Name: real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Bu eser NIH hibe R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) ve R21ES025673 (AC) ve en iyi/2015/043 grant tarafından desteklenmiştir (Consellería de Educació, cultura ben esport, Generalitat valenciana, Valencia, İspanya) (EO). Yazarlar gönderilen takım Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, İspanya ve Alberto Hernandez Centro de Investigación Principe Felipe, Valencia, İspanya için video filme ve düzenleme ile onların yardım etmek, teşekkür.

Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi IACUC esaslarına göre tüm deneylerin onayladı.
1. yalıtım ve yeni doğan Thymi Düzeltme
<ol><li>Tüm reaktifler ve araçlar tarafından ısıyla ya da diğer yöntemlerle Steril koşullar sağlanması, hazır olun.</li>
	<li>Contaminations en aza indirmek için laminar akış başlık altında tüm cerrahi işlemler gerçekleştirmek.</li>
	<li>Donör fareler ötenazi önce steril prechilled 1 fosfat tamponlu tuz...

<ol>
	<li>Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+lymphoid+tissues.">Evolution of lymphoid tissues.</a> Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li><li>Dzhagalov, I., Phee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+find+your+way+through+the+thymus:+a+practical+guide+for+aspiring+T+cells.">How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).</li><li>James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+egress+from+the+thymus:+Should+I+stay+or+should+I+go?.">T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2018).</li><li>Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+governing+thymocyte+migration:+combined+role+of+chemokines+and+extracellular+matrix.">Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix.</a> Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).</li><li>Petrie, H. T., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoned+out:+functional+mapping+of+stromal+signaling+microenvironments+in+the+thymus.">Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus.</a> Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).</li><li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy.">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li><li>Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+microscopy.">In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li><li>Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell+networks+regulate+thymocyte+migration+and+dendritic+cell+behavior+in+the+thymus.">Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus.</a> Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).</li><li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+migration+of+positively+selected+thymocytes+visualized+in+real+time.">Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time.</a> PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current Protocols in Immunology. , (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).</li><li>Dunn, K. W., Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+in+living+animals+using+multiphoton+microscopy.">Functional studies in living animals using multiphoton microscopy.</a> ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).</li><li>Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+thymus+using+2-photon+Microscopy.">Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).</li><li>Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intravital+imaging+of+thymocyte+dynamics+in+medaka.">Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-graft+circulation+and+vascular+morphology+in+pancreatic+tissue+transplants+in+rats.">Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats.</a> Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).</li><li>Adeghate, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+tissue+grafts+are+reinnervated+by+neuro-peptidergic+and+cholinergic+nerves+within+five+days+of+transplantation.">Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation.</a> Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transplantation+of+different+aged+murine+thymic+grafts.">Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).</li><li>Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+intrathymic+injection+technique+for+mice.">A simplified intrathymic injection technique for mice.</a> Biotechnic &amp; Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+Injection.">Intrathymic Injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>Abdulreda, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses.">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).</li></ol>

T-hücre olgunlaşma sürecinin bireysel bağışıklık yetkinlik4 için önemi ve öncü hücre dinamikleri üzerinde timus2,3tarafından üretilen olgun T-hücreleri tahmin ediliyor etkisi nedeniyle yoğun çabaları yatırım seçimli-e doğru klasik sabit doku anlık görüntü yaklaşım geliştirmek için.
Dokusu dilimlerin ve diğer explants doku mimari monolayers veya toplama timik organ kültürler<sup...

İntrathymic T-hücre farklılaşma ve T-hücre subpopulation seçimini temel süreçleri geliştirme ve bakım hücre-aracılı bağışıklık omurgalıların1için oluşturur. Bu işlem sıkı bir şekilde organize olaylar ataları kan dolaşımına, hücre çoğalması ve geçiş alımı, zar proteinleri ve büyük programlanmış hücre ölümü alt kümeleri için fark ifade dahil olmak üzere karmaşık bir dizi içerir seçimi. Sonuç olgun T-hücreleri yabancı antijenleri geniş bir spektrum için reaktif öz-peptidler, simge durumuna küçültülmüş yanıt görüntülerken sürümüdür periferik lenfoid organlar bireysel2,3kolonileşmesi hangi sonuna kadar. Anormal thymocyte seçim αβTCR repertuar otoimmün hastalık veya esas olarak kusurları olumlu ya da olumsuz habercisi seçimi, işlemler sırasında sırasıyla türetmek bağışıklık dengesizlik4 yol açar.
Timositleri timus genelinde yönlü geçiş T-hücre olgunlaşma tüm aşamalarında içsel ve birden çok uyaranlara kemokinler, yapışkan-dahil olmak üzere, bir dizi eşzamanlı veya sıralı olarak öngörülen ve hücre dışı matriks (ECM) de-yapışkan protein etkileşimleri3,5. Ex vivo çalışmalar ortaya koymuştur iken iki çalışma sabit dokuların tanımlanmış timik microenvironments5,6, thymocyte göçmen yardımlar için ifade kalıpları ile ilgili kritik bilgi yaygın hale timositleri organ iki histolojik olarak ayrı alanda göç davranışlarını: yavaş Stokastik hareketleri korteks ve medulla7,8,9,10 hızlı, sınırlı hareketliliği , 11 , 12 , 13. artan göç oranları timik pozitif seçim13 ile ilişkilendirmek ve negatif seçim timus yolculuk kinetik uygun belirler hipotezi destekleyen gezinme davranışını ile ilişkili timositleri olgunlaşma. Kendi alaka rağmen thymocyte-stromal hücre etkileşimleri topoloji ve thymocyte hareketliliği arasında organ microenvironments T hücre olgunlaşma sırasında dinamikleri kötü tanımlanmış kalır.
Bugüne kadar gerçekleştirilen en ex vivo çalışmalar fetal eklemek veya timik organ kültürler14,15, dokusu dilimlerin veya nerede thymocyte hareketleri iki fotonlu lazer tarama tarafından görüntülenmiştir sağlam timik lob explants reaggregate mikroskobu (TPLSM)8, intravital bir görüntüleme tekniği mesafe çalışma ve doku uygun olarak 1 mm derinliği görüntüleme sınırlandırılmış maksimum16inceledi. Genişletilmiş kuluçka kez form 3D-yapılarına bağlıdır zahmetli timik organ kültürler aksine, timik dilim tekniği hem de belirli alt kümelerine sağlam timik lob yaklaşım kontrol izni getirilmesi önceden etiketli timositleri yerel doku Mimarlık ortamı içine. Ancak, kan akışı olduğundan yok bu modellerinde, onlar ataları (TSPs) timus parankimi veya olgun T-hücrelerinin timik egression dinamikleri yerleşme timus işe alım sürecinin eğitimi için açıkça sınırlıdır.
Vivo modelleri timik T-hücre olgunlaşma Fizyoloji farelerde incelenmesi için Greftler parçaları veya ya böbrek kapsül17 veya intradermally18içine yerleştirilen tüm organ loblar içerir. Bu seçenekler dokusunun sistemik fonksiyonel engraftment sorguya çekmek için onların yardımcı olsa da, timik Greftler derin içinde hayvan veya opak doku katmanları tarafından kapalı konumunu kullanımları vivo içinde implantlar tarafından incelenmesi için kısıtlar TPLSM.
Gözün ön odası kornea katman saydamlığını sayesinde aşılı herhangi bir doku doğrudan izlenmesi için kolayca erişilebilir bir alan sağlar. Avantajı, Iris tarafından kurulan odası Bankası kan damarları ve otonomik sinir uçları, olanaklı kılmak hızlı revaskülarizasyon ve greft19,20reinnervation zengindir. Dr Caicedo başarıyla anatomik bu alanı bakım ve son21pankreas adacıkları boyuna incelenmesi için kullandı. İşte, bu strateji sadece yerel organ yapısı içinde timositleri dynamics eğitim için geçerli bir yaklaşımı kabul ettiğiniz anlamına gelir, ama aynı zamanda benzersiz olarak vivo içinde yaratıcı işe alım çalışmanın boyuna kayıtları genişletmek için izin verir göstermektedir ve Olgun T-hücre egression adımda fare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isofluorane vaporizer w/isofluorane</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>VetFlo-1215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope w/light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip fine dissection forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>503243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm 18G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>201C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad and heat lamp</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>Infrarred</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83,813,360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile dish</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x PBS pH(7,4)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>LD004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs for pain management</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3035-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution or Viscotears</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ FLIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head-holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4_S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>BIO IIA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time in vivo tracking of thymocytes in the anterior chamber of the eye by laser scanning microscopy

Gösterilmek yöntemin amacı, ilk kez, yeni doğan thymi in vivo boyuna gerçek zamanlı thymocytes´ dinamiği içinde bir bozukluklarına izleme için isogenic yetişkin mice ön göz odasına nakli göstermektir timus kesimi. Ekimi mikroskobu (LSM) kornea ile tarama Lazer vivo içinde noninvaziv tekrarlanan düşsel vasıl hücresel çözümleme düzeyi sağlar. Önemlisi, yaklaşım modelleri görüntüleme önceki intravital T hücre olgunlaşma için aynı hayvan sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kayıtları için olasılığı ekler. Sistem Şeffaflık aşılı çevrenin makroskopik hızlı implante dokusunun izleme izin ek avantajları ve erişilebilirlik için izin implant için ek olarak sistemik tedaviler yerelleştirilmiş. Doku hacmi olmak ana sınırlama lob kırpma için talepleri göz odasının azaltılmış uzayda sığar. Organ bütünlük timus loblar olgun T-hücre üretimi için işlevsel olması için daha önce gösterilen şekillerindeki dissekan tarafından kaplamış. Otoimmünite, immün yetmezlik ve merkezi dayanıklılık içeren tıbben timus fonksiyonu ile ilgili sorular bir ortamın sorguya çekmek için potansiyel olarak uygun bir tekniktir; mechanistically kötü tanımlanmış kalır süreçleri. Thymocyte geçiş, farklılaşma ve seçim rehberlik mekanizmaları ince diseksiyon gelişmekte olan T hücreleri hedefleme roman tedavi stratejileri için götürür.

Yeni doğan farelere timus B6 izole edildi. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas bu Protokolü (adım 1.1-1.9) açıklandığı gibi fareler. Bu transgenik farelerde tavuk beta aktin organizatörü kırmızı floresan protein değişken DsRed ifade yönlendirir. MST implantlar izlenmesini kolaylaştırmak sitomegalovirüs (CMV) hemen erken artırıcı etkisi altında.
Doku reddi, isogenic bireylerin genotip ile önlemek için...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy at JoVE.com

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Bu yöntem, immünoloji alanında otoimmünite, immün yetmezlik, merkezi tolerans ve timus involution mekanizmaları hakkında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, vaskülarize ve aşılı fare timus segmentleri içinde ata alımı nın ve olgun T-hücre çıkışLarının in vivo longitudinal kaydına izin vermedir. Bu yöntem timus gelişimi ve fonksiyonu içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda pankreas adacıkları veya böbrek glomeruli gibi diğer dokulara uygulanabilir.Timus izole etmek için, bir laminar akış kaputve sprey ve% 70 etanol ile fare karın silin dorsal dik pozisyonda steril emici kağıt havlu üzerine fare yerleştirin. Torasik boşluğu ortaya çıkarmak için alt karın yüzeysel V şeklinde bir kesi yapmak ve ventral orta hat boyunca göğüs 0,5 ila bir santimetrelik kesi yapmak için düz 10 santimetrelik diseksiyon makası bir çift kullanın. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs her iki tarafında deri katlayın ve ön torasik kavitede üstün mediasten erişmek için diyafram ve göğüs kafesi ile iki ek daha derin 0.5 ila bir santimetre lateral kesiler yapmak.Timus kalbin hemen üzerinde iki soluk lob lar olarak görünmelidir. Timus altında kavisli forcep uçları yerleştirin ve düz forseps bir çift ile göğüs kafesi katlanabilir önlenmesi, tam organ ayıklamak için dikey olarak çekin. Sonra buz üzerinde soğuk steril PBS içeren steril 60 mililitrelik çanak izole timus batırın ve timik loblar ayırmak için bağ istmus kesmek için bir neşter kullanın.Transplantasyondan önce, her alıcı fareyi etiketleyin ve tarayın ve ilk hayvanı bir gözü doğrudan bir diseksiyon mikroskobunun merceği ne rezeke siyle yan yanal recumbent pozisyonuna yerleştirin. Vannas makas kullanarak, her segmentte bazı timik korteks ve medulla doku içerdiğinden emin olmak için bir zikzak desen aşağıdaki genişliği bir milimetreye kadar izole timik loblar biri excise. Büyük parçalar düzgün bir şekilde engraft olmayabilir gibi implantasyon hemen önce timus kırpmak için önemlidir.Daha sonra, cerrahi alanın kornea tabanından başlayarak, dış kornea tabakaları içine küçük bir kesi yapmak için 40 milimetrelik 18-gauge iğne ucu kullanın böylece bir çift mezhebin ucu tanıtılabilen bir çift makas. Tekrar sızdırmazlığı önlemek için korneayı sıkıca açık tutmak için düz uçlu çerkezlikler kullanırken, korneanın tabanının etrafında doğrudan 5 ila 10 milimetrelik bir yan kesi yapmak için makas kullanın. Kesme kornea epitelini düz uçlu enfazla tutarak, açılıştan bir timik segment yerleştirirken korneadaki açıklığı koruyun.Doku kullanılmadan önce spontan tekrarsıza neden olmak için timus parçasını kornea açıklığına hızlı bir şekilde yerleştirmek önemlidir. Bu adımda doku bütünlüğünü korumak için dikkatli olun. Göz işlevini korumak için göz bebeği ile ilgili olarak yanal bir konuma tanıtılan doku segmentini slayt için göz yüzeyine hafifçe basın.Ve kendi kendini mühürleme teşvik etmek için üç ila beş saniye boyunca kornea açma nın her iki tarafını birbirine sıkıca bastırmak için düz forseps kullanın. Eğer nakil her iki gözde yapılacaksa, fareyi sadece gösterildiği gibi ikinci bir implantasyon için karşı lateral tarafa çevirin. Ameliyat tamamlandığında, fareyi tam recumbency kadar izleme ile bir ısı lambası ile önceden ısıtılmış boş bir kafese fare dönün.Uygun deneysel zaman noktasında, bir gözü yukarı bakacak şekilde bir ısı yastığı üzerinde yan yanal recumbent pozisyonda sabit aşamalı bir mikroskop platformu üzerinde anestezili alıcı fare yerleştirin. Ve farenin başını stereotaksik bir kafa tutucuya takın. Timus greftini tutan göze mikroskop hedefinin doğrudan erişmesine izin vermek ve ust-2 katı evrensel eklemine bağlı polietilen tüple kaplanmış bir çift cızırtı lı uçlarla gözü kornea kenarında tutarken göz kapaklarını geri çekmek için fare kafasını yan pozisyonda dizginlemek için topuzunuzu ayarlayın.Fare gözüne 5X mikroskop hedefini yerleştirmeden önce kornea ve lens arasına birkaç damla steril salin veya yapay gözyaşı ekleyin ve timusu mikroskop alanında bulun. Daha sonra uzun bir çalışma mesafesi ile daha yüksek çözünürlüklü su daldırma daldırma hedefine geçin ve mikroskop yazılımında edinme modunu seçin. Rezonans tarayıcı modunu başlatın ve XYZT görüntüleme modunu seçin.Argon lazerini açın ve floresan uyarma için gücü %30'a ayarlayın. Uygun bir uyarma lazer hattı seçin ve arka saçılımı algılamak ve doku yapısını belirlemek için aynı anda yansıma algılama kullanarak uygun emisyon dalga boyları için acousto-optik ışın ayırıcı kontrolü ayarlayın. Samisyonu seçili dalga boyunda toplayın ve 512'ye 512 piksel çözünürlüğü ayarlayın.Ardından, kazanç düzeylerini gerektiği gibi ayarlayarak görüntülemeyi başlatmak için canlı'yı tıklatın. Timik implantın üstüne odaklanın ve Z destesinin başlangıcını tanımlamaya başlayın' ı seçin. Daha sonra, beş mikrometrelik Z adım boyutu kullanarak Z destesinin ucunu tanımlamak için görüntülenebilen ve ucunu seçebilen implante timustaki son düzleme odaklanın.Her Z yığınının edinimi için zaman aralığını 1,5 ila iki saniye olarak ayarlayın ve sürekli görüntüleme için satın alma-durdurulan seçeneğini seçin. Ardından kaydı başlatmak için başlat'ı tıklatın. Burada, timus implantının aynı bölgesinin parlak alan ve floresan görüntüleri doku büyümesi ve involution ve devamı çalışmalarının çift makroskopik takibine hizmet edebilir.Parlak alan görüntüsü aynı zamanda implante edilen dokunun vaskülarizasyonunu görselleştirmeyi de kolaylaştırarak timus fizyolojisinin zaman içinde kan akımına olan bağımlılığının benzersiz bir şekilde araştırılmasını sağlar. Bu model, kan torrentinden implante timusa hücre geçişinin görüntülenmesi, farklılaşma ve seçim süreçleri sırasında RFP etiketli yerleşik timik epitel ve stromal hücrelerle timik implanta giren GFP-pozitif progenitör hücreleri arasındaki temasların izlenmesinin yanı sıra, timustan gelen saldırgan bağışıklık hücrelerinin periferik kan damarlarına izlenmesini sağlar. Bu prosedürü denerken, optimal engraftment için doku maruziyetini en aza indirmek ve aynı zamanda iyileşme sırasında fibrozis azaltırken kornea yoluyla zarar görmemiş parça eksizyonu izin vermek için gözde kesi boyutunu sınırlamak için hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, enfeksiyonlara bağlı immün fonksiyon bozuklukları, involution determinantları ve transplantasyon tolerans mekanizmaları ile ilgili ek soruları cevaplamak için lokalize kontrol tedavileri ve diğer dokuların kontralateral göze kesilmesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra immünoloji alanındaki araştırmacıların ata işe alım, timus-göz dinamiği ve erişkin olgun T-hücre çıkış adımları da dahil olmak üzere T-hücre gelişimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...