Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (31772191), il progetto di ricerca di interesse pubblico nella provincia di Zhejiang (2017C 32027), la chiave scienza progetto di allevamento vegetale in Zhejiang (2016C 02051) e il programma nazionale per il supporto di prim'ordine giovani professionisti (per spaccio).

1. sterilizzazione e germinazione del seme
<ol><li>Per la sterilizzazione superficiale, immergere i semi di zucca bottiglia in un becher da 500 mL con acqua a 58 ° C con agitazione occasionale, fino a quando la temperatura dell'acqua scende a 40 ° C.</li>
	<li>Nel frattempo, mettere 3 kg di terreno della torba in un sacchetto di nylon e, per sterilizzare, autoclave a 120 ° C/0.5 MPa per 20 min.</li>
	<li>Tenete in ammollo i semi di zucca bottiglia per 4-5 h più con nessuna agitazione.<ol>
<li>Una volta che l'acqua ...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

In questo protocollo, abbiamo descritto in dettaglio un metodo altamente efficace e riproducibile per rendere omo - e heterografts tra anguria e zucca del Pellegrino. Questo metodo, che richiedono senza attrezzature specifiche, è molto facile da usare e in genere ha un tasso di sopravvivenza molto alta di innesto. Il metodo è utilizzabile anche per fare innesti per altre cucurbitacee, come tra anguria, cetriolo e zucca.
Vale la pena notare che la dimensione relativa (età) del portainnesto e...

L'innesto è stato impiegato a lungo come una tecnica agricola per migliorare la produzione vegetale e la tolleranza agli stress biotici e abiotici1,2,3. Nei sistemi heterografting, portinnesti d'eliti possono migliorare l'assorbimento di acqua e sostanze nutritive delle piante, rafforzare la resistenza ai patogeni del suolo e limitare gli effetti negativi della tossicità del metallo4,5, che possono conferire una maggiore gli innesti vigore di crescita e una maggiore tolleranza agli stress ambientali. In molti casi, heterografting possono avere un impatto anche qualità di frutta in piante orticole, che conduce al sapore di frutta migliorata e maggiore contenuto di composti correlati con la salute6,7. È stato trovato che il trasferimento a lunga distanza di fitormoni, RNAs, peptidi e proteine fra il portinnesto e la marza è un meccanismo fondamentale modulando la crescita e lo sviluppo riprogrammazione di scion piante8,9 ,10. L'innesto è stato ampiamente usato negli studi di segnalazione a lunga distanza e trasporto in relazione di adattamento ambientale11. Esperimenti di innesto sono particolarmente potenti per inequivocabile rivelazione di molecole trasmesse nella ricezione del tessuto o vascolare sap e l'attivazione o soppressione di bersagli molecolari a causa di segnale trasmissione12.
RNA non-codificanti, una grande classe di RNA che esercitano importanti funzioni di regolamentazione in cellule, è stati segnalati a giocare un ruolo nel facilitare l'adattamento della pianta a stress abiotici13. i miRNA sono endogeni di piccoli RNA non codificanti di circa 20-24 nt. studi hanno rivelato il ruolo regolatore dei miRNA nei vari aspetti dell'attività degli impianti, così come sparare crescita, laterale radice formazione14,15,16, l'assorbimento di nutrienti, metabolismo di solfato e omeostasi17e risposte a stress biotici e abiotici stress18. Recentemente, l'espressione di Mirna e dei loro geni bersaglio sono stati collegati al sale tolleranza allo stress in piantine di cetriolo heterografted19. Negli innesti di intervariety di uva, le risposte dell'espressione dei miRNA a stress idrico sono state trovate per essere dipendente dal genotipo20.
Il rapido sviluppo e diminuendo il costo della tecnologia di sequenziamento ad alta velocità hanno fornito una grande opportunità per lo studio dei regolamenti di miRNA in piante agronomiche. Cocomero (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), una coltura importante cucurbita in tutto il mondo, è sensibile alle basse temperature. Zucca del Pellegrino (siceraria Lagenaria [Molina] Standl.) è una cucurbita di resilienza del clima più comunemente utilizzata dagli agricoltori per l'innesto con l'anguria. L'obiettivo primario di questo studio è quello di stabilire uno standard, efficiente e conveniente metodo per rendere heterografts tra cocomero (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e bottiglia zucca (siceraria Lagenaria [Molina] Standl). Questo protocollo prevede inoltre un dettagliato schema sperimentale e procedure analitiche per lo studio della regolazione di miRNA espressioni dopo l'innesto, che è utile per rivelare i meccanismi alla base di vantaggi heterografting.
I materiali vegetali utilizzati in questo studio includono la cultivar di anguria e la zucca bottiglia landrace. Cultivar di anguria è una cultivar commercio con alto rendimento ma sensibili alle basse temperature. Landrace bottiglia zucca è un portinnesto popolare per l'innesto con anguria, cetriolo e bottiglia zucca, grazie alla sua eccellente tolleranza di basse temperature21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA non codificanti di circa 20-24 endogeni nt, conosciuto per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di pianta e di adattamento. C'è un'evidenza accumula mostrando che le espressioni di alcuni miRNA sono alterate quando l'innesto, una pratica agricola comunemente utilizzata dagli agricoltori per migliorare la tolleranza delle colture agli stress biotici e abiotici. Zucca del Pellegrino è una coltura intrinsecamente clima-resiliente rispetto a molte altre cucurbitacee principali, tra cui anguria, rendendolo uno dei portinnesti più ampiamente usati per quest'ultimo. Il recente progresso delle tecnologie di sequenziamento ad alte prestazioni ha fornito grandi opportunità per indagare Mirna freddo-sensible a reagire e i loro contributi ai vantaggi heterograft; Eppure, adeguate procedure sperimentali sono un prerequisito per questo scopo. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione efficiente di omo - e heterografts tra l'anguria fredda-sensibili e la zucca bottiglia fredda-tollerante, oltre ai metodi di campionamento del tessuto, generazione di dati e analisi dei dati. I metodi presentati sono anche utili per altri sistemi di impianto-innesto, per interrogare miRNA regolamenti sotto vari stress ambientali, quali calore, siccità e salinità.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figura 2: fenotipi di vari innesti a temperatura ambiente e condizioni di freddo-sollecitato. (un) questo pannello mostra omo - e piantine di heterografted a temperatura ambiente come il controllo. (b) questo pannello mostra omo - ed heterografted piantine dopo 48 h di trattamento a freddo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2larg...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Generazione di omo - e Heterografts tra anguria e zucca bottiglia per lo studio dei microRNA freddo-sensible a reagire

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per fare in modo efficiente omo - e heterografts tra anguria e zucca bottiglia, oltre ai metodi di campionamento del tessuto, generazione di dati e analisi dei dati, per l'indagine dei microRNA freddo-sensible a reagire.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella risposta al miRNA alla capacità di stress negli innesti delle piante come il modo in cui il miRNA è regolato sotto stress freddo negli innesti di zucca della bottiglia di anguria. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è un metodo altamente efficiente e riproducibile per fare homo ed eterografts. Non richiede attrezzature specifiche, è molto facile da eseguire e in genere si traduce in un tasso di sopravvivenza molto elevato di innesto.Attraverso questo metodo, può fornire informazioni sulla risposta del miRNA allo stress da freddo nel sistema di innesto della zucca della bottiglia di anguria. Può anche essere applicato ad altri organismi moderni per rivelare i meccanismi del trasporto miRNA locale e a lunga distanza. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di innesto sono difficili da imparare.Questo passaggio ha richiesto abilità avanzate e sono fondamentali per la sopravvivenza delle piante innestate. Per iniziare, immergere i semi di zucca della bottiglia in un bicchiere da 500 millilitri di acqua di 58 gradi Celsius. Mescolare i semi di tanto in tanto fino a quando la temperatura dell'acqua scende a 40 gradi Celsius.Mentre l'acqua si raffredda, metti tre chilogrammi di terreno di torba in un sacchetto di nylon e autoclava. Una volta che l'acqua raggiunge la temperatura ambiente, sciacquare i semi da due a tre volte in acqua distillata e drenare l'acqua in eccesso. Lasciare germogliare i semi in un sacchetto di garza a 28 gradi Celsius nella camera di crescita scura.Dopo la germinazione, seminare i semi in vasi di plastica riempiti con il terreno di torba sterilizzato. Quando le piantine di zucca della bottiglia sviluppano due cotyledon appiattiti, ripetere questo processo con semi di anguria. Far crescere la zucca della bottiglia e le piantine di anguria in una camera di crescita.Aggiungere acqua alle piantine una volta al giorno nel pomeriggio. Quindi, tagliare gli ipoccotili delle piantine di anguria da due a tre centimetri sotto i cotyledon. Tagliare la parte superiore delle piantine di zucca della bottiglia sul lato, immediatamente sopra i cotyledons.Quindi utilizzare uno stuzzicadenti per fare un buco nella parte superiore delle piantine di zucca della bottiglia tagliata. Inserire le piantine di anguria tagliate nel foro per creare eteroinnesti. Successivamente, preparare gli omoinnesti utilizzando il metodo descritto in precedenza.In primo luogo, avvolgere le piantine innestate in sacchetti di polietilene trasparenti per mantenere un'umidità relativamente elevata. Quindi mantenere le piantine avvolte in una camera di crescita per sette giorni. Dopo il settimo giorno, rimuovere i sacchetti e consentire alle piante di crescere nelle stesse condizioni per sette o 10 giorni.Dividere le piantine in due gruppi, uno per i trattamenti freddi e uno per il controllo. Riportare le piantine di controllo alle stesse condizioni ambientali. Posizionare le piantine trattate a freddo in una camera di crescita impostata su sei gradi Celsius con le stesse condizioni di buio chiaro del gruppo di controllo.Dopo 48 ore, lasciare i campioni del rampollino e dei portinnesti dagli innesti. Congelare immediatamente i campioni in azoto liquido e conservarli a meno 70 gradi Celsius. Trasferire il campione congelato in un tubo di microcentrifugo a due millilitri in azoto liquido.Aggiungere una perla in acciaio inossidabile a ciascun tubo campione e omogeneizzare i tessuti a una polvere fine. Per ogni combinazione di innesto, prendere quantità uguali di campione macinato da 10 piantine e mescolarle in un tubo di centrifuga da 10 millilitri. Aggiungere una quantità appropriata di reagente di cloridrato di guanidio.Successivamente, aggiungere la DNasi priva di RNA da una a 150 unità per millilitro a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi determinare la quantità totale di RNA su un sistema di elettroforesi microcapillare. Successivamente, scongelare i reagenti e gli adattatori di normalizzazione della libreria.Quindi ligate piccola RNasi con i cinque adattatori primi e tre primi, ed elutare e purificarli. Trascrivere inverso le piccole RNasi a cinque prime e tre legate prime seguendo le linee guida del produttore. Eseguire quindi l'amplificazione PCR seguendo il protocollo del produttore.Quindi utilizzare il sistema di elettroforesi microcaillareria per garantire che il numero di integrità dell'RNA sia maggiore di sette. Caricare un microlitro di una libreria di RNA sul sistema di elettroforesi microcapillareria per garantire che il numero di integrità dell'RNA sia maggiore di sette. Infine, sequenziare le piccole librerie di RNA su uno strumento di sequenziamento ad alta velocità effettiva.Utilizzando questo protocollo, è stato ottenuto un tasso di sopravvivenza del 98% per l'innesto e i fenotipi per la temperatura ambiente e le condizioni di stress freddo. gli sRNA di 24 nucleotidi formavano la più grande classe di sRNA in tutte le combinazioni di innesto, indipendentemente dal trattamento della temperatura. Dopo 48 ore di trattamento a freddo, 30 e 268 microRNA sono stati regolati rispettivamente verso l'alto e verso il basso.Nelle foglie del rampollino negli eteroinnesti, al contrario, nelle foglie del portinnesti, 31 e 12 microRNA erano rispettivamente su e giù regolati. Negli omoinnesti anguria-anguria, rispettivamente 64 e 83 microRNA erano regolati verso l'alto e verso il basso. Ciò dimostrò che l'eteroinnesto causò una profonda riprogrammazione delle espressioni di microRNA.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare le dimensioni relative e l'età del gambo della figlia e il rampollino è fondamentale per fare un innesto di successo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento dell'lncRNA, la profilazione proteomica al fine di indagare la regolazione dell'lncRNA e della proteina e il sistema di codifica nel sistema di innesto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della tolleranza abiotica vegetale per esplorare il meccanismo del vantaggio di innesto delle piante nelle Cucurbitaceae e oltre.Non dimenticare che lavorare con cloridrato di guanidina può essere estremamente pericoloso e si dovrebbero sempre prendere precauzioni appropriate con l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Environment

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

Un protocollo per Condurre Pioggia di simulazione per studiare deflusso del suolo

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

Ricerca

Ambiente

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

L&#39;uso di ad alta risoluzione termografia a infrarossi (HRIT) per lo studio di ghiaccio nucleazione del ghiaccio e propagazione nelle piante

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protocollo per microplastiche campionamento sulla superficie del mare e Analisi dei campioni

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Estrazione di pesticidi di organochlorato da pellicole di plastica e analisi di tipo plastico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Installazione colonna sperimentale per lo studio anaerobici biogeochimici interazioni tra batteri, oligoelementi e idrossidi di ferro (ossi)

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Studio sperimentale della relazione tra la dimensione delle particelle e la capacità di adsorbimento di metano in scisto

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Scelta e analisi biologiche No-scelta per studiare l'impupamento preferenza e il successo di emersione di Ectropis grisescens

Many insects live above the ground as larvae and adults and as pupate below the ground. Compared to the above-ground stages of their life cycles, less ...