Name: tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" منحا إلى أ. س. (ديب #1427772، 1745411، 1750037).

1-ضع علامة جمع وتعقيم سطحي
<ol><li>جمع تعلق القراد عن طريق سحب قطعة من قماش أبيض2 م 1 على موئل المرتبطة بالتجزئة، إزالة القراد إلى الأنواع المضيفة، أو تربية القراد في مختبر15،16. استخدام الملقط غرامة للتلاعب بالقراد وتخزينها في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>مكان القرا...

الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S أصبح نهجاً موحدا لتحديد العوامل الجرثومية ومكنت الدراسة كيف ميكروبيوميس ناقلات الأمراض تؤثر على انتقال العوامل الممرضة. تفاصيل البروتوكول المبينة هنا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في الجمعية المجتمع الميكروبي في باسيفيكوس أولاً، نوع ناقل لمرض لا...

أن عودة ظهور وانتشار الأمراض المحمولة بالنواقل في العقود الأخيرة تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحياة البرية العالمية. ولا توجد لقاحات فعالة لغالبية هذه الأمراض، وتعيق جهود مكافحة الطبيعة البيولوجية المعقدة ناقلات والتفاعلات ناقل المضيف. فهم دور التفاعلات الميكروبية داخل ناقل في انتقال العوامل الممرضة يمكن أن تسمح لوضع استراتيجيات جديدة والتحايل على هذه التحديات. على وجه الخصوص، التفاعلات بين المرتبطة بمكافحة ناقلات الجراثيم كومينسالس، وسيمبيونتس، ومسببات الأمراض، يشار إلى ميكروبيومي، قد آثار هامة على انتقال العوامل الممرضة. الآن أدلة دامغة تؤيد هذا الزعم، مع أمثلة مما يدل على ارتباط بين ناقلات ميكروبيومي والكفاءة لأمراض من قبيل الملاريا وفيروس زكى، ومرض لايم1،،من23. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى استراتيجيات للسيطرة على الأمراض يتطلب فهم أكثر تفصيلاً لهيكل ووظيفة، ومنشأ متجه ميكروبيوميس. تحديد وتوصيف المجتمع ناقلات الجراثيم تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية تشكل مسار هامة إلى الأمام في هذا المجال.
وضع إجراء لتحديد السكان الميكروبية ناقل الممرض يرد هنا باستخدام الغربية أرجل الأسود القراد، باسيفيكوس Ixodes، أنواع ناقلات الأمراض من مسببات المرض مرض لايم البورليه burgdorferi. بينما القراد تأوي أكثر من أنواع مسببات الأمراض البشرية من أي مفصليات الأرجل الأخرى، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول إيكولوجيا الأحياء والمجتمع للقراد ميكروبيوميس4. فمن الواضح أن القراد إيواء مجموعة متنوعة من الفيروسات والبكتيريا والفطريات وبرزويات التي تشمل كومينسالس، اندوسيمبيونتس، وسكان الميكروبية عابر5،4. العمل السابقة أظهرت اختلافات قوية في ميكروبيوميس إيكسوديس المرتبطة بالجغرافيا، والأنواع، والجنس ومرحلة الحياة ووجبة الدم مصدر6،،من78. ولكن الآليات الكامنة وراء هذا الاختلاف لا تزال مجهولة وتبرر أكثر تفصيلاً بالتحقيقات المتعلقة بمنشأ والجمعية هذه المجتمعات الميكروبية. القراد يمكن أن تكتسب الميكروبات عن طريق الانتقال الرأسي، الاتصال بالمضيفين، وامتصاص من البيئة من خلال spiracles والفم، والشرج المسام9. فهم العوامل التي تشكل الأولية تشكيل وتطوير ميكروبيومي القراد، على وجه التحديد المساهمة النسبية لانتقال العدوى الرأسية والبيئية، مهم لفهم الأنماط الطبيعية والتغيرات في التجزئة ميكروبيومي التنوع وكيفية تفاعل هذه المجتمعات أثناء انتقال مسببات المرض، مع التطبيقات الممكنة لمكافحة المرض أو ناقل.
التقنيات الجزيئية القوية، مثل الجيل التالي التسلسل، الآن موجودة لتحديد المجتمعات الميكروبية ويمكن استخدامها لتوصيف ميكروبيوميس ناقل تحت مختلف الظروف البيئية أو التجريبية. قبل ظهور هذه النهج التسلسل الفائق، تحديد الميكروبات تعتمد غالباً على الفحص المجهري والثقافة. أن الفحص المجهري تقنية سريعة وسهلة، فالطرق المورفولوجية للتعرف على الميكروبات طبيعتها الذاتية والخشنة ومحدودة بحساسية منخفضة والكشف عن10. الأساليب المستندة إلى الثقافة وتستخدم على نطاق واسع لتحديد العوامل الجرثومية ويمكن استخدامها لتحديد حساسية الجراثيم للمخدرات العلاجات11. ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا يعاني من حساسية منخفضة، حيث يقدر أن أقل من 2% ميكروبات البيئية يمكن أن تكون مثقف في مختبر لإعداد12. كما استخدمت النهج المصبوغة النسيجي كشف وتعريب الميكروبات محددة داخل الناقلة، وتمكين تحقيقات توزيعات الأنواع المختلفة داخل القراد ودراسة فرضيات حول التفاعلات الميكروبية. المعرفة المسبقة بهوية الميكروبية غير مطلوبة من أجل تحديد البقع الملائمة، مما يجعل هذا النهج غير ملائمة لتوصيف الميكروبية وتحديد الهوية. وعلاوة على ذلك، تلطيخ نسيجية عملية الوقت كثيفة جداً وشاقة وغير مقياس جيد للعينات ذات الأحجام الكبيرة. النهج الجزيئية التقليدية مثل سانغر التسلسل وبالمثل محدودة في الحساسية والكشف عن مختلف المجتمعات الميكروبية.
تسلسل الجيل التالي يسمح للتعرف السريع على الميكروبات من عدد كبير من العينات. تعزيز وجود الجينات علامة قياسية ومرجعية قواعد بيانات أخرى تمكن قرار التقسيم، غالباً على مستوى جنس أو الأنواع. وحدة فرعية صغيرة الريباسي الكشف كثيرا ما تستخدم لتحقيق هذا الهدف، مع الرنا الريباسي 16S ويجري الأكثر شيوعاً نظراً لوجود المناطق المصانة ومتغير داخل الجينات، السماح بإنشاء أجهزة الإشعال العالمي مع أمبليكونس فريدة من نوعها لكل البكتيريا الأنواع13،14. يتضمن هذا التقرير تفاصيل إجراء لتحديد الأصناف في ميكروبيومي التجزئة من خلال تسلسل الجيل الرنا الريباسي 16S. على وجه الخصوص، يؤكد هذا البروتوكول على الخطوات المتبعة في إعداد العينات للتسلسل. المعمم المزيد من التفاصيل بشأن التسلسل والمعلوماتية الحيوية يتم توفير الخطوات، كما أن هناك مجموعة متنوعة من منصات يسلسل وتحليل البرامج المتاحة حاليا، كل مع الوثائق الحالية واسعة النطاق. ويتجلى عموما جدوى هذا النهج الجيل التالي تسلسل تطبيقه تحقيقا للجمعية المجتمع الميكروبي داخل ناقل مرض رئيسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q3326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Agen Court</td>
			<td>A63880&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Magnetic Rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Nextera Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T7724</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing

في العقود الأخيرة، ظهرت من جديد الأمراض المحمولة بالنواقل والتوسع في معدلات، تسبب قدرا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم المفزعة. لا توجد لقاحات فعالة ومتاحة على نطاق واسع لغالبية هذه الأمراض، مما يستلزم وضع استراتيجيات التخفيف من آثار المرض الرواية. وتحقيقا لهذه الغاية، يشمل واعدة لمكافحة الأمراض استهداف ميكروبيومي ناقل، مجتمع الميكروبات التي تسكن في ناقلات. ميكروبيومي ناقلات يلعب دوراً محوريا في ديناميات الكائنات الممرضة، والتلاعب ميكروبيومي أدت إلى انتقال ناقلات انخفاض وفرة أو الممرض لحفنة من الأمراض المحمولة بالنواقل. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى تطبيقات التحكم المرض يتطلب فهم شامل لمكافحة ناقلات الإيكولوجيا الميكروبية، محدودة تاريخيا بتكنولوجيا غير كافية في هذا المجال. قد مكن ظهور نهج الجيل التالي تسلسل تسلسل المتوازية العالية والسريعة للمجتمعات الميكروبية المختلفة. استهداف الجين الرنا الريباسي 16S المحافظة جداً سهلت الأوصاف للميكروبات موجودة داخل ناقلات تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية. هذا الأسلوب ينطوي على تضخيم الجينات الرنا الريباسي 16S، المتوازية نموذج عن طريق PCR، تحميل عينات على خلية تدفق للتسلسل، ونهج المعلوماتية الحيوية لمطابقة تسلسل البيانات مع معلومات النشوء والتطور. عادة ما يمكن الأنواع أو تحديد مستوى جنس لعدد كبير من replicates من خلال هذا النهج، وبالتالي الالتفاف حول التحديات للكشف عن انخفاض والقرار الناتج من استزراع التقليدية، والفحص المجهري، أو تلطيخ نسيجية تقنيات. ولذلك، هذا الأسلوب مناسبة تماما لوصف ناقلات الجراثيم تحت ظروف متنوعة ولكن حاليا لا يمكن تقديم معلومات عن وظيفة الميكروبية، موقع داخل ناقل، أو استجابة للعلاج بالمضادات الحيوية. عموما، تسلسل الجيل القادم 16S تقنية قوية لفهم أفضل للهوية ودور ناقلات الجراثيم في ديناميات المرض.

ما مجموعة 42 القراد من البيض منفصلة ثلاثة براثن والتعرض البيئي فترتين، 0 و 2 أسابيع في التربة، وجهزت للتسلسل ميكروبيومي. كل مجموعة العلاج، تعتبر مرة واحدة مخلب والتعرض، الواردة في 6-8 تكرار عينات القراد. تم تحميلها على التسلسل الجيل المقبل هذه المقتطفات القراد المجهزة وأسف?...

Watch this Scientific Journal Video about Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing at JoVE.com

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

نقدم هنا بروتوكول الجيل التالي تسلسل لتسلسل الرنا الريباسي 16S التي تمكن من تحديد وتوصيف المجتمعات الميكروبية داخل الناقلة. هذا الأسلوب ينطوي على استخراج الحمض النووي والتضخيم والمتوازية من عينات عن طريق PCR، تسلسل تدفق الخلايا، والمعلوماتية الحيوية لمطابقة البيانات تسلسل المعلومات النشوء والتطور.

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

This method can help answer key questions in the field of vector-borne disease ecology such as, what role does the vector microbiome play in pathogen dynamics, and how do vector microbiomes form and vary? The main advantages of this technique are that it allows for high replication, and high resolution and identification, allowing the user to accurately characterize vector microbiome under varying ecological and environmental conditions. Visual demonstration of this method is important, as the microbiome sequencing setup steps are difficult to learn, and there are many different products available, and techniques, but few available resources for learning these steps.Begin this procedure with tick collection, as described in the text protocol. To remove surface contaminants from the ticks, add 500 microliters of hydrogen peroxide, and vortex for 15 seconds. Repeat this wash with 70%ethanol, and then double-distilled water.Place the ticks into a new PCR tube, and allow them to air dry. In this tube, mechanically disrupt tick tissues by crushing the ticks with a mortal and pestle. Purify DNA from individual ticks, following the instructions provided in a commercially available DNA extraction kit.Elute to a final volume of 100 microliters. Creating a negative control at the extraction step is critical for later differentiating suspected contaminants from true vector microbes. Using sterile technique during the extraction step and later PCR steps is also necessary to minimize the impact of contamination common in 16S sequencing.Set up the amplicon PCR in a 27.5 microliter reaction containing five microliters of each primer at one micromolar and 12.5 microliters of commercially available PCR mix. Also include five microliters of DNA extracted from individual ticks at a five nanograms per microliter concentration. Move the tubes to a thermocycler and run the program listed in the text protocol.Once the PCR is done, visualize the PCR product by loading four to six microliters per sample on a 1.5%agarose gel. Look for a band at 460 base pairs to confirm amplification. Using a new PCR tube for each sample, combine the PCR product with double-distilled water to obtain a total of 60 microliters.For samples with low DNA concentrations, perform amplicon PCR in triplicate to reduce amplification bias and pool the samples to concentrate. Bring paramagnetic beads to room temperature and vortex them well before use. Add 48 microliters of paramagnetic beads to 60 microliters of the sample and incubate for five minutes.Place the tubes on a magnetic rack for five minutes until the solution becomes clear. Then, remove the supernatant. With tubes on the magnetic rack, add 500 microliters of freshly prepared 80%ethanol.Immediately after adding ethanol to all tubes, pipette out the liquid, do not remove the beads. Repeat the ethanol addition and removal one more time. Air dry the samples to remove excess ethanol by leaving the tubes open on the magnetic rack for five minutes or until small cracks are visible in the beads.Now, add 20 microliters of TE buffer and incubate the samples off the magnet at room temperature. After five to 10 minutes place the tubes back on the magnet. Once the beads and liquid are separated, transfer the supernatants to a fresh tube to obtain the cleaned PCR product.Assign unique primer combinations to each sample, by selecting either forward or reverse primers or both from a commercially available library index kit. To attach the dual primers or indices to the samples, prepare a PCR reaction containing 2.5 microliters of each primer, 12.5 microliters of commercially available PCR Master Mix, five microliters of double-distilled water, and 2.5 microliters of cleaned amplicon product. Move the tubes to a thermocycler programmed as detailed in the text protocol.Once the PCR is done, visualize the PCR product by loading four to six microliters per sample on a 1.5%agarose gel. Look for a band at 550 base pairs to confirm amplification before performing the clean-up procedure as before. To perform accurate quantification of each purified barcoded product run qPCR on each sample and standard in triplicate and run each sample at three or more dilution levels.Prepare 10 microliter qPCR reactions containing six microliters of qPCR Master Mix, two microliters of double-distilled water, and two microliters of the sample or standard. Move the qPCR plate to a real-time PCR instrument programmed as described in the text protocol and perform the run. Following quantification, create the combined library by adding equal volumes of all individual libraries into a single tube.After diluting and denaturing the combined library and the sequencing control, load the combined mixture onto the sequencing flow cell. Thoroughly clean the flow cell prior to loading for optimum optics. Then, load the flow cell onto the sequencer and perform amplicon sequence analysis.Rarefaction curves for sequence count normalization are shown here. These curves indicate that rarefying to 2000 sequences per sample should be sufficient to capture the full diversity of observed operational taxonomic units. After rarefying and quality filtering the sequence reads, alpha and beta diversity output is performed.Shown here is an automatically generated principle coordinates analysis plot depicting how tick microbiome composition differs based on treatment. Further, visualization of the microbes present within each sample, shown here at they phylum level, are automatically created for all samples. While attempting this procedure, it's important to remember to maintain sterile technique to minimize the effect of microbial contamination which can critically impact sequence data interpretation.Following this procedure, other methods like histological staining can be performed to answer additional questions such as, where are the observed microbes located within the vector? After its development, this method paved the way for researchers in the field of molecular ecology to explore the role of microbial interactions within the vector and investigate how this may effect pathogen transmission.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

الكشف عن البكتيريا المقيمة في الانسجه في المثانة الخزعات من قبل rRNA الفلورية 16S في الموقع التهجين

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...