Name: tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concede a A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

1. assinale a coleção e a esterilização de superfície
<ol><li>Coletar carrapatos arrastando um pano2 branca de 1 m sobre um habitat carrapato associada, remoção de carrapatos anexado para espécies de hospedeiros, ou criação de carrapatos, no laboratório15,16. Use pinça fina para manipular carrapatos e armazená-los a-80 ° C.</li>
	<li>Coloque carrapatos em tubos de PCR individuais e remover contaminantes superficiais vortexing por 15 s s...

Próxima geração sequenciamento de 16S rRNA tem tornar-se uma abordagem padrão para identificação microbiana e permitiu o estudo de como vetor microbiomes afetar a transmissão do patógeno. O protocolo descrito aqui detalha o uso desse método para investigar o conjunto da comunidade microbiana em I. pacificus, uma espécie de vetor para a doença de Lyme; no entanto, pode facilmente ser aplicado para estudar outras espécies de carrapato ou espécies de artrópodes vetores.
Com...

O ressurgimento e a propagação de doenças transmitidas por vetores nas últimas décadas representam uma séria ameaça para a saúde global de humanos e animais selvagens. Vacinas eficazes estão faltando para a maioria dessas doenças, e os esforços de controle são prejudicados pela natureza biológica complexa de vetores e interações vetor-hospedeiro. Compreender o papel das interações microbianas dentro de um vetor na transmissão do patógeno pode permitir o desenvolvimento de novas estratégias que contornar estes desafios. Em particular, as interações entre os comensais microbianas associada a vector, simbiontes e patógenos, referidos como o microbiome, podem ter consequências importantes para a transmissão de agentes patogénicos. Evidência esmagadora agora oferece suporte a essa afirmação, com exemplos que demonstram uma ligação entre o vetor microbiome e competência para doenças como malária, vírus Zika e doença de Lyme1,2,3. No entanto, traduzir esses resultados em estratégias de controle de doenças requer uma compreensão mais detalhada da estrutura, função e origem do vetor microbiomes. Identificação e caracterização da comunidade microbiana vetor sob diferentes condições ecológicas e experimentais constituem um caminho importante para a frente neste campo.
Um procedimento para identificar os moradores microbianos de um vetor do patógeno é fornecido aqui, utilizando o Western nigripes carrapato, Ixodes pacificus, uma espécie de vetor do patógeno doença de Lyme Borrelia burgdorferi. Enquanto carrapatos abrigam mais tipos de patógenos humanos do que qualquer outros artrópodes, relativamente pouco é conhecido sobre a ecologia biologia e comunidade de carrapato microbiomes4. É evidente que os carrapatos abrigam um diversificado leque de vírus, bactérias, fungos e protozoários, que incluem comensais e endossimbiontes residentes microbiana transitória5,4. Trabalho prévio demonstrou fortes variações em Ixodes microbiomes associado com geografia, espécie, sexo, fase de vida e refeição de sangue fonte6,7,8. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta variação permanecem desconhecidos e garantem que mais detalhadas investigações sobre a origem e o conjunto destas comunidades microbianas. Carrapatos podem adquirir micróbios através de transmissão vertical, contato com hosts e captação do ambiente através de espiráculos, boca e anal poro9. Compreender os fatores moldar a formação inicial e desenvolvimento de microbiome o carrapato, especificamente a contribuição relativa da transmissão vertical e ambiental, é importante para compreender os padrões naturais e variações na escala Microbiome diversidade e como essas comunidades interagem durante a transmissão do patógeno, com possíveis aplicações para controle de doença ou vetor.
Poderosas técnicas moleculares, tais como sequenciamento de próxima geração, agora existem para identificar comunidades microbianas e podem ser empregadas para caracterizar o vector microbiomes sob diversas condições ambientais ou experimentais. Antes do advento dessas abordagens de sequenciamento de alta produtividade, a identificação de micróbios baseou-se predominantemente na microscopia e cultura. Enquanto microscopia é uma técnica rápida e fácil, métodos morfológicos para a identificação de micróbios são inerentemente subjetivos e grosseiros e limitada pela baixa sensibilidade e deteção10. Métodos baseados em cultura são amplamente utilizados para identificação microbiana e podem ser usados para determinar a susceptibilidade de micróbios para tratamentos de drogas11. No entanto, esse método também sofre de baixa sensibilidade, como estima-se que menos de 2% dos micróbios ambientais podem ser cultivadas em um laboratório de configuração12. Abordagens de coloração histológicas também foi empregadas para detectar e localizar os micróbios específicos dentro de vetores, permitir investigações de várias distribuições de táxons dentro o carrapato e estudar hipóteses sobre as interações microbianas. No entanto, o conhecimento prévio da identidade microbiana é necessário para selecionando as manchas adequadas, fazendo com que esta abordagem inadequados para a identificação e caracterização microbiana. Além disso, a coloração histológica é um processo altamente demorada e trabalhoso e não se adapta bem para tamanhos de amostra grande. Abordagens moleculares tradicionais tais como Sanger sequenciamento da mesma forma são limitados em sua sensibilidade e a detecção de diversas comunidades microbianas.
Sequenciamento de última geração permite a identificação rápida de micróbios de um grande número de amostras. A presença de genes marcadores padrão e permite que mais de bancos de dados de referência avançada resolução taxonômica, frequentemente ao nível de gênero ou espécie. Pequena subunidade ribossomal RNAs são frequentemente usados para atingir esse objetivo, com 16S rRNA sendo os mais comuns devido à presença de regiões conservadas e variáveis dentro do gene, permitindo a criação de primers universais com amplicons exclusivo para cada bacteriana espécie de13,14. Este relatório detalha um procedimento para identificar táxons no carrapato microbiome através do sequenciamento de próxima geração do 16S rRNA. Em particular, este protocolo enfatiza as etapas envolvidas na preparação de amostras para sequenciamento. Mais generalizada de detalhes sobre o sequenciamento e bioinformática passos são fornecidos, como há uma variedade de plataformas de sequenciamento e análise programas atualmente disponíveis, cada um com extensa documentação existente. A viabilidade global desta abordagem de sequenciamento de nova geração é demonstrada por aplicá-lo a uma investigação do conjunto da comunidade microbiana dentro de um vetor de doença chave.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q3326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Agen Court</td>
			<td>A63880&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Magnetic Rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Nextera Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T7724</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing

Nas últimas décadas, as doenças transmitidas por vetores têm ressurgiu e expandiu-se em alarmantes taxas, causando considerável morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eficazes e amplamente disponíveis vacinas estão faltando para a maioria destas doenças, necessitando o desenvolvimento de estratégias de mitigação da doença romance. Para este efeito, uma avenida promissora de controle da doença envolve alvejar o vetor microbiome, a comunidade de micróbios que habitam o vetor. O vetor microbiome desempenha um papel fundamental na dinâmica do patógeno, e manipulações da microbiome conduziram a vector reduzida abundância ou patógeno de transmissão por um punhado de doenças transmitidas por vetores. No entanto, traduzir esses achados em aplicações de controle da doença requer uma compreensão completa da ecologia microbiana do vetor, historicamente limitada pela tecnologia insuficiente neste campo. O advento da próxima geração de sequenciamento abordagens permitiu arranjar em sequência rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Direcionamento do gene de rRNA 16S altamente conservada tem facilitado caracterizações de micróbios presentes dentro vetores sob diferentes condições ecológicas e experimentais. Esta técnica envolve a amplificação do gene 16S rRNA, barcoding amostra através do PCR, amostras de carregamento para uma célula de fluxo para sequenciamento, e se aproxima de Bioinformática para combinar dados de sequência com informação filogenética. Espécie ou identificação de gênero-nível para um elevado número de repetições normalmente pode ser alcançada através desta abordagem, evadir-se, assim, desafios de baixa detecção, resolução e saída de cultivo tradicional, microscopia ou coloração histológica técnicas. Portanto, esse método é well-suited para caracterizar o vector micróbios sob diversas condições, mas atualmente não pode fornecer informações sobre função microbiana, localização dentro do vetor, ou a resposta ao tratamento com antibióticos. Em geral, 16S sequenciamento de próxima geração é uma técnica poderosa para compreender melhor a identidade e o papel dos micróbios vetor na dinâmica da doença.

Um total de 42 tiques de ovo separado três embreagens e dois períodos de exposição ambiental, 0 e 2 semanas no solo, foram processados para microbiome sequenciamento. Cada grupo de tratamento, considerado uma única vez de embreagem e exposição, contida 6-8 Replicar amostras de carrapato. Estes extratos de carrapato processados foram carregados de um sequenciador de última geração e renderam 12,885,713 leituras emparelhado-fim, passando o filtro. Incluído neste prazo foram 3 con...

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

This method can help answer key questions in the field of vector-borne disease ecology such as, what role does the vector microbiome play in pathogen dynamics, and how do vector microbiomes form and vary? The main advantages of this technique are that it allows for high replication, and high resolution and identification, allowing the user to accurately characterize vector microbiome under varying ecological and environmental conditions. Visual demonstration of this method is important, as the microbiome sequencing setup steps are difficult to learn, and there are many different products available, and techniques, but few available resources for learning these steps.Begin this procedure with tick collection, as described in the text protocol. To remove surface contaminants from the ticks, add 500 microliters of hydrogen peroxide, and vortex for 15 seconds. Repeat this wash with 70%ethanol, and then double-distilled water.Place the ticks into a new PCR tube, and allow them to air dry. In this tube, mechanically disrupt tick tissues by crushing the ticks with a mortal and pestle. Purify DNA from individual ticks, following the instructions provided in a commercially available DNA extraction kit.Elute to a final volume of 100 microliters. Creating a negative control at the extraction step is critical for later differentiating suspected contaminants from true vector microbes. Using sterile technique during the extraction step and later PCR steps is also necessary to minimize the impact of contamination common in 16S sequencing.Set up the amplicon PCR in a 27.5 microliter reaction containing five microliters of each primer at one micromolar and 12.5 microliters of commercially available PCR mix. Also include five microliters of DNA extracted from individual ticks at a five nanograms per microliter concentration. Move the tubes to a thermocycler and run the program listed in the text protocol.Once the PCR is done, visualize the PCR product by loading four to six microliters per sample on a 1.5%agarose gel. Look for a band at 460 base pairs to confirm amplification. Using a new PCR tube for each sample, combine the PCR product with double-distilled water to obtain a total of 60 microliters.For samples with low DNA concentrations, perform amplicon PCR in triplicate to reduce amplification bias and pool the samples to concentrate. Bring paramagnetic beads to room temperature and vortex them well before use. Add 48 microliters of paramagnetic beads to 60 microliters of the sample and incubate for five minutes.Place the tubes on a magnetic rack for five minutes until the solution becomes clear. Then, remove the supernatant. With tubes on the magnetic rack, add 500 microliters of freshly prepared 80%ethanol.Immediately after adding ethanol to all tubes, pipette out the liquid, do not remove the beads. Repeat the ethanol addition and removal one more time. Air dry the samples to remove excess ethanol by leaving the tubes open on the magnetic rack for five minutes or until small cracks are visible in the beads.Now, add 20 microliters of TE buffer and incubate the samples off the magnet at room temperature. After five to 10 minutes place the tubes back on the magnet. Once the beads and liquid are separated, transfer the supernatants to a fresh tube to obtain the cleaned PCR product.Assign unique primer combinations to each sample, by selecting either forward or reverse primers or both from a commercially available library index kit. To attach the dual primers or indices to the samples, prepare a PCR reaction containing 2.5 microliters of each primer, 12.5 microliters of commercially available PCR Master Mix, five microliters of double-distilled water, and 2.5 microliters of cleaned amplicon product. Move the tubes to a thermocycler programmed as detailed in the text protocol.Once the PCR is done, visualize the PCR product by loading four to six microliters per sample on a 1.5%agarose gel. Look for a band at 550 base pairs to confirm amplification before performing the clean-up procedure as before. To perform accurate quantification of each purified barcoded product run qPCR on each sample and standard in triplicate and run each sample at three or more dilution levels.Prepare 10 microliter qPCR reactions containing six microliters of qPCR Master Mix, two microliters of double-distilled water, and two microliters of the sample or standard. Move the qPCR plate to a real-time PCR instrument programmed as described in the text protocol and perform the run. Following quantification, create the combined library by adding equal volumes of all individual libraries into a single tube.After diluting and denaturing the combined library and the sequencing control, load the combined mixture onto the sequencing flow cell. Thoroughly clean the flow cell prior to loading for optimum optics. Then, load the flow cell onto the sequencer and perform amplicon sequence analysis.Rarefaction curves for sequence count normalization are shown here. These curves indicate that rarefying to 2000 sequences per sample should be sufficient to capture the full diversity of observed operational taxonomic units. After rarefying and quality filtering the sequence reads, alpha and beta diversity output is performed.Shown here is an automatically generated principle coordinates analysis plot depicting how tick microbiome composition differs based on treatment. Further, visualization of the microbes present within each sample, shown here at they phylum level, are automatically created for all samples. While attempting this procedure, it's important to remember to maintain sterile technique to minimize the effect of microbial contamination which can critically impact sequence data interpretation.Following this procedure, other methods like histological staining can be performed to answer additional questions such as, where are the observed microbes located within the vector? After its development, this method paved the way for researchers in the field of molecular ecology to explore the role of microbial interactions within the vector and investigate how this may effect pathogen transmission.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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