Name: arbovirus infections as screening tools for the identification of viral immunomodulators and host antiviral factors
Uploaded: 2018-09-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors at JoVE.com

D.G. wurde unterstützt durch die Finanzierung von der University of Texas Southwestern Medical Center ausgestattet Scholars Program. Die Autoren danken Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) und Sean Whelan (Harvard Medical School) für die Bereitstellung von VSV-DsRed und VSV-LUC. Die Autoren danken auch Gary Luker (University of Michigan Medical School) für die freundlichen Gabe des VACV-FL-GFP-Stamm.

1. allgemeine Lymantria Dispar (LD652) Zelle und Virus-Kultur
<ol><li>
LD652 Zelle kultiviert und Beschichtung
	<ol>
<li>Zur Kultur L. Dispar-abgeleitete LD652 Zellen, pflegen eine Monolage von Zellen in einem Wachstumsmedium (Table of Materials) bei 27 ° C unter normaler Atmosphäre inkubiert. Zellen in 10 cm Gewebe-Kultur-behandelten Gerichte zu erhalten und die Zellen beim erreichen von 80 % Konfluenz passage.</li>
		<li>Platte, adhärente Zellen der LD65...

<ol>
	<li>Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+tropism.">Viral tropism.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).</li><li>Werden, S. J., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+signaling+in+poxvirus+tropism:+the+case+of+the+M-T5+host+range+protein+of+myxoma+virus.">The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).</li><li>McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. 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(87), e51522 (2014).</li><li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptome+of+the+Asian+gypsy+moth+Lymantria+dispar+identifies+numerous+transcripts+associated+with+insecticide+resistance.">Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).</li><li>Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth,+Manduca+sexta.">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li><li>Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+chikungunya+and+dengue:+the+causes+and+threats+of+new+and+re-emerging+arboviral+diseases.">Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases.</a> BMJ Global Health. 3, (2018).</li></ol>

Hier haben wir beschrieben, einfache Fluoreszenz und Lumineszenz-basierende Assays für die Bedingungen auf den Bildschirm, das VSV-Replikation in restriktiven Lepidoptera Zellkulturen zu retten. Die abortive Infektion des VSV in Lepidoptera Zellen erstellt ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis beim VSV Genexpression zu prüfen. Zum Beispiel die LU-Signale in Lysaten aus einzelnen VSV-LUC Infektionen erkannt wurden ~ 1,000-fold höher als im Mock-infizierten Lysates, doch diese Signale nur etwa zweifach über ein...

Die Fähigkeit eines Virus, produktiv in einem bestimmten Host replizieren wird teilweise durch die Verfügbarkeit von Host Cell Faktoren geregelt, die virale Eintrag und Replikation1unterstützen. Virus-Wirtsspektrums kann auch durch die Kapazität eines Virus zu zellulären antiviralen Abwehr Zähler diktiert werden, die virale Replikation2,3sonst behindern würde. Es ist das Ergebnis dieser komplexen Virus-Wirt Interaktionen, die letztlich entscheiden, ob ein Virus in der Lage, seinen Lebenszyklus in einem bestimmten Host zu vervollständigen. Angesichts der potenziell pathogenen Folgen für den Host, wenn virale Replikation erfolgt, ist es wichtig, um unser Verständnis der wichtigsten Virus-Wirt Interaktionen zu fördern, das Zünglein an der Waage zwischen erfolglosen und produktive können experimentelle Strategien zu entwickeln Infektionen. Aufklärung der molekularen Merkmale der Virus-Wirt Zusammenspiel werden maßgeblich an der Entwicklung neuer und alternativer antivirale therapeutischer Strategien.
Mit dem Aufkommen der RNA-Interferenz (RNAi)4,5 und Genom-editing-Tools (zB., CRISPR-Cas9, Zink-finger-Nukleasen, TALENs)6,7, geworden es experimentell möglich, Ändern der Ausdruck der zellulären Faktoren auf genomweite skaliert und erkunden Sie die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Virusreplikation. In der Tat, wurden zahlreiche RNAi und Genom-Bearbeitung-basierte Bildschirme in Wirbellosen und Wirbeltieren Host Zelltypen durchgeführt, die neue Facetten von Virus-Wirt Interaktionen8,9,10, enthüllt haben 11 , 12. diese Bildschirme beschäftigen in der Regel Viren Reporter, wie Glühwürmchen Luciferase (LUC) oder fluoreszierende Proteine kodieren (zB., GLP, DsRed), vorsehen, dass bequeme Mittel zur Bewertung der quantitativ virale Genexpression als einer Anzeige für die Virusreplikation9,12. Diese Strategie erlaubt Forschern, Host Faktoren zu identifizieren, die entweder zu fördern oder Virusreplikation antagonisieren ausweislich erhöht oder verringert, bzw., in virale Reporter9,12 Signale. Allerdings wurden in der überwiegenden Mehrheit der Fälle diese Bildschirme durchgeführt mit Viren, die gut angepasst, um den Host-Zelle-Typ sind, in denen sie untersucht werden. Während diese Strategie wichtig für das Verständnis der coevolutionary Beziehungen zwischen viraler Krankheitserreger und ihre natürlichen Wirte sein kann, stellt es grundsätzliche Bedenken in Bezug auf ihre Verwendung in Aufdeckung Host antiviralen Faktoren dar. In diesen Fällen eine Erweiterung in Virus Reporter signal auf RNAi Zuschlag gesucht wird oder die Inaktivierung eines zellulären Faktors, die normalerweise Virusreplikation behindert. Zuerst, wenn ein Virus bereits kräftig in der Wirtszelle untersucht unter Kontrolle Bedingungen zu replizieren, möglicherweise der dynamische Bereich des Bildschirms (d.h., die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Hintergrund und verbesserte virale Reporter Signale) beschränkt. Zweitens ist dieses Problem noch durch die Situationen verschärft, in denen das Virus ist gut angepasst an die Wirtszelle und effektiv bei der Bekämpfung von Host Verteidigung Bahnen, die auf dem Bildschirm abgezielt werden.
Aufgrund der oben genannten Bedenken hinsichtlich traditioneller Virus-Wirt-Interaktion screening-Verfahren entwickelten wir ein neues Paradigma für das Studium von Virus-Wirt Interaktionen, die natürlich abortiven Arboviren Infektionen in Lepidoptera Insektenzellen ausnutzen. Diese Strategie ergibt sich aus einer Beobachtung, dass die gut untersuchten menschlichen Arboviren, VSV, eine abortive Infektion in Zellen aus der Schwammspinner (L. dispar)13 erfährt. VSV ist natürlich durch Dipteren Insekten (z.B. Sandfliegen) an Säugetieren Hosts übertragen und wurde experimentell gezeigt, dass eine Vielzahl von Wirbellosen zu infizieren und Wirbeltiere Gastgeber in Zell-Kultur und in-Vivo-14. 11-kb negativen Sinn einsträngige RNA-Genom der VSV kodiert fünf Subgenomic mRNAs, die jeweils in Proteine übersetzt werden, aus denen das behüllte Virion besteht. Allerdings haben VSV reverse genetische Systeme für die Erstellung von Replikation zuständigen Stämme LUC oder fluoreszierende Proteine, zusätzlich zu den fünf natürlichen VSV gen Produkte15,16,17-Codierung erlaubt. Weil diese Reporter Proteine der VSV Virion nicht integriert sind, bieten sie eine bequeme Auslesen für VSV-gen-Expression, die Post-Eintrag auftritt. VSV-Stämme, die GFP oder LUC-Codierung verwenden, haben wir zuvor gezeigt, dass VSV Genexpression bei der Einreise von LD652 Zellen stark eingeschränkt ist, VSV-Titer nicht von 72 Stunden nach der Infektion (Hpi) erhöhen. Im Gegensatz dazu führt Coinfection LD652 Zellen mit VSV und der Säugetier-Poxvirus, Vaccinia Virus (VACV), zu logarithmischen VSV Genexpression und Titer von diesem Zeitpunkt. VACV erfährt frühen Genexpression, DNA-Replikation und späten Genexpression in LD652 Zelle Infektionen, aber der VACV Replikationszyklus ist letztlich gescheiterten aufgrund unvollständiger Virion Morphogenese18. Der große ~ 192-kb-DNA-Genom des VACV kodiert > 200 Proteine, von die viele immunmodulatorische Eigenschaften anzuzeigen, die virale Replikation durch die Unterdrückung der Host Immunantworten19zu fördern. Daher wir die Hypothese aufgestellt, die die "Rettung" der VSV-Replikation in LD652 Zellen durch VACV Coinfection wahrscheinlich durch VACV Immunmodulatoren vermittelt wurde, die L. Dispar Antworten normalerweise einschränken VSV Replikation gehemmt. Zur Unterstützung rettet die Behandlung von LD652 Zellen mit dem Host RNA Polymerase II Inhibitor Actinomycin D auch VSV Replikation in LD652 Zellen, die darauf hinweist, dass die Transkription-abhängigen Host Antworten VSV Replikation nach dem Eintrag13 Block.
Die obigen Beobachtungen legen nahe, dass die natürlich restriktive Charakter der LD652 Zellen, VSV-Infektion einen relativ niedrigen Hintergrund vorsehen, beim screening für die Bedingungen, die Reporter VSV-codierte Signale (d.h.diejenigen, die Host hemmen zu verstärken antiviralen Abwehr). Hier vermitteln wir die Methoden für die Verwendung von Fluoreszenz oder LUC basierende Assays zum Bildschirm für die Bedingungen, die VSV Einschränkung in Lepidoptera Zellen zu entlasten. Zunächst zeigen wir, wie diese Tests verwendet werden können, um Viral codierten immunmodulatorische Faktoren identifizieren, die VSV Einschränkung während der beiden Coinfection Experimente oder durch ektopische Expression von Kandidaten virale Faktoren zu brechen. Als Beispiel zeigen wir, wie wir diese Screening-Techniken verwendet, um Poxvirus-codierte A51R Proteine als eine neue Familie von immunmodulatorische Faktoren zu identifizieren, die VSV-Replikation in Abwesenheit von anderen Poxvirus Faktoren13zu retten. Zweitens zeigen wir, wie RNAi screening in restriktiven VSV-LD652 Zelle Infektionen verwendet werden kann, direkt Arboviren Einschränkung13eukaryotischen Host Faktoren identifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>C430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX-CELL 420</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Optima</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:1 mixture of Grace&#39;s Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Free Media (SFM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10902096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter lysis buffer 5X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-22383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-firefly luciferase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VSV M</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. John Connor (Boston University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VACV I3L</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. David Evans (University of Alberta)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chambered dish</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C12881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i-LIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v1.18</td>
			<td>cellSens software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5702 ventilated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Infrared Imaging System</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Odyssey Fc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD652 cells</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSC-40 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro transcription and purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arbovirus infections as screening tools for the identification of viral immunomodulators and host antiviral factors

RNA - Interferenz und Genom Bearbeitung-basierten screening-Plattformen haben weit verbreitet, Host Zelle Faktoren identifizieren, die Replikation des Virus zu beschränken. Jedoch sind diese Bildschirme in der Regel in Zellen durchgeführt, die natürlich permissive auf die virale Erreger untersucht werden. Daher kann die robuste Replikation von Viren bei Kontrolle den Dynamikbereich der beiden Bildschirme beschränken. Darüber hinaus können diese Bildschirme möglicherweise nicht zelluläre Abwehr Wege leicht zu identifizieren, die Replikation des Virus zu beschränken, wenn das Virus gut angepasst, um den Host und in der Lage, die Bekämpfung der antiviralen Abwehr ist. In diesem Artikel beschreiben wir ein neues Paradigma für die Erkundung von Virus-Wirt Interaktionen durch den Einsatz von Bildschirmen, die Mitte auf natürlich abortive Infektionen durch Arboviren z. B. vesikuläre Stomatitis Virus (VSV). Trotz der Möglichkeit des VSV, in einer Vielzahl von Dipteren Insekten und Säugetieren Hosts zu replizieren erfährt VSV eine Post-Eintrag, abortive Infektion in einer Vielzahl von Zelllinien aus Lepidoptera Insekten, wie z. B. der Schwammspinner (Lymantria dispar). Jedoch können diese abortiven VSV-Infektionen "gerettet werden" beim Wirt Zelle antiviralen Abwehr beeinträchtigt werden. Wir beschreiben, wie VSV Codierung bequem Reporter-Gene und restriktive L. Dispar Stämme Zelllinien können kombiniert werden, um Setup-Bildschirme, Host Faktoren beteiligt Arboviren Einschränkung zu identifizieren. Darüber hinaus zeigen wir auch die Nützlichkeit dieser Screening-Tools bei der Identifizierung von Viral codierten Faktoren, die VSV-Replikation während Coinfection oder durch ektopische Expression, einschließlich derer von Säugetieren Viren kodiert zu retten. Die natürliche Einschränkung der VSV-Replikation in L. Dispar Zellen bietet ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis beim screening für die Bedingungen, die Förderung der VSV Rettung, so dass die Verwendung von simpel Lumineszenz und Fluoreszenz-basierende Assays zu überwachen die Änderungen in der VSV-Replikation. Diese Methoden sind wertvoll für das Zusammenspiel zwischen Host antivirale Reaktionen und viral immune Evasion Faktoren zu verstehen.

Als ein Beispiel für live Cell imaging-Anwendungen VSV Rettung auf VACV Coinfection überwachen, LD652 Zellen waren überzogen in einem 8-Brunnen gekammerten und dann Mock-infizierten oder infizierte VSV-DsRed (MOI = 1) in das Vorhandensein oder Fehlen der VACV-FL-GLP (MOI = 25). Da VSV-DsRed DsRed als freie Protein drückt und nicht, VSV Strukturproteinen (Abbildung 1A fixiert wird), ist es nur erkannt, nachdem VSV-Eintrag und Gen-Ausdruck initiiert. Alle Z...

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Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

This method can help answer key questions in the field of viral immunology, such as, which host factors restrict arbovirus replication, and, in turn, which virus-encoded immune evasion proteins overcome these host restriction mechanisms. The main advantage of this technique is that it allows one to use simplistic luminescence and fluorescent space assays to define cellular conditions that allow for arboviruses to replicate in an otherwise abortive infection in lepidopteran insect cells. Because there's minimal background replication of arboviruses in lepidopteran cells, it becomes relatively straightforward for one to detect conditions that allow for arbovirus replication.To begin, maintain LD652 cells in 10 centimeter tissue culture-treated dishes, and passage the cells when they reach 80%confluency. Pipette media onto the cell monolayer repeatedly to dislodge the cells, then dilute the sample in growth media to an approximate density of 100 thousand cells per milliliter. After this, transfer one milliliter of the diluted culture to each well of a 24-well plate.Then, allow the cells to settle for at least one hour. 30 minutes prior to the infection, thaw stalks of VSV luciferase and vaccinia virus on ice. Then, dilute VSV luciferase with and without vaccinia virus into SFM, such that an MOI of 10 and 25, respectively, is achieved.Aspirate mature LD652 media carefully, to avoid disturbing the cell monolayer, and inoculate each well with 0.2 milliliters of virus. Next, add sterile SFM to additional wells to serve as mock-infected negative controls. Incubate the cells in inoculum for two hours at 27 degrees Celsius.Then, remove the inoculum via aspiration and replace it with one millimeter of LD652 growth media in each well. After this, allow the infection to proceed for 24 to 72 more hours. First, carefully aspirate the supernatant and add one milliliter of DPBS to each well.Using a syringe plunger, scrape the cells into DPBS. Then, transfer the cells to a micro-centrifuge tube and centrifuge for 20 minutes at 400 times gravity and four degrees Celsius. Meanwhile, dilute five times reporter lysis buffer in sterile water.After the centrifugation, aspirate the DPBS without disturbing the pellet. Next, re-suspend the pellet in 150 microliters of one times RLB. Then, incubate the sample at negative 80 degrees Celsius, followed by a rapid thaw in a room-temperature water bath.After this, store the lysates at negative 80 degrees Celsius for further analysis. Thaw the lysates on ice and pipette 20 microliters of lysate into the wells of a 96-well plate. Next, add 100 microliters of luciferase assay region to each well of the plate.Immediately, measure the light intensity using a lumenometer. Under single-infection conditions, LD652 cells restrict VSV luciferase replication. Thus, only a small luciferase signal is observed.Co-infection, however, results in significantly higher luciferase signals. Under single-infection conditions, LD652 cells also restrict VSV dsRED replication, thus only a small number of cells exhibit a dsRED signal. Co-infection with vaccinia virus, however, results in most cells displaying dsRED signals by the end of the time course.Approximately 2%of the cells from the single infections were dsRED positive by 65 hours post-infection. In contrast, approximately 77%of the co-infected cells were dsRED positive at the same time point. When attempting this procedure, it's important to remember to optimize the time points at which luciferase assays or live-cell imaging time points will be taken in order to allow enough time for VSV to replicate and produce a detectable signal.Following this procedure, other methods such as RNA interference-mediated knockdown of host factors, can be conducted in order to identify potential host antiviral factors restricting arbovirus replication. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of viral immunology to define the role of pox virus-encoded A51R proteins in promoting pox virus replication and pathogenesis. Don't forget that working with eukaryotic viruses can be extremely hazardous and it is important to take proper precautions, such as wearing personal protective equipment while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...