Name: humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOD/SCID/IL2rÃŽÂ³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [subvention numéros R01AI29329, R01AI42552 et R01HL07470 à J.J.R.] et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health [numéro de licence P30CA033572 pour soutenir la ville de Hope génomique intégrative Pharmacologie analytique et des noyaux de cytométrie analytique]. Le réactif suivant a été obtenu par le biais de la NIH recherche sur le sida et le programme des réactifs de référence, Division of AIDS, NIAID, NIH : virus HIV BaL.

Tous les soins des animaux et des procédures ont été réalisées selon les protocoles revus et approuvés par la ville de Hope institutionnels Animal Care et utilisation Comité (IACUC) détenu par le chercheur principal de cette étude (Dr John Rossi, 12034 # IACUC). Tissu du foie foetal humain provient d’Advanced Bioscience ressources (Alameda, CA), un organisme sans but lucratif, conformément à la réglementation fédérale et d’état. Le vendeur a son propre Institutional Review Board (IRB) et est conforme a...

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Des souris immunodéprimées greffés avec cellules/tissus humains présentent des caractéristiques physiologiques humanoïde et sont une valeur énorme pour les études de pathologie et physiopathologie, immunologie concernant les maladies spécifiques à l’homme. Parmi les nombreuses souches de souris immunodéficientes, le clin de œil. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji modèle (NSG) est la plus immunodéprimés en raison de son manque d’immunité innée et adaptative, ainsi que roussis cyt...

Parce que l’établissement approprié des modèles animaux de maladies humaines est essentielle pour trouver un remède, modèles animaux appropriés ont été longtemps poursuivis et améliorés au fil du temps. Plusieurs souches de modèles murins immunodéprimés ont été développés qui permettent la prise de la greffe de tissus et/ou de cellules humaines et de l’exécution ultérieure des fonctions humanisé1,2. Ces modèles de souris humanisée sont critiques pour les enquêtes sur les maladies humaines spécifiques3,4,5.
Syndrome d’immunodéficience acquise (sida) résultant de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un exemple. Avant la création de modèles murins humanisés, des limites éthiques et techniques confinée études animales précliniques de VIH/sida aux primates non humains3. Toutefois, les dépenses élevées et les exigences pour des soins spécialisés pour tel animal gênent études de VIH/sida dans les milieux universitaires typiques. Principalement, le VIH infecte les cellules humaines CD4 + T et impact sur le développement et les réactions immunitaires des autres cellules immunitaires humaines telles que les lymphocytes B, les macrophages et les cellules dendritiques6; C’est pourquoi, petits modèles animaux transplantés ayant un système immunitaire humain fonctionnel sont en forte demande.
Une percée est venue en 1988, quand CB17 -scid souris présentant une mutation Prkdcscid ont été conçus et ont montré une greffe réussie du système immunitaire humain1. Les résultats de mutation Prkdcscid dans les fonctions de cellules B et T défectueux et une ablation du système immunitaire adaptatif chez la souris, permettant ainsi la prise de greffe des périphériques humains de sang cellules mononucléaires (PBMC), les cellules souches hématopoïétiques (CSH), et les tissus hématopoïétiques foetaux7,8. Néanmoins, les faibles niveaux de prise de greffe sont fréquemment observées dans ce modèle ; les causes possibles sont 1) résiduelle activité du système immunitaire innée modulée par l’intermédiaire de tueuses naturelles (NK)-cellules et 2) le dernier stade de développement des souris (perméabilité) de lymphocytes T et B5. Le développement ultérieur de la non obèses diabétiques (Adi)-modèle de sourisscid atteint la régulation à la baisse spectaculaire de l’activité des cellules NK ; ainsi, il est capable de soutenir un niveau plus élevé et plus greffe durable du système immunitaire humain composants9. En plus d’autres suppriment ou entravent le développement de l’immunité innée, portant le total opercule de l’interleukine-2 récepteurs-chaîne γ (Il2rg) ou de troncature dans la (NOD) des modèles de souris -scid arrière-plan ont été établis. Il2rg, également connu sous le nom commun cytokine-receptor γ-chaîne, est un élément indispensable de diverses cytokines récepteurs10,11,12,13. Souches comme clin de œil. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) et NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) présentent des perturbations robuste de signalisation des cytokines de souris et une ablation complète du développement des cellules NK, dans Ajout d’une insuffisance sévère de l’immunité adaptative14,15,16.
Trois modèles de souris humanisée portant un scid , mutation et Il2rg knock-out sont fréquemment employés dans la recherche sur le VIH/sida : le modèle de BLT (moelle osseuse/foie/Thymus), le modèle PBL (leucocytes périphériques de sang) et le modèle SRC (cellule de repeuplement de SCID) 3. modèle le BLT est créé via transplantation chirurgicale du foie foetal humain et le thymus sous la capsule rénale de souris accompagné d’une injection intraveineuse de foetus foie autorenouveler3,17,18. Le modèle de souris BLT offre une efficacité élevée de greffe, développement de cellules hématopoïétiques humaines dans toutes les lignées et mise en place d’un système immunitaire fort ; en outre, les lymphocytes T sont instruits dans un thymus autologue humain et pièce restriction HLA des réponses immunitaires4,5,17,19. Toutefois, l’obligation pour les procédures chirurgicales reste l’inconvénient majeur du modèle BLT. Le modèle de souris PBL est établi par une injection intraveineuse avec des cellules lymphoïdes périphériques humaines. Le modèle PBL offre commodité et rendements greffe réussie de lymphocytes, mais son application est limitée en raison insuffisante de B-cellule et greffe de cellules myéloïdes, greffe faible niveaux globales et l’apparition de sévère greffon - versus - host disease (GVHD)3 ,,20. Le modèle de souris SRC s’établit par l’injection de csh humaine dans nouveau-né ou un jeunes adultes souris SCID. Il montre efficacité greffe moyen supérieur à 25 % (évalué comme sang périphérique CD45 pourcentage) et prend en charge le développement de multiple-lignée de csh injectée et l’élaboration d’un système immunitaire inné. Toutefois, la limitation du modèle SRC est que la réponse des lymphocytes est souris H2 restreints au lieu de restriction HLA humain14,21.
Le modèle de souris SRC est considéré comme un modèle fiable et facile pour le VIH/sida petits animaux des études précliniques, illustrée par la prise de greffe cohérente d’un système immunitaire et hématopoïétique mise au point. Précédemment, nous avons signalé la mise en place d’un modèle de souris de NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) et décrit son application dans la réplication du VIH et de la latence des études22,23,24. Ce modèle de souris de hu-NSG présente des niveaux élevés de domiciliation de la moelle osseuse, la susceptibilité à l’infection par le VIH et la récapitulation de l’infection par le VIH et la pathogenèse. En outre, le modèle de souris de hu-NSG réagit de façon appropriée à une thérapie antirétrovirale combinatoire (charrette) et récapitule le rebond viral plasmatique après le retrait de chariot, confirmant la mise en place d’un VIH latence réservoir25,26 ,,27. Ce réservoir de latence du VIH est étayé par la production d’aptes à la réplication du VIH virus ex vivo induite par l’homme au repos CD4 + T-cellules isolées de souris infectés et traités panier hu-NSG.
Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé pour la mise en place du modèle souris hu-NSG de souris néonatales de soins infirmiers, y compris les procédures relies au traitement du VIH infection et panier pour le développement de la latence. Nous espérons que ce protocole d’offrir un nouvel ensemble d’approches dans les études sur des animaux concernant le VIH virologie, latence et traitement du VIH.

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		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td>MiltenyiBiotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Order breeders instead of experimental mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-806-3204</td>
			<td>Order through animal facility, restricted item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clidox disinfectant</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>NC9189926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wescodyne</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>19-818-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80508 syringe/needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80508</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (K2EDTA)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>367843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (Heparin)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube (Heparinized)</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>22-362574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4444434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from mouse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5381-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564586</td>
			<td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557851</td>
			<td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558116</td>
			<td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563795</td>
			<td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1427</td>
			<td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1904</td>
			<td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies

Règlements éthiques et les défis techniques de recherche en pathologie humaine, immunologie et développement thérapeutique ont mis des petits modèles animaux en forte demande. Avec une étroite ressemblance génétique et comportementale pour les humains, petits animaux tels que la souris sont de bons candidats pour les modèles de maladies humaines, à travers lequel les réponses et l’homme-comme des symptômes peuvent être récapitulées. En outre, le bagage génétique de la souris peut être modifié pour tenir compte des demandes diverses. La sourisnull (NSG) de NOD/SCID/IL2rγ est une des souches de souris immunodéprimées plus largement utilisé ; Il permet la greffe avec des cellules souches hématopoïétiques humaines et/ou des tissus humains et le développement ultérieur du système immunitaire humain fonctionnel. Il s’agit d’un jalon essentiel dans la compréhension le pronostic et la physiopathologie des maladies humaines spécifiques telles que le VIH/sida et d’aider à la recherche d’un remède. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant de générer un modèle de souris humanisé NSG (hu-NSG) par transplantation de cellules souches hématopoïétiques dans une souris NSG néonatale conditionné par rayonnement. Le modèle murin de hu-NSG montre le développement de lignées multiples des cellules souches humaines transplantées et de susceptibilité à l’infection virale du VIH-1. Il récapitule aussi des caractéristiques biologiques clés en réponse à un traitement antirétroviral combinatoire (cART).

Analyse en cytométrie en flux est souvent effectué pour valider la pureté du CSH isolé, évaluer les niveaux de prise de greffe, le profil des réponses immunitaires aux infections virales et efficacité de chariot de l’enquête. Un panel d’anticorps typique contient des anticorps fluorescent étiquetés individuelles 4-6 ; ainsi, un cytomètre en flux avec plusieurs lasers et un large choix de filtres est crucial pour parvenir à des résultats précis.
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Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Ces questions peuvent aider à répondre aux questions clés de la recherche sur le VIH/sida, telles que le mécanisme moléculaire et le pronostic de l’infection par le VIH, et comment et où le réservoir de latence est établi. L’avantage de cette technique est qu’elle n’est pas invasive et qu’elle a établi une souris hu-NSG qui doit traiter un développement multi-lignée sur les cellules souches humaines transplantées qui sont sensibles à l’infection par le VIH et qui sont réceptives à la multithérapie. Commencez par filtrer un échantillon digéré, humain, fœtal, hépatique, slurry à travers un stérile, 70 micromètres, nylon, passoire à mailles pour obtenir une suspension à cellule unique, et enrichir pour CD34 + HSCs par tri cellulaire magnétique activé selon les instructions du fabricant.Après dépouillement, suspendre à nouveau le HSC à une concentration de deux fois dix à sept cellules viables par millilitre de concentration en DPBS frais sur la glace. Placez ensuite un NOD humain néonatal entier/SCID/gamma ou une litière de souris NSG dans une cage stérile, en forme de tarte, irradiation, et traitez les animaux avec 200 à 250 centigrades de rayons gamma provenant d’une source de rayonnement césium-137. Chargez ensuite les cellules dans une seringue Hamilton 80508 de 50 microlitres sur mesure, munie d’une aiguille de calibre 30, et injectez chaque animal néonatal directement dans le foie avec cinq fois dix à cinq CD34+HSC humains viables et 25 microlitres de DPBS.Dix à douze semaines après l’infection, faites tourner des échantillons de sang rétroorbitaux, périphériques et sanguins de chaque souris par centrifugation, et transférez les supernés plasmatiques dans des tubes de microcentrifugeuse pour un stockage négatif de 80 degrés Celsius, le cas à titre expérimental. Pour la validation de l’engraftment HSC, suspendez les granulés avec 200 microlitres de tampon de lyse de globule rouge, et tirez les suspensions cellulaires dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millimètre pour une incubation de dix minutes à température ambiante. Puis recueillir les globules blancs restants par centrifugation pour deux lavages dans 0,5 millilitres de frais, 0,01 pour cent albumine de sérum bovin, ou BSA, en DPBS par lavage.Après le deuxième lavage, bloquer les cellules avec 100 microlitres de cocktail bloquant pendant vingt minutes à 4 degrés Celsius suivie de l’étiquetage avec le cocktail anticorps approprié d’intérêt à un 2 microlitres d’anticorps par concentration de cellules une fois une à la sixième. Après 30 minutes à 4 degrés Celsius, lavez les cellules deux fois dans le DPBS frais plus BSA, et évaluez les échantillons périphériques de sang par cytométrie de flux selon les protocoles standard pour quantifier le pourcentage de CD45+CD3+CD14+ou CD19+cellules humaines par échantillon. Calculez ensuite le rapport entre les cellules CD4+/CD8+T, et évaluez la charge virale avec dans les échantillons de plasma selon les protocoles standard, quantitatif, reverse transcriptase, PCR.Pour évaluer les effets de l’infection par le VIH, livrer le virus des balles de VIH aux souris anesthésiées, humaines, NSG ayant une population humaine de plus de 20 % de cellules CD45+cell dans leur sang périphérique, à un taux de 200 nanogrammes de P24 par souris par administration intraperitoneal, recueillant des échantillons de sang par saignement rétroorbital toutes les deux semaines, et analysant à la fois le rapport CD4-CD8 et la charge virale plasmatique , comme démontré. Pour la validation de suppression virale fournir aux animaux infectés, humains NSG avec frais, combinatoire, thérapie antirétrovirale, ou cART, dans l’eau sucrée chaque semaine pendant 4 semaines, la collecte d’échantillons de sang via des saignements rétro-orbitaux toutes les deux semaines et d’analyser à la fois le rapport CD4-/CD8 et la charge virale plasmatique comme démontré. Pour évaluer le rebond viral lorsque les charges virales plasmatiques sont inférieures à la limite de détection et le rapport CD4-CD8 est restauré entre 1,5 et 2,5 recueillir des échantillons de sang périphériques par le biais de saignements rétro-orbitaux toutes les 2 semaines après le retrait cART et d’évaluer les échantillons tels qu’ils ont été démontrés.Au cours de la validation initiale de l’engraftment, le nombre humain de cellules CD45+devrait varier de 20 à 80 pour cent, et les sous-ensembles de leucocytes humains devraient apparaître comme des populations discrètes par analyse cytométrique de flux. Le rapport entre cd4+/CD8+cells reste entre 1,5 et 2,5 chez les personnes en bonne santé tandis que l’épuisement significatif des cellules CD4+T est généralement observé lors de l’infection virale. Notamment, le rapport sain est rétabli en réponse au traitement cART.La détection des charges virales plasmatiques par RT PCR quantitatif tout au long de l’infection et du régime cART peut être tracée et utilisée pour évaluer l’efficacité de la livraison virale et le traitement antiviral, respectivement. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des études de virologie du VIH/sida et du développement thérapeutique, elle peut également être appliquée à d’autres études liées aux maladies humaines, telles que le cancer, le diabète et les maladies auto-immunes. Le développement du modèle de souris hu-NSG a ouvert la voie à des chercheurs en immunologie et en oncologie pour explorer un nouveau dysfonctionnement et pathologie chez l’homme, en particulier des études mécanistes et thérapeutiques ciblant l’infection chronique par le VIH et le réservoir de latence.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Recherche

Immunologie et infection

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise croissance de la concurrence analyse pour déterminer la condition physique réplication du virus de l&#39;immunodéficience humaines

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

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Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

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Mesure de<em&gt; In vitro</em&gt; Activité d&#39;intégration du VIH-1 préintégration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Création du modèle de souris TK-NOG humanisé double pour la pathogénie du foie associée au VIH

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...