Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31772191), פרויקט מחקר ענין לציבור, ג'ה-ג'יאנג (2017C 32027), מפתח המדע הפרוייקט של נעשו בג'ה-ג'יאנג (2016C 02051), התכנית הלאומית התמיכה של אנשי עסקים צעירים מעולה (אל P.X.).

1. עיקור וה נביטת הזרעים
<ol><li>עבור משטח עיקור, משרים את זרעי דלעת הבקבוק בתוך 500-mL מלא מים ב 58 ° C עם ערבוב מדי פעם, עד טמפרטורת המים יורדת ל- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בינתיים, לשים 3 ק ג של אדמת כבול לתוך שקית ניילון, לחטא זה, החיטוי זה 120 ° C/0.5 MPa כעשרים דקות.</li>
	<li>שמור השריית הזרעים דלעת הבקבוק h 4-5 יות...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר בפירוט שיטה יעילה מאוד לשחזור כדי להפוך הומו - heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק. שיטה זו, הדורשים אין ציוד ספציפי, קל מאוד לתפעול וכוללת בדרך כלל שיעור הישרדות מאוד גבוהה של הרכבה. השיטה גם ניתן לבצע שתלים לקבלת cucurbits אחרים, כגון בין אבטיח, מלפפון, דלעת.
רא?...

הרכבה זמן כבר מועסקים כ טכניקה חקלאית כדי לשפר את ייצור יבול, עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים1,2,3. במערכות heterografting, כנות האליטה יכול לשפר את ספיגת מים וחומרים מזינים של צמחים לחיזוק עמידות בפני פתוגנים בקרקע, להגביל את ההשפעות השליליות של מתכות רעילות4,5, אשר עשויה לתת השתלים משופרת מרץ צמיחה, עמידות מוגברת בפני לחצים סביבתיים. במקרים רבים, heterografting יכול גם להשפיע איכויות פרי בצמחים הגננות, שמוביל בטעם פירות משופרת ותכניה מוגברת תרכובות הקשורים לבריאות6,7. זה נמצא כי העברת הבינעירוניים phytohormones, RNAs, פפטידים וחלבונים בין את כנות הנצר הוא מנגנון בסיסי להתכוונן את הצמיחה ואת פיתוח התכנות של נצר צמחים8,9 ,10. הרכבה כבר בשימוש נרחב במחקרים של איתות הבינעירוניים ואמצעי התחבורה ביחס הסתגלות סביבתית11. ניסויים הרכבה חזקים במיוחד לצורך זיהוי ברורה וחד משמעית של מולקולות המשודרת בקבלת רקמות או sap כלי הדם, ואת ההפעלה או דיכוי של מטרות מולקולריות עקב אות שידור12.
Non-קידוד RNAs, מחזור גדול של RNA להפעיל פונקציות חשובות תקינה בתאים, דווחו לשחק תפקיד בקידום הצמח ההסתגלות מתח והאביוטיים13. miRNAs הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt. מחקרים גילו תפקיד miRNAs בהיבטים שונים של הצמח פעילות תקינה, כגון כמו יורה צמיחה, לרוחב שורש היווצרות14,15,16, ספיגת התזונתי, סולפט מטבוליזם הומאוסטזיס17, ואת התגובות ביוטיים, והאביוטיים להדגיש18. לאחרונה, הביטוי של miRNAs ואת הגנים היעד שלהם היו קשורות מלח מתח סובלנות שתילי מלפפון heterografted19. השתלים intervariety ענבים, התגובות של miRNA ביטוי למתח הבצורת נמצאו תלויי-גנוטיפ20.
ההתפתחות המהירה של הפחתת העלות של הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף סיפקו הזדמנות גדולה עבור המחקר לתקנות miRNA בצמחים אגרונומיים תחת פיקוח הדוק. אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.), של cucurbit חשוב הגידול ברחבי העולם, היא חשופה בטמפרטורות נמוכות. דלעת הבקבוק (Lagenaria siceraria [מולינה] Standl..) כאכארביט יותר. האקלים-גמישים בשימוש נפוץ על ידי חקלאים כדי להשתיל עם אבטיח. המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הוא לבסס סטנדרט, יעיל, ושיטת נוח להכנת heterografts בין אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.) דלעת הבקבוק (StandlLagenaria siceraria [מולינה]). פרוטוקול זה מספק גם ערכה ניסוי מפורט נהלים אנליטיים לחקר ברגולציה של ביטויים miRNA בעקבות השתלת עור, אשר הוא שימושי עבור חשיפת המנגנונים heterografting יתרונות.
החומרים הצמח השתמשו במחקר זה כוללים את הזן אבטיח את צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק. לדבורי אבטיח הוא זנים מסחריים עם תשואה גבוהה אבל רגישים בטמפרטורה נמוכה. צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק הוא ככנה פופולרי עבור הרכבה עם אבטיח, מלפפון, דלעת, עקב שלה עמידות מעולה של טמפרטורות נמוכות21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

Rna (miRNAs) הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt, ידוע תפקיד חשוב ב מפעל פיתוח והתאמה. ראיות המצטבר מראה כי הביטויים של miRNAs מסוימים הם שינו בעת השתלת עור, תרגול החקלאי בשימוש נפוץ על ידי חקלאים לשיפור יבול עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים. דלעת הבקבוק הוא חיתוך גמיש מטבעו האקלים לעומת רבים אחרים הגדולות cucurbits, לרבות אבטיח, טיוח זה לאחד כנות הנפוצה ביותר עבור האחרון. לקידום טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה האחרונות סיפקה הזדמנויות גדולות לחקור miRNAs קר מגיב ותרומתם יתרונות heterograft; ובכל זאת, שגרות ניסיוני נאותה הן תנאי הכרחי למטרה זו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת ביעילות הומו - ו heterografts בין אבטיח קר, רגישים את הדלעת בקבוק קר-סובלנית, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים. השיטות הציג שימושיים גם למערכות אחרות מפעל הרכבה, לחקור miRNA תקנות תחת לחצים סביבתיים שונים, כגון חום, יובש, מליחות.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> איור 2: פנוטיפים שתלי שונים-בטמפרטורת החדר ותנאים הדגיש קר. () לוח זה מראה הומו - שתילים heterografted בטמפרטורת החדר של הפקד. (b) לוח זה מראה הומו - שתילים heterografted לאחר 48 שעות של טיפול קר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

יצירת הומו - ו Heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק לחקר מיקרו Rna קר-תגובה

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת ביעילות הומו - ו heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים, עבור החקירה של הקור מגיבים מיקרו Rna.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתגובה miRNA ליכולת להדגיש שתלים צמחיים כגון איך miRNA מוסדרים תחת לחץ קר שתלי דעת בקבוק אבטיח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא שיטה יעילה מאוד לשחזור לעשות הומו הטרוגרפטים. זה לא דורש ציוד ספציפי, זה קל מאוד לבצע, ובדרך כלל תוצאות שיעור הישרדות גבוה מאוד של השתלה.באמצעות שיטה זו, יכול לספק תובנה לתוך תגובת miRNA ללחץ קר במערכת שתלי הדם בקבוק אבטיח. זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים מודרניים אחרים לחשיפת המנגנונים של תחבורה miRNA מקומית למרחקים ארוכים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלבי השתלה קשה ללמוד.שלב זה דרש מיומנויות מתקדמות והם המפתח להישרדותם של הצמחים המושתלים. כדי להתחיל, להשרות זרעי דלעת בקבוק ב 500 מיליליטר מקור של 58 מעלות צלזיוס מים. מערבבים את הזרעים מדי פעם עד טמפרטורת המים יורדת ל 40 מעלות צלזיוס.בזמן שהמים מתקררים, מכניסים שלושה קילוגרמים של אדמת כבול לשקית ניילון ומקלים אותה באופן אוטומטי. ברגע שהמים מגיעים לטמפרטורת החדר, שוטפים את הזרעים פעמיים עד שלוש פעמים במים מזוקקים ומנקזים את המים העודפים. אפשר לזרעים לנבוט בשקית גזה ב 28 מעלות צלזיוס בתא הצמיחה הכהה.לאחר הנביטה, לזרוע את הזרעים לתוך סירי פלסטיק מלא באדמת כבול מעקר. כאשר שתילי דלעת הבקבוק לפתח שני cotyledons שטוח, לחזור על תהליך זה עם זרעי אבטיח. לגדל את דליע הבקבוק שתילי אבטיח בתא צמיחה.מוסיפים מים השתילים פעם ביום אחר הצהריים. לאחר מכן, חותכים את ההיפוקוטילים של שתילי האבטיח שניים עד שלושה סנטימטרים מתחת לקוטילדון. חותכים את החלק העליון של שתילי דלעות הבקבוק בצד, מיד מעל הקוטילדונים.לאחר מכן השתמש בקיסם כדי לעשות חור בחלק העליון של שתילי דליע בקבוק גזוז. הכנס את שתילי האבטיח הגזוזים לתוך החור כדי להפוך את הטרוגרפטים. לאחר מכן, להכין הומוגרפטים באמצעות השיטה שתוארה קודם לכן.ראשית, לעטוף את השתילים מושתלים בשקיות פוליאתילן שקופות כדי לשמור על לחות גבוהה יחסית. לאחר מכן לשמור על שתילים עטופים בתא צמיחה במשך שבעה ימים. לאחר היום השביעי, להסיר את השקיות ולאפשר לצמחים לגדול באותם תנאים במשך שבעה עד 10 ימים.מחלקים את השתילים לשתי קבוצות, אחת לטיפולים קרים והן לשליטה. להחזיר את שתילי הבקרה לאותם תנאים סביבתיים. מניחים את השתילים המטופלים בקור בתא גדילה שנקבע לשש מעלות צלזיוס עם אותם תנאים כהים בהירים כמו קבוצת הביקורת.לאחר 48 שעות, להשאיר את הדגימות של scion ו rootstocks מן השתלים. להקפיא את הדגימות מיד בחנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 70 מעלות צלזיוס. מעבירים את הדגימה הקפואה לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר בחנקן נוזלי.מוסיפים חרוז נירוסטה לכל צינור מדגם ומדגימים את הרקמות לאבקה דקה. עבור כל שילוב השתלה, לקחת כמויות שוות של מדגם הקרקע מ 10 שתילים ומערבבים אותם בצינור צנטריפוגה 10 מיליליטר. הוסף כמות מתאימה של גואנידיום הידרוכלוריד רגנט.לאחר מכן, מוסיפים DNase ללא RNA 1 עד 150 יחידות למיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן לקבוע את כמות RNA הכוללת על מערכת אלקטרופורזה מיקרו-קפילארית. לאחר מכן, הפשר את רייגנטים ומתאמים לנורמליזציה של הספרייה.לאחר מכן ligate RNase קטן עם חמישה מתאמים ראשוניים ושלושה עיקריים, ולחמק ולטהר אותם. הפוך לתמלל את חמש ראשי ושלושה RNase קטן מגרתיים מגרתיים בעקבות הנחיות היצרן. לאחר מכן, בצע הגברה של PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן.לאחר מכן השתמש במערכת האלקטרופורזה המיקרו-קילרית כדי להבטיח שמספר תקינות ה-RNA גדול משבע. טען מיקרוליטר אחד של ספריית RNA במערכת האלקטרופורזה המיקרו-קפילרית כדי להבטיח שמספר תקינות ה-RNA גדול משבע. לבסוף, רצף ספריות RNA קטנות על מכשיר ריצוף תפוקה גבוהה.באמצעות פרוטוקול זה, שיעור הישרדות של 98% עבור השתלה ואת פנוטיפים עבור טמפרטורת החדר ותנאי מתח קר הושגו. sRNAs של 24 נוקלאוטידים היוו את המחלקה הגדולה ביותר של sRNAs בכל שילוב השתלות, ללא קשר לטיפול בטמפרטורה. לאחר 48 שעות של טיפול קר, 30 ו 268 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה.בעלים של scion בהטרוגרפטים, לעומת זאת, בעלים של rootstock, 31 ו 12 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה. בהומוגרפטים אבטיח אבטיח, 64 ו 83 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה. זה הראה כי הטרוגרפטינג גרם לתכנות מחדש עמוק של ביטויי microRNA.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הגודל והגיל היחסיים של גבעול הבת ואת scion הוא קריטי להכנת שתל מוצלח. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו רצף lncRNA, פרופיל proteomic יכול להתבצע על מנת לחקור את הרגולציה של lncRNA וחלבון ואת מערכת הקידוד במערכת השתלה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום הסובלנות abiotic הצמח לחקור את המנגנון של יתרון השתלת צמחים Cucurbitaceae ומעבר.אל תשכח כי עבודה עם guanidine הידרוכלוריד יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות מתאים תמיד יש לנקוט עם ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Environment

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

פרוטוקול לעריכת סימולציה גשם לחקר ניגר קרקע

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

השימוש ברזולוציה גבוהה אינפרא אדום תרמוגרפיה (HRIT) לחקר הקרח נוקלאציה וקרח רביה בצמחים

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

פרוטוקול עבור דגימת חלקיקים על פני הים וניתוח לדוגמא

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

הפקת חומרי הדברה אורגנוכלורינים מפלסטיק וגלגול סוג פלסטיק

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

להגדרת הטור ניסיוני ללמוד אנאירובית Biogeochemical אינטראקציות בין והידרוקסידים ברזל (אוקסי), יסודות קורט, חיידקים

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

המערכת האקולוגית פרוטוקולים פבריקציה נוספת (EcoFAB) להקמת מערכות אקולוגיות מעבדה שנועדה ללמוד אינטראקציות צמח-חיידק

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

ניסויי חקר הקשר בין גודל החלקיקים מתאן וספיחה מתוקף פצלי

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

הבחירה ו- Bioassays לא-הבחירה ללמוד את העדפה להתגלמות והצלחה הופעתה של Ectropis grisescens

Many insects live above the ground as larvae and adults and as pupate below the ground. Compared to the above-ground stages of their life cycles, less ...