Name: humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOD/SCID/IL2rÃŽÂ³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [sovvenzione numeri R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 J.J.R] e National Cancer Institute, del National Institutes of Health [concessione numero P30CA033572 per sostenere la città della speranza Integrative Genomics Farmacologia analitica e analisi Cytometry core]. Il reagente seguente è stato ottenuto attraverso la ricerca sull'AIDS NIH e riferimento reagente programma, divisione di AIDS, NIAID, NIH: virus HIV BaL.

Tutti cura degli animali e le procedure sono state eseguite secondo protocolli esaminati e approvati dalla città della speranza istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) tenuto dal ricercatore principale di questo studio (Dr. John Rossi, IACUC n. 12034). Tessuto epatico fetale umano è stato ottenuto da Advanced Bioscience risorse (Alameda, CA), un'organizzazione senza scopo di lucro, in conformità alle norme federali e statali. Il fornitore ha la propria Institutional Review Board (IRB) ed è conforme ai req...

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Topi immunocompromessi innestati con cellule/tessuti umani presentano caratteristiche fisiologiche simili all'uomo e un enorme valore per gli studi di patologia, fisiopatologia e immunologia relative alle malattie umane specifiche. Tra più ceppi di topi immunocompromessi, il cenno del capo. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modello è il più immunodeficiente a causa della sua mancanza di sia innata che adattativa, nonché ablato specifici del mouse cytokine signaling3</sup...

Perché stabilire idonei modelli animali di malattie umane è la chiave per trovare una cura, modelli animali appropriati sono stati a lungo perseguiti e migliorati nel tempo. Più ceppi di modelli murini immunocompromessi sono stati sviluppati che permettono l'attecchimento di cellule umane e/o tessuti e la successiva esecuzione di funzioni umanizzato1,2. Tali modelli umanizzato del topo sono fondamentali per le indagini di malattie umane specifiche3,4,5.
Sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) derivando dall'infezione con il virus di immunodeficenza umana (HIV) è un esempio. Prima della creazione di modelli murini umanizzati, limitazioni etiche e tecniche confinati gli studi sugli animali preclinici di HIV/AIDS a primati non umani3. Tuttavia, le alte spese e requisiti per cure specialistiche per tale animale ostacolano gli studi di HIV/AIDS nel tipici ambiente accademico. HIV soprattutto infetta CD4 + T-cellule umane e impatta lo sviluppo e le risposte immunitarie di altre cellule immuni umane quali linfociti B, macrofagi e cellule dendritiche6; di conseguenza, piccoli modelli animali trapiantati con funzionale del sistema immunitario umani sono in forte domanda.
Una svolta è arrivata nel 1988, quando CB17 -scid topi con una mutazione di Prkdcscid sono stati sviluppati e ha mostrati il riuscito engraftment del sistema immunitario umano1. I risultati di mutazione Prkdcscid nelle funzioni a cellula T e B difettosa e un sistema immunitario adattativo ablato in topi, consentendo l'attecchimento del periferico umano cellule mononucleari (PBMCs), cellule staminali ematopoietiche (HSCs), del sangue e tessuti ematopoietici fetali7,8. Ciò nonostante, i bassi livelli di attecchimento sono osservati frequentemente in questo modello; le cause possibili sono 1) residua attività immunitaria innata modulata tramite natural killer (NK)-cellule e 2) il fase avanzata di sviluppo del mouse T - e B-cellule (permeabilità)5. Lo sviluppo successivo dei diabetici non obesi (NOD)-modello del toposcid raggiunto drammatico giù-regolamento dell'attività delle cellule NK; così, è in grado di supportare un livello superiore e attecchimento più sostenibile del sistema immunitario umano componenti9. Ad ulteriori sopprimere o ostacolare lo sviluppo dell'immunità innata, modelli di mouse tenendo troncamento o KO totale della interleuchina 2 recettore γ-catena (Il2rg) (NOD) - sfondo discid sono stati stabiliti. Il2rg, noto anche come comune citochina-recettore γ-catena, è una componente indispensabile di varie citochine recettori10,11,12,13. Ceppi come cenno del capo. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentare robusta rottura del mouse cytokine signaling e ablazione completa dello sviluppo della NK-cellula, in oltre a grave compromissione della risposta immunitaria adattativa14,15,16.
Tre modelli di mouse umanizzato recanti un scid mutazione e Il2rg knockout sono frequentemente impiegati nella ricerca sull'HIV/AIDS: il modello di BLT (midollo osseo/fegato/timo), il modello PBL (leucociti di sangue periferico) e il modello SRC (SCID Repopulating cella) 3. the BLT modello viene creato tramite il trapianto chirurgico del fegato fetale umano e timo sotto la capsula del rene del mouse accompagnato con l'iniezione endovenosa del fegato fetale HSCs3,17,18. Modello del topo BLT offre engraftment alta efficacia, sviluppo delle cellule ematopoietiche umane in tutte le stirpi e istituzione di un forte sistema immunitario umano; Inoltre, le cellule T sono istruite in un timo umano autologo e mostrano HLA-restricted risposte immunitarie4,5,17,19. Tuttavia, il requisito per le procedure chirurgiche rimane il principale svantaggio del modello BLT. Modello del topo PBL è stabilito tramite l'iniezione endovenosa con cellule linfoidi periferiche umane. Il modello PBL offre convenienza e produce riuscito engraftment delle cellule T, ma la sua applicazione è limitata a causa della insufficiente della B-cellula ed engraftment delle cellule mieloidi, attecchimento basso livelli complessivi e l'insorgenza della malattia di grave dell'innesto - contro - ospite (GVHD)3 ,20. Modello del topo SRC viene stabilito tramite iniezione di HSCs umano nel neonato o giovani adulti topi SCID. Si esibisce engraftment media efficienza superiori al 25% (valutato come sangue periferico CD45 percentuale) e supporta lo sviluppo di multiplo-stirpe di HSCs iniettato e l'elaborazione di un sistema immunitario umano innato. Tuttavia, la limitazione del modello SRC è che la risposta a cellula T è mouse H2-limitati invece umani HLA-restricted14,21.
Modello del topo SRC è considerato un modello affidabile e facile per l'HIV/AIDS piccolo animali studi preclinici, esemplificato dal engraftment coerenza di un sistema immunitario umano e positivo sviluppo ematopoietico. Precedentemente abbiamo segnalato l'istituzione di un modello murino di NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descritto la sua applicazione nella replicazione dell'HIV e latenza studi22,23,24. Questo modello del topo di hu-NSG presenta alti livelli di homing di midollo osseo, suscettibilità all'infezione da HIV e ricapitolazione dell'infezione da HIV e patogenesi. Inoltre, il modello del mouse di hu-NSG risponde in modo appropriato alla terapia antiretrovirale combinatoria (carrello) e ricapitola il rebound virale del plasma al momento del ritiro del carrello, confermando l'istituzione di un HIV latenza serbatoio25,26 ,27. Questo serbatoio di latenza di HIV è suffragato dalla produzione di replica-competente di virus HIV ex vivo indotta da umani CD4 + T-cellule isolate da topi infetti e carrello-trattati hu-NSG di riposo.
Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per l'istituzione del modello del topo di hu-NSG dai topi NSG neonatali, incluse le procedure relazionate al trattamento dell'HIV infezione e carrello per lo sviluppo di latenza. Ci aspettiamo che questo protocollo per offrire una nuova serie di approcci in studi su animali per quanto riguarda l'HIV virologia, latenza e trattamento HIV.

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			<td>CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td>MiltenyiBiotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Order breeders instead of experimental mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-806-3204</td>
			<td>Order through animal facility, restricted item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clidox disinfectant</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>NC9189926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wescodyne</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>19-818-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80508 syringe/needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80508</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (K2EDTA)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>367843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (Heparin)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube (Heparinized)</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>22-362574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4444434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from mouse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5381-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564586</td>
			<td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557851</td>
			<td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558116</td>
			<td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563795</td>
			<td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1427</td>
			<td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1904</td>
			<td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies

Norme etiche e sfide tecniche per la ricerca in patologia umana, immunologia e sviluppo terapeutico sono collocati piccoli modelli animali in forte domanda. Con una stretta somiglianza genetica e comportamentale agli esseri umani, piccoli animali come il mouse sono buoni candidati per i modelli di malattia umana, attraverso il quale possono essere ricapitolate le risposte e umano-come i sintomi. Ulteriormente, il background genetico del mouse possa essere modificato per soddisfare le diverse esigenze. Il mouse NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) è uno dei più utilizzati ceppi di topo immunocompromessi; Esso consente di attecchimento con cellule staminali ematopoietiche umane e/o tessuti umani e lo sviluppo successivo di un funzionale sistema immunitario umano. Questo è un traguardo fondamentale nella comprensione della prognosi e la fisiopatologia delle malattie umane specifiche quali l'HIV/AIDS e favorendo la ricerca di una cura. Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato per la generazione di un modello di topo umanizzato NSG (hu-NSG) da trapianto di cellule staminali ematopoietiche in un mouse NSG neonatale e radiazione-condizionati. Il modello di mouse hu-NSG illustra lo sviluppo multi-stirpe di cellule staminali umane trapiantate e suscettibilità all'infezione virale di HIV-1. Esso riassume anche chiave caratteristiche biologiche in risposta alla terapia antiretrovirale combinatoria (cART).

Analisi di citometria a flusso è effettuato frequentemente per convalidare la purezza di HSCs isolato, valutare i livelli di attecchimento, profilo risposta immunitaria all'infezione virale ed efficacia di carrello di indagine. Un pannello di anticorpi tipico contiene anticorpi fluorescente contrassegnati individuali di 4-6; così, un citometro a flusso con più laser e una vasta selezione di filtri è cruciale per il raggiungimento di risultati accurati.
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Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Questo protocollo fornisce un metodo per stabilire topi umanizzati (hu-NSG) tramite iniezione intraepatica di cellule staminali ematopoietiche umane nella radiazione-condizionato topi NSG neonatali. Il mouse di hu-NSG è suscettibile di infezione da HIV e combinatorio antiretrovirale di combinazione (cART) e serve come un modello fisiopatologico adatto per le indagini di replica e la latenza di HIV.

Umanizzato NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse modello per studi di latenza e di replicazione dell'HIV

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Queste questioni possono aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sull'HIV/AIDS, come il meccanismo molecolare e la prognosi dell'infezione da HIV, e come e dove viene stabilito il serbatoio di latenza. Il vantaggio di questa tecnica è che non è invasiva e ha stabilito un topo hu-NSG che deve trattare uno sviluppo multi-lignaggio rispetto alle cellule staminali umane trapiantate che sono suscettibili all'infezione da HIV e sono ricettive al cART. Inizia filtrando un campione di tessuto digerito, umano, fetale, epatico, liquame attraverso uno sterile, 70 micrometri, nylon, filtro mesh per ottenere una sospensione a singola cella e arricchisci per CD34 + HSC mediante smistamento magnetico attivato delle celle secondo le istruzioni del produttore.Dopo il conteggio, sospendere di nuovo l'HSC a una concentrazione di DPBS fresca su ghiaccio due volte dieci-al-settima cellule vitali per millilitro. Quindi posizionare un'intera lettiera di topo NOD/SCID/gamma o NSG umana neonatale in una gabbia di irradiazione sterile, a forma di torta, e trattare gli animali con da 200 a 250 gradi centigradi di raggi gamma da una sorgente di radiazione di cesio-137. Quindi caricare le cellule in una siringa Hamilton 80508 da 50 microlitri su misura dotata di un ago calibro 30 e iniettare ogni animale neonatale direttamente nel fegato con CD34+HSC umano cinque volte dieci-al-quinto praticabile e 25 microlitri di DPBS.Da dieci a dodici settimane dopo l'infezione, spin-down retro-orbitale, periferico, campioni di sangue da ogni topo per centrifugazione, e trasferire i supernate plasmatiche in tubi di microcentrifugo per una conservazione negativa di 80 gradi Celsius come sperimentalmente appropriato. Per la convalida dell'innesto HSC, sospendere di nuovo i pellet con 200 microlitri di tampone di lisi dei globuli rossi e estrarre le sospensioni cellulari in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millimetri per un'incubazione di dieci minuti a temperatura ambiente. Quindi raccogliere i restanti globuli bianchi per centrifugazione per due lavaggi in 0,5 millilitri di albumina di siero bovino fresca dello 0,01%, o BSA, in DPBS per lavaggio.Dopo il secondo lavaggio, bloccare le cellule con 100 microlitri di cocktail bloccante per venti minuti a 4 gradi Celsius seguiti dall'etichettatura con l'appropriato cocktail anti-corpo di interesse a 2 microlitri di anti-corpo per concentrazione di cellule uno-per-uno-al-sesto. Dopo 30 minuti a 4 gradi Celsius, lavare le cellule due volte in DPBS più BSA fresco e valutare i campioni di sangue periferici per citometria a flusso secondo protocolli standard per quantificare la percentuale di cellule CD45+CD3+CD14+ o CD19+ umane per campione. Quindi calcolare il rapporto tra cellule CD4+ e CD8+T e valutare la carica virale con nei campioni di plasma secondo protocolli PCR standard, quantitativi, inversi.Per valutare gli effetti dell'infezione da HIV, fornire il virus della balla HIV a topi anestetizzati, umani, NSG con una popolazione di CD45+ cellulare umana superiore al 20% nel sangue periferico, a 200 nanogrammi di P24 per concentrazione di topo tramite somministrazione intraperitoneale, raccogliendo campioni di sangue tramite sanguinamento retro-orbitale ogni due settimane e analizzare sia il rapporto CD4-CD8 che la carica virale plasmatica , come dimostrato. Per la convalida della soppressione virale fornire agli animali NSG infetti e umani una terapia fresca, combinatoria, antiretrovirale, o cART, in acqua zuccherata ogni settimana per 4 settimane, raccogliendo campioni di sangue tramite sanguinamento retro-orbitale ogni due settimane e analizzando sia il rapporto CD4-CD8 che la carica virale al plasma come dimostrato. Per valutare il rimbalzo virale quando i carichi virali del plasma sono al di sotto del limite di rilevamento e il rapporto CD4-CD8 viene ripristinato tra 1,5 e 2,5 raccogliere campioni di sangue periferici attraverso sanguinamento retro-orbitale ogni 2 settimane dopo il prelievo cART e valutare i campioni come dimostrato.Durante la convalida iniziale dell'innesto, il numero umano di cellule CD45+ dovrebbe variare dal 20 all'80%, e i sottoinsiemi di leucociti umani dovrebbero apparire come popolazioni discrete dall'analisi citometrica del flusso. Il rapporto tra CD4+e CD8+cellule rimane compreso tra 1,5 e 2,5 in individui sani, mentre l'esaurimento significativo delle cellule CD4+T è tipicamente osservato quando si osserva un'infezione virale. In particolare, il rapporto sano viene ripristinato in risposta al trattamento cART.Il rilevamento di carichi virali plasmatica da parte della RT PCR quantitativa durante tutto il corso dell'infezione e del regime cART può essere tracciato e utilizzato per valutare l'efficienza della consegna virale e del trattamento antivirali, rispettivamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli studi di virologia dell'HIV / AIDS e sullo sviluppo terapeutico, può anche essere applicato ad altri studi relativi alle malattie umane, come il cancro, il diabete e le malattie autoimmuni. Lo sviluppo del modello di topo hu-NSG ha spianato la strada ai ricercatori in immunologia e oncologia per esplorare una nuova disfunzione e patologia nell'uomo, in particolare studi meccanici e terapeutici mirati all'infezione cronica da HIV e al serbatoio di latenza.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Uso del mouse BLT umanizzato come cellule staminali basata su un Modello Tumore Terapia Genica

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

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Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...