Name: humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOD/SCID/IL2rÃŽÂ³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [conceder números R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 para J.J.R.] e Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde [número de concessão P30CA033572 para apoiar a cidade de Hope Integrative Genomics Farmacologia analítica e núcleos de análise Cytometry]. O reagente a seguir foi obtido através de NIH AIDS Programa de pesquisa e referência reagente, divisão de AIDS, NIAID, NIH: vírus HIV BaL.

Todos os cuidados com animais e os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos revisto e aprovado pela cidade de esperança Animal cuidados institucionais e Comissão de utilização (IACUC) realizada pelo investigador principal deste estudo (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tecido do fígado fetal humano foi obtido de avançados recursos de Biociências (Alameda, CA), uma organização sem fins lucrativos, em conformidade com as regulamentações federais e estaduais. O fornecedor tem o seu próprio institucio...

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Ratos imunodeprimidos incorporados com células/tecidos humanos apresentam características fisiológicas de humanos e são um enorme valor para estudos de patologia, fisiopatologia e Imunologia sobre doenças específicas de humanos. Entre várias cepas de ratos imunodeprimidos, o assentimento. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelo é o mais imunodeficientes devido à sua falta de imunidade inata e adaptativa, bem como retirada do mouse específicas citocinas sinalização<sup class="xref...

Porque estabelecer modelos animais apropriados para doenças humanas é a chave para encontrar uma cura, modelos animais apropriados tempo foram perseguidos e melhorados ao longo do tempo. Foram desenvolvidas múltiplas variedades de imunocomprometidos murino modelos que permitem a enxertia de células humanas e/ou tecidos e a subsequente execução de funções humanizada1,2. Tais modelos de rato humanizado são críticos para investigações de doenças de humanos específicos3,4,5.
Adquirida síndrome da imunodeficiência (AIDS) resultantes de infecção com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) é um exemplo. Antes da criação de modelos de rato humanizado, limitações éticas e técnicas limita-se a estudos animais pré-clínicos de HIV/AIDS para primatas não-humanos3. No entanto, as despesas elevadas e requisitos para tratamento especializado para tal animal dificultam estudos de HIV/AIDS em configurações acadêmicos típicos. HIV, principalmente, infecta células humanas CD4 + T e impacto sobre o desenvolvimento e respostas imunes de outras células imunes humanas tais como as células B, macrófagos e células dendríticas6; Portanto, pequenos modelos animais transplantados com sistema de imunológico humano funcional estão em alta demanda.
Um grande avanço veio em 1988, quando os ratos CB17 -scid com uma mutação Prkdcscid foram desenvolvidos e mostrou a enxertia bem sucedida do sistema imunológico humano1. Os resultados de mutação Prkdcscid em funções de células T e B defeituosa e um ablated sistema imune adaptativo em camundongos, possibilitando a enxertia de periférico humano sangue células mononucleares (PBMC), células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), e os tecidos hematopoiéticos fetais7,8. No entanto, níveis baixos de enxertia frequentemente são observados neste modelo; causas possíveis são 1) residual atividade imune inata modulada através de assassinas naturais (NK)-células e 2) o desenvolvimento de estágio final de rato - e B-células T (leakiness)5. O desenvolvimento posterior do diabético não-obesos (ASSENTIMENTO)-modelo de ratoscid alcançado dramática para baixo-regulação da atividade de células NK; assim, é capaz de suportar um nível mais alto e mais sustentável enxertia de de componentes do sistema imunológico humano9. Ainda mais inibem ou impedem o desenvolvimento da imunidade inata, modelos de rato tendo truncamento ou nocaute total da interleucina-2 receptor γ-cadeia (Il2rg) no (ASSENTIMENTO) - fundoscid foram estabelecidas. Il2rg, também conhecido como comum do cytokine receptor γ-cadeia, é um componente indispensável de várias citocinas receptores10,11,12,13. Cepas como NOD. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) apresentam interrupção robusta de rato citocinas sinalização e ablação completa do desenvolvimento de células NK, em Além de grave comprometimento da imunidade adaptativa14,15,16.
Três modelos de rato humanizado, tendo um scid , mutação e nocaute Il2rg são frequentemente empregados na pesquisa de HIV/AIDS: o modelo BLT (medula óssea/fígado/Timo), o modelo PBL (leucócitos de sangue periférico) e o modelo SRC (SCID repovoamento celular) 3. o BLT modelo é criado através de cirurgia transplante de fígado fetal humano e Timo sob a cápsula do rim de rato acompanhado com injeção intravenosa de linfócitos feto fígado3,17,18. O modelo do rato de BLT oferece eficácia de enxertia alta, desenvolvimento de células hematopoiéticas humanas em todas as linhagens e o estabelecimento de um forte sistema imunológico humano; Além disso, as células T são educadas em um timo humano autólogo e prova HLA-restrito imune respostas4,5,17,19. No entanto, a exigência de procedimentos cirúrgicos continua a ser a grande desvantagem do modelo BLT. O modelo do rato do PBL é estabelecido pela injeção intravenosa com células linfoides periféricas humanas. O modelo PBL oferece conveniência e rende bem sucedida enxertia de células T, mas sua aplicação é limitada devido à insuficiente da B-pilha e enxertia de células mieloides, níveis baixos de enxertia globais e o aparecimento de grave enxerto doença contra o hospedeiro (GVHD)3 ,20. O modelo do rato do SRC é estabelecido através de injeção de linfócitos humanos em ratos adultos jovens ou recém-nascidos do SCID. Ele exibe a eficiência da enxertia média acima de 25% (avaliada como sangue periférico CD45 porcentagem) e suporta o desenvolvimento de múltiplos-linhagem de linfócitos injetados e a elaboração de um sistema imune humano inato. No entanto, a limitação do modelo SRC é que a resposta de células T é mouse H2-restrito em vez de humano HLA-restrito14,21.
O modelo do rato do SRC é considerado um modelo fácil e confiável para HIV/AIDS pequenos animais estudos pré-clínicos, exemplificado pela enxertia consistente de um sistema imunológico humano e desenvolvimento bem sucedido hematopoiético. Nós anteriormente relatado o estabelecimento de um modelo de mouse NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descreveu a sua aplicação na replicação do HIV e latência estudos22,23,24. Este modelo de rato hu-NSG apresenta níveis elevados de hospedagens de medula óssea, susceptibilidade à infecção pelo HIV e recapitulação da infecção pelo HIV e patogênese. Além disso, o modelo do rato do hu-NSG responde adequadamente à terapia antiretroviral combinatória (carrinho) e recapitula rebote viral do plasma após retirada do carrinho, confirmando o estabelecimento de um HIV latência reservatório25,26 ,,27. Este reservatório de latência do HIV é secundado pela produção da replicação vírus HIV ex vivo induzida por humanos células CD4 + T-isoladas de ratos infectados e tratados com carrinho hu-NSG a descansar.
Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para a criação do modelo do mouse hu-NSG de ratos NSG neonatais, incluindo os procedimentos relacionados ao tratamento de infecção e carrinho de HIV para desenvolvimento de latência. Esperamos que este protocolo para oferecer um novo conjunto de abordagens em estudos com animais HIV sobre virologia de HIV, latência e tratamento.

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			<td>CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td>MiltenyiBiotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Order breeders instead of experimental mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-806-3204</td>
			<td>Order through animal facility, restricted item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clidox disinfectant</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>NC9189926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wescodyne</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>19-818-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80508 syringe/needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80508</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (K2EDTA)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>367843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (Heparin)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube (Heparinized)</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>22-362574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4444434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from mouse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5381-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564586</td>
			<td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557851</td>
			<td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558116</td>
			<td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563795</td>
			<td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1427</td>
			<td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1904</td>
			<td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies

Normas éticas e desafios técnicos para a pesquisa em patologia humana, imunologia e desenvolvimento terapêutico colocaram modelos animais pequenos em alta demanda. Com uma estreita semelhança genética e comportamental aos seres humanos, animais pequenos, tais como o rato são bons candidatos para modelos de doenças humanas, através do qual podem ser instauradas respostas e sintomas parecidos com os humanos. Além disso, o fundo genético de rato pode ser alterado para acomodar demandas diversas. O NOD/SCID/IL2rγnula (NSG) é uma das variedades mais amplamente utilizado de rato imunocomprometidos; permite enxertia com células-tronco hematopoiéticas humanas e/ou tecidos humanos e o desenvolvimento posterior do sistema imunológico humano funcional. Este é um marco fundamental na compreensão do prognóstico e fisiopatologia das doenças de humanos específicos tais como HIV/AIDS e auxiliando a busca de uma cura. Neste documento, nós relatamos um protocolo detalhado para a geração de um modelo de mouse NSG humanizado (hu-NSG) pelo transplante de células-tronco hematopoiéticas para um rato NSG neonatal condicionada por radiação. O modelo do rato do hu-NSG mostra desenvolvimento multi linhagem de células-tronco humanas transplantadas e susceptibilidade à infecção viral do HIV-1. Ele também recapitula a principais características biológicas, em resposta à terapia anti-retroviral combinatória (carrinho).

Análise de citometria de fluxo é frequentemente realizado para validar a pureza de linfócitos isolados, avaliar níveis de enxertia, perfil respostas imunes à infecção viral, vistoria e eficácia do carrinho. Um painel de anticorpos típica contém anticorpos fluorescente etiquetados individuais de 4-6; assim, um citômetro de fluxo com vários lasers e uma ampla seleção de filtros é crucial para alcançar resultados precisos.
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Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Essas questões podem ajudar a responder a questões-chave na pesquisa sobre HIV/AIDS, como o mecanismo molecular e o prognóstico da infecção pelo HIV, e como e onde o reservatório de latência é estabelecido. A vantagem dessa técnica é que ela não é invasiva, e estabeleceu um camundongo hu-NSG que deve tratar um desenvolvimento de várias linhagens sobre células-tronco humanas transplantadas que são suscetíveis à infecção pelo HIV e são receptivos ao cART. Comece filtrando uma amostra digerida, humana, fetal, hepática, pasta através de uma amostra estéril, de 70 micrômetros, nylon, coador de malha para obter uma única suspensão celular, e enriqueça para CD34+HSCs por classificação celular ativada magnética de acordo com as instruções do fabricante.Após a contagem, suspenda o HSC em duas vezes dez a sete células viáveis por concentração mililitro em DPBS frescos no gelo. Em seguida, coloque um ninhado de rato humano neonatal inteiro NOD/SCID/gama ou NSG em uma gaiola de irradiação estéril, em forma de torta, e trate os animais com 200 a 250 centígrados de raios gama de uma fonte de radiação césio-137. Em seguida, carregue as células em uma seringa padrão, Hamilton 80508 50-microliter equipada com uma agulha de calibre 30, e injete cada animal neonatal diretamente no fígado com CD34+HSCs humanos viáveis cinco vezes ao quinto e 25 microliters de DPBS.Dez a doze semanas após a infecção, gire amostras de sangue retro-orbitais, periféricas e de sangue de cada rato por centrifugação, e transfira os superatas plasmádicos para tubos de microcentrifuuge para armazenamento negativo de 80 graus Celsius como experimentalmente apropriado. Para validação do enxerto de HSC, suspenda as pelotas com 200 microliters de tampão de lise de glóbulos vermelhos e puxe as suspensões celulares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros para uma incubação de dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, colete os glóbulos brancos restantes por centrifugação para duas lavagens em 0,5 mililitros de albumina de soro bovino fresco, 0,01%, ou BSA, em DPBS por lavagem.Após a segunda lavagem, bloqueie as células com 100 microliters de coquetel de bloqueio por vinte minutos a 4 graus Celsius seguido de rotulagem com o coquetel anti-corpo apropriado de interesse em 2 microliters de anti-corpo por uma vez uma-a-sexta células de concentração. Após 30 minutos a 4 graus Celsius, lave as células duas vezes em DPBS fresco mais BSA, e avalie as amostras de sangue periféricos por citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão para quantificar a porcentagem de células humanas CD45+CD3+CD14+ou CD19+por amostra. Em seguida, calcule a razão das células CD4+to-CD8+T, e avalie a carga viral com nas amostras de plasma de acordo com os protocolos padrão, quantitativo, reverso, PCR.Para avaliar os efeitos da infecção pelo HIV, entregue o vírus do fardo do HIV a camundongos anestesizados, humanos, NSG com uma população maior de 20% de cd45+células humanas em seu sangue periférico, a uma proporção de 200 nanogramas de P24 por concentração de camundongos através da administração intraperitoneal, coletando amostras de sangue através de sangramento retro-orbital a cada duas semanas, e analise tanto a razão CD4-CD8 quanto a carga viral plassmática , como demonstrado. Para a validação de supressão viral fornecer os animais NSG infectados e humanos com terapia fresca, combinatória, antirretroviral, ou cART, em água adoçada toda semana durante 4 semanas, coletando amostras de sangue através de sangramento retro-orbital a cada duas semanas e analisar tanto a razão CD4-CD8 quanto a carga viral plasmática como demonstrado. Para avaliar o rebote viral quando as cargas virais de plasma estão abaixo do limite de detecção e a razão CD4-CD8 é restaurada entre 1,5 e 2,5 coletar amostras de sangue periférico através de sangramento retro-orbital a cada 2 semanas após a retirada do CART e avaliar as amostras como demonstrado.Durante a validação inicial do enxerto, a contagem humana de células CD45+deve variar de 20 a 80%, e os subconjuntos de leucócitos humanos devem aparecer como populações discretas por análise citométrica de fluxo. A razão entre células CD4+to-CD8+permanece entre 1,5 e 2,5 em indivíduos saudáveis, enquanto o esgotamento significativo das células CD4+T é tipicamente observado sobre a infecção viral. Notavelmente, a razão saudável é restaurada em resposta ao tratamento cART.A detecção de cargas virais plasmáticas por RT PCR quantitativo ao longo da infecção e do regime cARTn pode ser plotada e utilizada para avaliar a eficiência do parto viral e do tratamento antiviral, respectivamente. Embora este método possa fornecer insights sobre estudos de virologia do HIV/AIDS e desenvolvimento terapêutico, ele também pode ser aplicado a outros estudos relacionados a doenças humanas, como câncer, diabetes e doenças autoimunes. O desenvolvimento do modelo de camundongos hu-NSG abriu caminho para pesquisadores em imunologia e oncologia explorarem uma nova disfunção e patologia em humanos, particularmente estudos mecanicistas e terapêuticos voltados para a infecção crônica do HIV e o reservatório de latência.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Estudos do Vírus Influenza A em um Modelo de Infecção de Camundongos

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...