Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31772191), le projet de recherche d’intérêt Public dans la Province du Zhejiang (2017C 32027), la clé Science projet de sélection végétale dans le Zhejiang (2016C 02051) et le Programme National pour le Support de Top-Notch jeunes professionnels (à P.X.).

1. stérilisation et la Germination des semences
<ol><li>Pour la stérilisation en surface, tremper les graines de la gourde dans un bécher de 500 mL, rempli d’eau à 58 ° C en remuant occasionnellement, jusqu'à ce que la température de l’eau baisse à 40 ° C.</li>
	<li>Pendant ce temps, mettre 3 kg de tourbe dans un sac en nylon et, pour stériliser, autoclave à 120 ° C/0.5 MPa pendant 20 min.</li>
	<li>Gardez le trempage des graines de la gourde pendant 4-5 h plus sous aucune agitation.<ol>
<li>Une fois qu...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrit en détail une méthode très efficace et reproductible pour faire homo - et xénogreffe entre la pastèque et la gourde. Cette méthode, ne nécessitant aucun équipement spécifique, est très facile à utiliser et a généralement un taux de survie très élevé de greffage. La méthode peut également être utilisée pour faire des greffes d’autres cucurbitacées, comme entre pastèque, concombre et citrouille.
Il est à noter que la taille relative (âge)...

Greffage a longtemps été employé comme une technique agricole pour améliorer la production agricole et la tolérance aux stress biotiques et abiotiques1,2,3. Dans les systèmes heterografting, porte-greffes élites peuvent améliorer l’absorption de l’eau et les nutriments des plantes, renforcer la résistance aux agents pathogènes du sol et limiter les effets négatifs de la toxicité des métaux4,5, qui peuvent conférer les greffons un patrimoine vigueur de la croissance et une tolérance accrue aux stress environnementaux. Dans de nombreux cas, heterografting peut également avoir des répercussions qualités de fruits chez les plantes horticoles, menant à saveur de fruits améliorés et accroissement du contenu liés à la santé des composés6,7. Il a été constaté que le transfert longue distance de phytohormones, ARN, peptides et protéines entre le porte-greffe et le greffon est un mécanisme fondamental modulation de la croissance et le développement de reprogrammation de scion plantes8,9 ,,10. La greffe a été largement utilisée dans les études de signalisation sur de longues distances et le transport en ce qui concerne l’adaptation environnementale11. Expériences de greffes sont particulièrement puissants pour la détection sans ambiguïté des molécules transmises en récepteurs tissulaires ou vasculaire sap et activation ou suppression des cibles moléculaires en raison de la transmission de signal12.
ARN non codant, une grande classe d’ARN qui exercent des fonctions de régulation importantes dans les cellules, ont été signalés à jouer un rôle en facilitant l’adaptation des plantes au stress abiotique13. miARN est endogènes petit non-codantes ARN d’environ 20-24 nt. des études ont révélé le rôle régulateur des miARN dans divers aspects des activités de l’usine, tels que tire la croissance, des latéraux racine formation14,15,16, absorption des éléments nutritifs, le métabolisme de sulfate et homéostasie17et réponses aux stress biotiques et abiotiques insistent sur18. Récemment, l’expression des miARN et leurs gènes cibles étaient liés à la tolérance au stress dans les plants de concombre heterografted19de sel. Dans les greffons intervariety du raisin, les réponses de miRNA expression de contrainte de la sécheresse ont été trouvés à être dépendante de génotype20.
Le développement rapide et diminuant les coûts de la technologie de séquençage haut-débit ont fourni une excellente occasion pour l’étude des règlements de miRNA chez les plantes agronomiques. Pastèque (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), une récolte importante cucurbitacées cultivées dans le monde entier, est sensible aux basses températures. Calebasse (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) est une climat plus élastique cucurbitacées couramment utilisées par les agriculteurs à la greffe avec la pastèque. L’objectif principal de cette étude est d’établir une norme, efficace et la méthode pratique pour la fabrication de xénogreffe entre la pastèque (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) et la calebasse (Lagenaria siceraria [Molina] lettre standard). Ce protocole fournit également un schéma expérimental détaillé et méthodes analytiques pour l’étude de la régulation des expressions de miRNA après greffage, qui est utile pour révéler les mécanismes sous-jacents des avantages heterografting.
Le matériel végétal utilisé dans cette étude inclure le cultivar de la pastèque et le landrace gourde. Cultivar de la pastèque est un cultivar commercial à haut rendement mais sensibles aux basses températures. La gourde landrace est un porte-greffe populaire pour greffage avec pastèque, concombre et gourde, en raison de son excellente tolérance des basses températures21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

MicroARN (miARN) est endogènes petit non-codantes ARN d’environ 20-24 nt, connus pour jouer un rôle important dans le développement de la plante et l’adaptation. Il y a une accumulation preuve montrant que les expressions de certains miARN sont modifiées lorsque la greffe, une pratique agricole couramment utilisée par les agriculteurs pour améliorer la tolérance des cultures aux stress biotiques et abiotiques. La gourde est une culture intrinsèquement résilience climatique par rapport aux nombreux autres cucurbitacées majeures, y compris le melon d’eau, rendant l’un des porte-greffes plus largement utilisés pour le second. La promotion récente de technologies de séquençage haut-débit a fourni de grandes possibilités d’enquêter sur les miARN froid-sensible et leurs contributions aux avantages hétérogreffe ; Pourtant, les procédures expérimentales adéquates sont une condition préalable à cet effet. Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer efficacement des homo - et xénogreffe entre le melon d’eau froide-sensibles et la gourde résistant au froid, en plus des méthodes de prélèvement d’échantillons de tissus, la génération de données et l’analyse des données. Les méthodes présentées sont également utiles pour d’autres systèmes de plantes-greffe, d’interroger miRNA règlements sous différentes contraintes environnementales, comme la chaleur, la sécheresse et la salinité.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figure 2 : phénotypes différents greffons à température ambiante et des conditions de stress froid. (a) ce panneau montre homo - et semis heterografted à température ambiante comme contrôle. (b) ce panneau montre les homo - et heterografted plantules après 48 h de traitement par le froid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242f...

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Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Générant des Homo - et xénogreffe entre la pastèque et la gourde pour l’étude des microARN froid-sensible

Nous présentons ici un protocole détaillé pour faire efficacement des homo - et xénogreffe entre pastèque et gourde, en plus des méthodes de prélèvement d’échantillons de tissus, la génération de données et l’analyse des données, pour l’étude des microARN froid-sensible.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la réponse miRNA à la capacité de stress dans les greffes de plantes telles que la façon dont miRNA sont réglementés sous le stress froid dans les greffes de gourde bouteille pastèque. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est une méthode très efficace et reproductible pour fabriquer de l’homo et des hétérogreffes. Il ne nécessite pas d’équipement spécifique, il est très facile à effectuer, et se traduit généralement par un taux de survie très élevé de la greffe.Grâce à cette méthode, peut fournir un aperçu de la réponse miRNA au stress dû au froid dans le système de greffe de gourde de bouteille de pastèque. Il peut également être appliqué à d’autres organismes modernes pour révéler les mécanismes du transport local et à longue distance miRNA. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car les étapes de greffe sont difficiles à apprendre.Cette étape exigeait des compétences avancées et est essentielle à la survie des plantes greffées. Pour commencer, tremper les graines de gourde dans un bécher de 500 millilitres de 58 degrés Celsius d’eau. Remuer les graines de temps en temps jusqu’à ce que la température de l’eau descende à 40 degrés Celsius.Pendant que l’eau refroidit, mettez trois kilogrammes de terre tourbe dans un sac en nylon et autoclavez-la. Une fois que l’eau atteint la température ambiante, rincer les graines deux à trois fois dans de l’eau distillée et égoutter l’excès d’eau. Laissez les graines germer dans un sac de gaze à 28 degrés Celsius dans la chambre de croissance sombre.Après la germination, semer les graines dans des pots en plastique remplis du sol tourbeux stérilisé. Lorsque les semis de gourde de bouteille développent deux cotyléons aplatis, répétez ce processus avec des graines de pastèque. Faire pousser la gourde de bouteille et les semis de pastèque dans une chambre de croissance.Ajouter de l’eau aux semis une fois par jour l’après-midi. Ensuite, couper les hypocotyls des semis de pastèque de deux à trois centimètres sous les cotyléons. Couper le dessus des semis de gourde de bouteille sur le côté, immédiatement au-dessus des cotyléons.Ensuite, utilisez un cure-dent pour faire un trou dans le haut des semis de gourde de bouteille taillés. Insérez les plants de pastèque taillés dans le trou pour faire des hétérogreffes. Après cela, préparer des homogreffes en utilisant la méthode précédemment décrite.Tout d’abord, envelopper les semis greffés dans des sacs transparents en polyéthylène pour maintenir une humidité relativement élevée. Ensuite, maintenez les semis enveloppés dans une chambre de croissance pendant sept jours. Après le septième jour, retirer les sacs et laisser pousser les plantes dans les mêmes conditions pendant sept à dix jours.Divisez les semis en deux groupes, l’un pour les traitements contre le rhume et l’autre pour le contrôle. Remettre les semis de contrôle dans les mêmes conditions environnementales. Placez les semis traités à froid dans une chambre de croissance réglée à six degrés Celsius avec les mêmes conditions sombres et légères que le groupe témoin.Après 48 heures, laissez les échantillons du scion et des porte-greffes des greffes. Congelez immédiatement les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 70 degrés Celsius. Transférer l’échantillon congelé dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres dans de l’azote liquide.Ajouter une perle en acier inoxydable à chaque tube d’échantillon et homogénéiser les tissus à une poudre fine. Pour chaque combinaison de greffage, prenez des quantités égales d’échantillon moulu à partir de 10 semis et mélangez-les dans un tube de centrifugeuse de 10 millilitres. Ajouter une quantité appropriée de reagent d’hydrochlorure de guanidium.Ensuite, ajoutez un à 150 unités par millilitre à 37 degrés Celsius sans ARN pendant une heure. Déterminez ensuite la quantité totale d’ARN sur un système d’électrophorésie microcapillaire. Après cela, décongelez les réaccateurs et adaptateurs de normalisation de la bibliothèque.Puis ligate petit RNase avec les cinq adaptateurs premier et trois premiers, et elute et les purifier. Reverse transcrire les cinq premier et trois premier ligated petite RNase suivant les directives du fabricant. Ensuite, effectuez l’amplification PCR suivant le protocole du fabricant.Ensuite, utilisez le système d’électrophoresis microcaillary pour s’assurer que le nombre d’intégrité de l’ARN est supérieur à sept. Chargez un microlitre d’une bibliothèque d’ARN sur le système d’électrophoresis microcapillllaire pour s’assurer que le numéro d’intégrité de l’ARN est supérieur à sept. Enfin, séquencez les petites bibliothèques d’ARN sur un instrument de séquençage à haut débit.En utilisant ce protocole, un taux de survie de 98% pour la greffe et les phénotypes pour la température ambiante et les conditions de stress froid ont été obtenus. les ARN de 24 nucléotides ont composé la plus grande classe d’ARN dans toutes les combinaisons de greffage, indépendamment du traitement de température. Après 48 heures de traitement à froid, 30 et 268 microARN ont été régulés de haut en bas, respectivement.Dans les feuilles de la scion dans les hétérogreffes, inversement, dans les feuilles du porte-greffe, 31 et 12 microARN étaient de haut en bas-réglés, respectivement. Dans les homogreffes de pastèque-pastèque, 64 et 83 microARN ont été vers le haut et vers le bas-réglés, respectivement. Ceci a démontré que l’hétérogreffe a causé la reprogrammation profonde des expressions de microARN.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler la taille relative et l’âge de la tige de fille et le scion est essentiel pour faire une greffe réussie. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage de lncRNA, le profilage protéomique peuvent être effectuées afin d’étudier la régulation de l’ARNl et des protéines et le système de codage dans le système de greffage. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la tolérance abiotique des plantes pour explorer le mécanisme de l’avantage de greffe de plantes à Cucurbitaceae et au-delà.N’oubliez pas que le travail avec l’hydrochlorure de guanidine peut être extrêmement dangereux et des précautions appropriées doivent toujours être prises avec l’exécution de cette procédure.

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