Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31772191), o projeto de pesquisa para o interesse público na província de Zhejiang (2017C 32027), a chave de ciência projeto de melhoramento de plantas em Zhejiang (2016C 02051) e o programa nacional de o apoio de top-notch jovens profissionais (para lojas).

1. esterilização e germinação de sementes
<ol><li>Para a esterilização de superfície, mergulhe as sementes de cabaça num copo de 500 mL com água a 58 ° C, com agitação ocasional, até que a temperatura da água cai para 40 ° C.</li>
	<li>Enquanto isso, coloque 3 kg de solo de turfa em um saco de nylon e, para esterilizar, autoclave em 120 ° C/0.5 MPa por 20 min.</li>
	<li>Continue a embeber as sementes de cabaça para 4-5 h mais com nenhuma agitação.<ol>
<li>Uma vez que a água atinge a temperatura ambi...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos em detalhe um método altamente eficiente e reprodutível para tornar homo e heterografts entre melancia e cabaça. Esse método, que exige nenhum equipamento específico, é muito fácil de operar e normalmente tem uma taxa de sobrevivência muito alta de enxertia. O método também pode ser usado para fazer enxertos para outras abóboras, tais como entre melancia, pepino e abóbora.
É interessante notar que o tamanho relativo (idade) do porta-enxerto e descenden...

Enxertia tempo foi empregado como uma técnica agrícola para melhorar a produção agrícola e tolerância a estresses bióticos e abióticos1,2,3. Em sistemas de heterografting, porta-enxertos elite podem aumentar a absorção de água e nutrientes das plantas, reforçar a resistência a patógenos de solo e limitar os efeitos negativos da toxicidade do metal4,5, que podem conferir os enxertos uma reforçada vigor de crescimento e maior tolerância a estresses ambientais. Em muitos casos, heterografting também pode afetar as qualidades de frutos em plantas hortícolas, levando ao sabor da fruta melhorada e maior conteúdo de compostos relacionados com a saúde6,7. Verificou-se que a transferência de longa distância de fitohormônios, RNAs, peptídeos e proteínas entre o porta-enxerto e o scion é um mecanismo fundamental de modulação do crescimento e desenvolvimento reprogramação de scion plantas8,9 ,10. Enxertia tem sido amplamente utilizada em estudos de longa distância de sinalização e transporte em relação à adaptação ambiental11. Experimentos de enxerto são especialmente poderosos para a deteção inequívoca de moléculas transmitidas em tecido ou seiva vascular e ativação ou supressão de alvos moleculares devido ao sinal de transmissão12a receber.
RNAs não-codificantes, uma grande classe de RNA que exercem funções reguladoras importantes nas células, têm sido relatados para desempenhar um papel em facilitar a adaptação da planta ao estresse abiótico13. os miRNAs são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt. estudos revelaram o papel regulador dos miRNAs em vários aspectos das atividades da planta, tais como atirar em crescimento, lateral raiz formação14,15,16, absorção de nutrientes, metabolismo de sulfato e homeostase17e respostas bióticos e abióticos stress18. Recentemente, a expressão de miRNAs e seus genes-alvo foram relacionados com tolerância de estresse em mudas de pepino heterografted19de sal. Nos enxertos intervariety de uva, as respostas de miRNA expressão ao estresse de seca foram encontradas para ser dependente do genótipo20.
O desenvolvimento rápido e diminuindo o custo da tecnologia de sequenciamento do elevado-throughput forneceram uma grande oportunidade para o estudo dos regulamentos de miRNA em plantas agrárias. Melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), uma colheita importante Cucurbitácea crescido em todo o mundo, é suscetível a baixas temperaturas. Cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec.) é uma Cucurbitácea mais clima-resistente comumente usada pelos agricultores para enxertar com melancia. O objetivo principal do estudo atual é estabelecer um padrão, eficiente e um método conveniente para fazer heterografts entre melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec). Este protocolo também fornece um esquema experimental detalhado e procedimentos analíticos para o estudo do Regulamento de miRNA expressões após a enxertia, que é útil para revelar os mecanismos subjacentes vantagens heterografting.
Os materiais de planta utilizados neste estudo incluem a cultivar de melancia e a cabaça landrace. Cultivar de melancia é um cultivar comercial com alto rendimento, mas suscetível a baixas temperaturas. Cabaça landrace é um popular porta-enxertos para enxertia com melancia, pepino e cabaça, devido à sua excelente tolerância de temperaturas baixas21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

MicroRNAs (miRNAs) são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt, conhecida por desempenhar um papel importante no desenvolvimento da planta e adaptação. Há uma acumular evidências mostrando que as expressões de determinados miRNAs são alteradas quando o enxerto, uma prática agrícola comumente utilizada pelos agricultores para melhorar a tolerância das culturas a estresses bióticos e abióticos. Cabaça é uma colheita inerentemente resistentes às alterações climáticas, em comparação com muitos outras abóboras grandes, incluindo melancia, tornando-o um dos porta-enxertos mais utilizados para o último. O recente avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento tem proporcionado grandes oportunidades para investigar os miRNAs frio-responsivo e suas contribuições para vantagens heterotópico; ainda, os procedimentos experimentais adequados são um pré-requisito para esta finalidade. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração eficiente de homo e heterografts entre o frio-suscetíveis de melancia e a cabaça tolerante ao frio, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados. Os métodos apresentados são também úteis para outros sistemas de planta-enxerto, para interrogar miRNA regulamentos sob vários estresses ambientais, tais como calor, seca e salinidade.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figura 2: fenótipos de vários enxertos em temperatura ambiente e condições de frio-salientou. (um) este painel mostra homo e heterografted mudas à temperatura ambiente como o controle. (b) este painel mostra homo e heterografted mudas após 48 h de tratamento pelo frio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_...

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Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para eficientemente tornando homo - e heterografts entre melancia e cabaça, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados, para a investigação de microRNAs frio-responsivo.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na resposta do miRNA à capacidade de estressar em enxertos vegetais, como como o miRNA é regulado sob estresse frio em enxertos de cabaça de garrafa de melancia. A principal vantagem dessa técnica é que é um método altamente eficiente e reprodutível para fazer homo e heteroenxertos. Não requer nenhum equipamento específico, é muito fácil de executar, e normalmente resulta em uma taxa de sobrevivência muito alta de enxerto.Através deste método, pode fornecer insights sobre a resposta do miRNA ao estresse frio no sistema de enxerto de cabaça de garrafa de melancia. Também pode ser aplicado a outros organismos modernos para revelar os mecanismos do transporte miRNA local e de longa distância. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de enxerto são difíceis de aprender.Esta etapa exigiu habilidades avançadas e são fundamentais para a sobrevivência das plantas enxertadas. Para começar, mergulhe as sementes de cabaça de garrafa em um béquer de 500 mililitros de 58 graus Celsius de água. Mexa as sementes ocasionalmente até que a temperatura da água caia para 40 graus Celsius.Enquanto a água esfria, coloque três quilos de solo de turfa em um saco de nylon e autoclave-o. Uma vez que a água atinja a temperatura ambiente, enxágue as sementes duas a três vezes em água destilada e drene o excesso de água. Deixe as sementes brotarem em um saco de gaze a 28 graus Celsius na câmara de crescimento escuro.Após a germinação, semeie as sementes em potes plásticos cheios de solo de turfa esterilizado. Quando as mudas de abóbora de garrafa desenvolverem dois cotilledons achatados, repita este processo com sementes de melancia. Cultivar a cabaça de garrafa e as mudas de melancia em uma câmara de crescimento.Adicione água às mudas uma vez por dia à tarde. Em seguida, corte os hipocotyls das mudas de melancia de dois a três centímetros abaixo dos cotilos. Corte a parte superior das mudas de cabaça da garrafa ao lado, imediatamente acima dos cotilledons.Em seguida, use um palito para fazer um buraco no topo das mudas de cabaça de garrafa aparadas. Insira as mudas de melancia aparadas no orifício para fazer heteroenxertos. Depois disso, prepare os homoenerxes usando o método descrito anteriormente.Primeiro, enrole as mudas enxertadas em sacos transparentes de polietileno para manter uma umidade relativamente alta. Em seguida, mantenha as mudas embrulhadas em uma câmara de crescimento por sete dias. Após o sétimo dia, retire os sacos e permita que as plantas cresçam sob as mesmas condições por sete a dez dias.Divida as mudas em dois grupos, um para tratamentos frios e outro para controle. Devolva as mudas de controle para as mesmas condições ambientais. Coloque as mudas tratadas a frio em uma câmara de crescimento fixada em seis graus Celsius com as mesmas condições escuras claras do grupo controle.Após 48 horas, deixe as amostras do descendente e das raízes dos enxertos. Congele as amostras imediatamente em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 70 graus Celsius. Transfira a amostra congelada para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros em nitrogênio líquido.Adicione uma conta de aço inoxidável a cada tubo de amostra e homogeneize os tecidos em um pó fino. Para cada combinação de enxerto, pegue quantidades iguais de amostra de terra de 10 mudas e misture-as em um tubo de centrífuga de 10 mililitros. Adicione uma quantidade apropriada de reagente de cloridrato de guanidium.Em seguida, adicione DNase sem RNA de um a 150 unidades por mililitro a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, determine a quantidade total de RNA em um sistema de eletroforese microcapilal. Depois disso, descongele os reagentes e adaptadores de normalização da biblioteca.Em seguida, ligate pequeno RNase com os cinco principais e três adaptadores prime, e elute e purificá-los. Transcreva invertida o RNase pequeno de cinco primes e três prime ligado seguindo as diretrizes do fabricante. Em seguida, execute a amplificação do PCR seguindo o protocolo do fabricante.Em seguida, use o sistema de eletroforese microcaillary para garantir que o número de integridade do RNA seja maior que sete. Carregue um microliter de uma biblioteca de RNA no sistema de eletroforese microcapilal para garantir que o número de integridade do RNA seja maior que sete. Finalmente, sequencie as pequenas bibliotecas de RNA em um instrumento de sequenciamento de alto rendimento.Por meio deste protocolo, obteve-se uma taxa de sobrevivência de 98% para enxerto e os fenótipos para temperatura ambiente e condições de estresse frio. sRNAs de 24 nucleotídeos compõem a maior classe de sRNAs em todas as combinações de enxerto, independentemente do tratamento de temperatura. Após 48 horas de tratamento frio, 30 e 268 microRNAs foram reguladas para cima e para baixo, respectivamente.Nas folhas do descendente em heteroenxertos, inversamente, nas folhas do rootstock, 31 e 12 microRNAs foram para cima e para baixo regulados, respectivamente. Nos homoenerxertos de melancia-melancia, 64 e 83 microRNAs foram regulados para cima e para baixo, respectivamente. Isso demonstrou que o heteroenxerto causou uma reprogramação profunda das expressões do microRNA.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar o tamanho relativo e a idade do talo da filha e o descendente é fundamental para fazer um enxerto bem sucedido. Após esse procedimento, outros métodos como o sequenciamento do LNCRNA, o perfil proteômico podem ser realizados a fim de investigar a regulação do LNCRNA e da proteína e do sistema de codificação no sistema de enxerto. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a pesquisa no campo da tolerância abiótica vegetal para explorar o mecanismo de vantagem de enxerto vegetal em Cucurbitaceae e além.Não se esqueça que trabalhar com cloridrato de guanidina pode ser extremamente perigoso e a precaução apropriada deve ser sempre tomada com a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Environment

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

Um protocolo para Realização Chuvas Simulação para o Estudo de Escoamento do Solo

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

Ambiente

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protocolo para Microplásticos Amostragem na superfície do mar e análise de amostras

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extração de Pesticidas Organoclorados de Pelotização de Plástico e Análise de Tipo de Plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Instalação de coluna experimental para estudar anaeróbicas biogeoquímicas interações entre bactérias, oligoelementos e hidróxidos de ferro (oxi)

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Estudo experimental da relação entre o tamanho de partícula e capacidade de adsorção de metano em xisto

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Colheita de toxinas de veneno de barbeiros e outros insetos Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Escolha e bioensaios não-escolha para estudar a preferência de pupa e sucesso de surgimento de Ectropis grisescens

Many insects live above the ground as larvae and adults and as pupate below the ground. Compared to the above-ground stages of their life cycles, less ...