Name: humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOD/SCID/IL2rÃŽÂ³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies at JoVE.com

この作業は、[R01AI29329、R01AI42552、R01HL07470 の数字を J.J.R. に付与] 健康の国民の協会および健康の国民の協会 [許可番号希望統合的ゲノミクスの都市をサポートする P30CA033572 国立がん研究所によって支えられました。、薬効解析と解析的フローサイトメトリー コア]。次の試薬は、NIH のエイズ研究と参照試薬プログラム、エイズ部門 NIAID、nih の研究を通じて得られた: HIV バル ウイルス。

すべての動物の世話と手順は、プロトコル レビューおよび承認によって、都市の希望施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) が保有する (博士ジョン ・ ロッシ、IACUC #12034) 本研究の主任研究員によると行われています。ひと胎児肝組織は非営利組織、連邦および州の規則に従って高度な生命科学リソース (アラメダ、カリフォルニア州) から得られました。ベンダー独自制度審査委員会 (IRB) が?...

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	<li>Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCID+mouse+models+of+human+stem+cell+engraftment.">SCID mouse models of human stem cell engraftment.</a> Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model.">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature. 32 (4), 364-372 (2014).</li><li>Walsh, N. 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免疫不全マウスと人間の細胞や組織にしみ込んで人間のような生理学的な特性を提示で、人間特有の病に関する病理、病態生理、免疫学の研究の非常に大きな値です。免疫不全マウス、NOD の複数系統。Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) モデルは蒸散マウス固有サイトカイン シグナル3,12,19 と同様に、自然免疫と?...

人間の病気のための適切な動物モデルを確立する治療法を見つけるための鍵は、適切な動物モデル長い追求して時間をかけて改善します。人間の細胞や組織の生着とヒト化機能1,2の以降の実行を可能にする免疫不全モデルマウスの複数系統が開発されています。このようなヒト化マウス モデルはヒト特有の疾患3,4、5の調査のために重要です。
ひと免疫不全ウイルス (HIV) 感染症から生じる後天性免疫不全症候群 (エイズ) は、一例です。ヒト化マウスモデルの確立の前に倫理的、技術的な制限はヒト以外の霊長類3HIV/エイズ前臨床動物実験を限られています。しかし、高い費用とその動物について専門的ケアのための要件は、典型的な学術の設定で HIV/エイズ研究を妨げます。HIV は主に人間 cd 4 + T 細胞に感染して、開発と B 細胞、マクロファージ、樹状細胞6など他の人間の免疫細胞の免疫応答に影響を与えるしたがって、ひと免疫系機能を移植した小さな動物モデルは需要が高いです。
画期的なときPrkdcscid変異を有する CB17-scidマウスを開発され、人間の免疫システム1の成功の生着を示した、1988 年に来た。ひと末梢の生着が可能となる血単核球 (PBMCs)、造血幹細胞 (造血) の不良 T および B 細胞の機能にPrkdcscid突然変異の結果、マウスの蒸散の適応免疫系と胎児の造血組織7,8。それにもかかわらず、生着の低レベルは、このモデルで観察される頻繁原因が考えられます 1) 残留の生得免疫活性をモジュレート ナチュラル キラー (NK)-細胞とマウス T および B 細胞の (水漏れしたため)5の 2)、後期開発。非肥満の糖尿病 (NOD) の後続の開発-scidマウス モデルは NK 細胞活動の劇的なダウンを安定化を実現したがってより高いレベルと人間の免疫システムのコンポーネント9持続可能な生着以上をサポートすることです。さらを抑制したり、ベアリングの切り捨てや、インターロイキン 2 受容体 γ 鎖 (Il2rg) の総ノックアウト (NOD) マウス モデル自然免疫の開発を妨げる -scidのバック グラウンドが確立されました。Il2rg、として知られている一般的なサイトカイン受容体 γ 鎖は様々 なサイトカイン受容体10、11,12,13の不可欠なコンポーネントです。うなずくなどの系統。Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) と NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) マウス サイトカイン シグナルの堅牢な中断と NK 細胞の発達のアブレーションを完了適応免疫14,15,16の重度の機能障害を追加。
突然変異と Il2rg ノックアウトscidをベアリング 3 つのヒト化マウス モデルが頻繁に HIV/エイズの研究に採用: BLT (骨髄、肝臓、胸腺) モデル、PBL (末梢血白血球) モデル、および SRC (SCID 再セル) モデル3. 外科的移植ひと胎児肝と胎児肝臓造血3,17,18の静脈内注射に伴うマウスの腎被膜下胸腺を経由、BLT のモデルが作成されます。BLT マウス モデルを提供しています高い生着効果、すべての系統のひと造血細胞の開発と強い人間免疫システムの確立さらに、T 細胞はひと自家胸腺で教育されて、HLA 拘束による免疫応答4,5,17,19を展示します。ただし、外科的処置のための要件は、BLT モデルの主な欠点を残ります。PBL マウス モデルは、ひと末梢リンパ球細胞と静脈注射によって確立されます。そのアプリケーションが不十分な B 細胞と骨髄細胞、生着低レベルの全体的なと厳しい移植-対宿主病 (GVHD)3 の発症のため限定 PBL モデルを提供しています、正常の T 細胞生着が得られます ,20。SRC マウス モデルは、新生児や若い大人の SCID マウスに人間の HSCs の注入によって確立されます。それは (末梢血 CD45 割合として評価) 25% 以上平均生着効率を展示し、注入 HSCs の複数系統の開発と生来の人間の免疫システムの精緻化をサポートします。ただし、SRC モデルの制限は、人間 HLA 拘束14,21の代わりに H2 制限 T 細胞応答はマウスのことです。
SRC マウス モデルは、臨床の HIV/エイズ小動物研究、人間の免疫システムの開発に成功し造血一貫性のある移植に代表される安易な信頼性の高いモデルと見なされます。我々 は以前 NSG (胡 NSG) 胡-SRC-SCID マウス モデルの確立を報告し、HIV の複製および遅延研究22,23,24での応用を説明しました。この胡 NSG マウス モデルは、骨髄ホーミング、HIV 感染に感受性の高いレベルと HIV 感染と病原性の反復を発揮します。さらに、胡 NSG マウス モデルの組合せ抗レトロ ウイルス療法 (カート) に適切に応答して、HIV 待ち時間貯水池25,26 の確立を確認するカート撤退時にプラズマ ウイルス リバウンドを繰り返す ,27。この HIV 待ち時間貯水池さらに休んで cd 4 + T 細胞の感染とカート処理胡 NSG マウスから分離した人間によるレプリケーション有能な HIV ウイルスex vivoの生産によって実証されます。
ここで、HIV 感染症とカートの治療遅延開発に関連する手順を含む新生児の NSG マウスから胡 NSG マウスモデルの確立のための詳しいプロトコルについて述べる。HIV HIV ウイルス、遅延、および治療に関する動物実験でのアプローチの新しいセットを提供するこのプロトコルを見込んでいます。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td>MiltenyiBiotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Order breeders instead of experimental mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-806-3204</td>
			<td>Order through animal facility, restricted item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clidox disinfectant</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>NC9189926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wescodyne</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>19-818-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80508 syringe/needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80508</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (K2EDTA)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>367843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (Heparin)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube (Heparinized)</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>22-362574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4444434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from mouse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5381-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564586</td>
			<td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557851</td>
			<td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558116</td>
			<td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563795</td>
			<td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1427</td>
			<td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1904</td>
			<td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies

倫理規程、人体病理学、免疫学および治療開発の研究のための技術的な課題は、需要が高い小動物モデルを配置しています。遺伝学的および行動に似ている人間、マウスなどの小動物が適しているヒト疾患モデル、人間のような症状や反応を要約することができます。さらに、マウスの遺伝的背景は多様化するニーズに合わせて変更できます。NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) マウスの最も広く使われている免疫不全マウス系統の 1 つです。ひと造血幹細胞や生体機能の人間の免疫システムの後続の開発と生着をことができます。これは予後と HIV/エイズなどヒト特有の疾患の病態の理解と治療のための検索を支援の重要なマイルス トーンです。症例は放射線エアコン新生児 NSG マウスに造血幹細胞移植によるヒトの NSG マウス モデル (胡 NSG) を生成するための詳細なプロトコルです。胡 NSG マウス モデルは、移植されたひと幹細胞の hiv-1 ウイルス感染に対する感受性多系統の開発を示しています。また、組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に応答キーの生物学的特性を繰り返します。

フローサイトメトリー解析はよく分離 HSCs の純度を検証、生着レベル、ウイルス感染に対する免疫応答をプロファイルを評価およびカートの有効性を調査する実行されます。典型的な抗体パネルを含む 4 6 個々 の蛍光に分類された抗体;したがって、複数レーザーと豊富なフィルターを持つ流れの cytometer は正確な結果を達成するために不可欠です。
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Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

このプロトコルは、ひと造血幹細胞の放射線-調節された新生児 NSG マウス注入肝を介してヒト化マウス (胡 NSG) を確立するためのメソッドを提供します。胡 NSG マウス HIV 感染および組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に敏感であるし、HIV のレプリケーションおよび待ち時間の調査のための適切な病態生理学的モデルとして提供しています。

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

これらの問題は、HIV感染の分子メカニズムと予後、遅延リザーバが確立される方法と場所など、HIV/AIDS研究の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、非侵襲的であり、HIV感染の影響を受けやすく、cARTを受容する移植されたヒト幹細胞に対する多系統開発を治療しなければならないhu-NSGマウスを確立した点である。消化されたヒト、胎児、肝臓組織、無菌、70マイクロメートル、ナイロン、メッシュストレーナーを介してスラリーサンプルを濾過し、単一細胞懸濁液を得、メーカーの指示に従って磁気活性化細胞のソートによってCD34 +HSCを濃縮します。カウント後、氷上の新鮮なDPBS中のミリリットル濃度あたり20〜7番目の生存細胞でHSCを再中断する。次に、新生児のヒトNOD/SCID/γまたはNSGマウスのごみ全体を無菌のパイ型の照射ケージに入れ、セシウム137放射線源からのガンマ線の200〜250センチメートルで動物を治療します。その後、30ゲージの針を備えたカスタムメイドのハミルトン80508 50マイクロリットルシリンジに細胞をロードし、各新生児動物を5回の10〜5番目の実行可能なヒトCD34+HSCと25マイクロリットルのDPBSで肝臓に直接注入します。感染後10~12週間、遠心分離により各マウスからのレトロ軌道、末梢、血液サンプルをスピンダウンし、プラズマをマイクロ遠心チューブに移して、実験的に適宜80°Cの陰性の貯蔵を行う。HSC生着検証のために、200マイクロリットルの赤血球溶菌バッファーでペレットを再懸濁し、1.5ミリメートルマイクロ遠心分離チューブで細胞懸濁液を室温で10分間のインキュベーションに引き出します。次に、新鮮な0.5ミリリットルの2回の洗浄、0.01%のウシ血清アルブミン、またはBSAの2回の洗浄のための遠心分離によって残りの白血球をDPBSで集める。2回目の洗浄後、摂氏4度で20分間100マイクロリットルのブロッキングカクテルで細胞をブロックし、その後、1回1〜6番目の細胞濃度あたり2マイクロリットルの抗ボディで適切な抗ボディカクテルで標識します。摂氏4度で30分後、新鮮なDPBSとBSAで細胞を2回洗浄し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーで末梢血液サンプルを評価し、サンプルあたりヒトCD45+CD3+CD14+またはCD19+細胞の割合を定量化します。次に、CD4+対CD8+T細胞の比率を計算し、標準、定量、逆転写酵素、PCRプロトコルに従って、血漿サンプル中のウイルス負荷を評価します。HIV感染の影響を評価するには、周囲の血液中のヒトCD45+細胞集団が20%を超える麻酔薬、ヒト、NSGマウスにHIVベールウイルスを送達し、腹腔内投与を介してマウス1回当たり20ナノグラムのP24で、2週間ごとにレトロ眼窩出血を介して血液サンプルを採取し、CD4-CD8比とウイルス負荷の両方を分析するを示すとおり。ウイルス抑制検証のために、感染したヒトのNSG動物に新鮮な、組み合わせ、抗レトロウイルス療法、またはcARTを、毎週4週間甘味水で供給し、2週間ごとにレトロ眼窩出血を介して血液サンプルを採取し、実証したようにCD4対CD8比と血漿ウイルス負荷の両方を分析する。血漿ウイルス負荷が検出限界を下回り、CD4-CD8比が1.5〜2.5の間に回復したときにウイルスリバウンドをアセスするには、cART離脱後2週間ごとにレトロ眼窩出血を通じて末梢血液サンプルを収集し、実証したようにサンプルを評価する。最初の生着検査の間、ヒトCD45+細胞数は20〜80%の範囲で、ヒト白血球のサブセットはフローサイトメトリック分析によって離散集団として現れるべきである。CD4+対CD8+細胞の比率は健康な個体では1.5~2.5の間に残り、ウイルス感染時には顕著なCD4+T細胞の枯渇が典型的に観察される。特に、cART治療に応答して健全な比率が回復する。感染の過程を通じて定量的なRT PCRによる血漿ウイルス負荷の検出とcARTレジメンをプロットし、それぞれウイルス送達および抗ウイルス治療の効率を評価するために使用することができる。この方法は、HIV/AIDSウイルス学研究や治療開発に関する洞察を提供することができますが、がん、糖尿病、自己免疫疾患などのヒト疾患に関連する他の研究にも適用できます。hu-NSGマウスモデルの開発は、免疫学および腫瘍学の研究者がヒトの新しい機能不全および病理、特にHIV慢性感染および待ち時間貯蔵所を標的とした機械学的および治療研究を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...