning i skelettmuskel genom Intra-vitala Mikroskopi

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Realtid Analyser av Retinol Transport från membranreceptor av plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Realtid avbildning av växtcellytan Dynamisk med variabel vinkel epifluorescensmikroskopi

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...